Extracto
Antecedentes
Hemos demostrado anteriormente que la acumulación nuclear y citoplasmática del dominio intracelular (Ep ICD) de la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) acompañada de una reducción recíproca de su dominio extracelular (EPEX), se produce en los cánceres de tiroides agresivos. Este estudio fue diseñado para determinar si la acumulación similar de Ep-ICD es un evento común en otros cánceres epiteliales.
Metodología y Resultados
Diez cánceres epiteliales se analizaron por inmunohistoquímica utilizando Ep-ICD y el dominio EPEX anticuerpos específicos. Se observó la localización subcelular de EPEX y EP-ICD en la línea celular de adenocarcinoma de colon humano CX-1 mediante inmunofluorescencia. expresión de Ep-ICD nuclear y citoplasmática se incrementó en los cánceres de mama (31 de 38 tejidos, 82%), próstata (40 de 49 tejidos, 82%), la cabeza y el cuello (37 de 57 tejidos, 65%) y el esófago ( 17 de 46 tejidos, 37%) en comparación con sus tejidos normales correspondientes que mostraron localización en la membrana de la proteína. Es importante destacar que, Ep-ICD no se detectó en los núcleos de células epiteliales en la mayoría de los tejidos normales. Alta nuclear y la acumulación Ep-ICD citoplásmica también ocurrieron en los otros seis tipos de cáncer epitelial analizados - pulmón, colon, hígado, vejiga, páncreas y ovario. Se observó una reducción concomitante de la membrana de expresión EPEX en un subconjunto de todos los tipos de cáncer. Utilizando un análisis de curva característica reveló cánceres de mama nucleares distinguida Ep-ICD con una sensibilidad del 82% y el 100% de especificidad y de próstata con una sensibilidad del 82% y 78% de especificidad. Se observaron resultados similares para la acumulación citoplasmática de Ep-ICD en estos tipos de cáncer. Proporcionamos evidencia clínica de aumento de la acumulación nuclear y citoplasmática Ep-ICD y una reducción en membranosa EPEX en estos tipos de cáncer.
Conclusiones
El aumento nuclear y citoplasmática Ep-ICD se observó en todos los cánceres epiteliales analizados y distinguirlos entre los tejidos normales con alta sensibilidad, especificidad, y el ABC. Desarrollo de un ensayo de alto rendimiento robusto para Ep-CIE facilitará la determinación de su importancia diagnóstica, pronóstica y terapéutica en los cánceres epiteliales
Visto:. Ralhan R, El HC-H, de manera AK-C, SC Tripathi , Kumar M, Hasan MR, et al. (2010) nucleares y citoplasmáticas La acumulación de Ep-ICD se detecta con frecuencia en los cánceres epiteliales humanas. PLoS ONE 5 (11): e14130. doi: 10.1371 /journal.pone.0014130
Editor: Marc Vooijs, Centro Médico Universitario de Maastricht, Países Bajos
Recibido: 20 Junio, 2010; Aceptado: 24 Octubre 2010; Publicado: noviembre 30, 2010
Derechos de Autor © 2010 Ralhan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Monte Sinaí de Toronto, Da Vinci Gala para recaudar fondos, Alex y Simona Presidente Shnaider en cáncer de tiroides, el Monte Sinaí Departamento de Fondo de Investigación de Medicina, Alex y Laboratorio Shnaider Simona en Oncología Molecular del hospital, y Temmy Latner Family Foundation Dynacare. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
célula epitelial molécula de adhesión (EpCAM) es una glicoproteína de 40 kDa transmembrana que sirve un papel importante en la adhesión celular, la proliferación celular, la diferenciación, la migración, la regulación del ciclo celular y está implicada en el cáncer y el vástago de señalización celular [1]. EpCAM es una de las proteínas más ampliamente investigados en los cánceres humanos, frecuentemente sobreexpresados en tumores malignos humanos, localizada en la membrana plasmática de las células tumorales y aunque a niveles más bajos en el epitelio normal [2], [3], [4], [5 ], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Todos estos estudios anticuerpos dirigidos contra el dominio extracelular del EpCAM (EPEX) utilizados [13]. Estos numerosos informes sobre la superficie celular expresión de EpCAM en los cánceres humanos han sugerido que podría ser un candidato ideal para la aplicación como un marcador de cáncer epitelial y una diana terapéutica [18], [19], [20], [21]. Paradójicamente, la mayoría de los ensayos clínicos que usan anticuerpos monoclonales murinos a saber, edrecolomab en el cáncer colorrectal, o el anticuerpo humanizado, adecatumumab, en cáncer de mama han demostrado una eficacia limitada [14], [22]. La comprensión de estas limitaciones plantea un desafío para los oncólogos y es de gran importancia para el desarrollo futuro de las estrategias más efectivas anti-EpCAM. En este contexto, Gires y Baeuerle [23] discuten la necesidad de medir los niveles de expresión EpCAM en células tumorales y su impacto sobre los resultados de un ensayo clínico. Sin embargo, ninguno de los ensayos anteriores han analizado la expresión de EpCAM en los tejidos tumorales, de forma prospectiva o retrospectiva. Ya sea que el informado recientemente regulado proteólisis intramembrane (RIP) la pérdida de EpCAM de la superficie de las células tumorales mediada podría ser una de las razones de la limitada eficacia de las terapias de cáncer de base EpCAM aún debe ser establecida [24]. La escisión del ectodominio EpCAM, EPEX, por el factor de necrosis tumoral proteasa α la enzima de conversión (TACE) y su desprendimiento se ha demostrado que la liberación de su dominio intracelular (Ep-ICD), que entonces se transloca al núcleo resulta en la activación de la señalización oncogénica [ ,,,0],24]. La asociación de Ep-ICD con componentes de la vía Wnt FHL2 y beta-catenina y LEF-1 forma un complejo nuclear que se une al ADN Lef-1 sitios de consenso e induce la transcripción de genes, lo que lleva a un aumento de la proliferación celular [24]. La importancia clínica de Ep-ICD en los cánceres humanos necesita ser determinado teniendo en cuenta las múltiples funciones de EpCAM como un transductor de señales oncogénicas, molécula de adhesión celular y marcador de células madre de cáncer [24] [25], [26], [27, ].
localización nuclear de Ep-ICD se informó por primera vez en un estudio de 26 casos de cáncer de colon humano, pero no en el epitelio del colon normal [24]. Posteriormente, se informó de la acumulación nuclear y citoplasmática de Ep-ICD en diferentes subtipos de cáncer de tiroides que se asoció con una reducción recíproca en membranosa EPEX, y también se ha observado una correlación de acumulación Ep-ICD nuclear con la agresividad del tumor y el mal pronóstico de la enfermedad [28] . La amplia heterogeneidad en investigación tumores garantiza sólido para determinar si la expresión de Ep-ICD nuclear y citoplásmica también puede ocurrir en otros tipos de cáncer humanos. En el estudio actual, la acumulación compartimental subcelular de Ep-ICD se ha abordado en una amplia variedad de cánceres epiteliales, a saber, de mama, de próstata, cabeza y cuello, esófago, ovario, páncreas, colon y recto, pulmón, vejiga urinaria, hígado carcinomas por inmunohistoquímica (IHC) (utilizando un anticuerpo específico dirigido contra el dominio Ep-ICD de EpCAM). Nuclear y citoplasmática Ep-ICD también se ha detectado cuantitativamente en CX-1 en las células de cáncer de colon mediante inmunofluorescencia. Con la excepción de un informe anterior en el cáncer de colon y nuestro estudio en el cáncer de tiroides [24], [28], la novedad de este informe es la demostración de la presencia generalizada del aumento de la acumulación nuclear y citoplasmática de Ep-ICD en asociación con la variable EPEX expresión en la membrana en un amplio espectro de cánceres epiteliales.
Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Hospital Mount Sinai Junta Ética de Investigación, Toronto, Canadá. Los bloques de tejido de parafina archivados de un estudio de cáncer de cabeza y cuello aprobado por el Comité de Ética Humanos de todos India Institute of Medical Sciences, Nueva Delhi, India, con el consentimiento previo de los pacientes, se utilizaron en este estudio.
pacientes y muestras de tejido
Para el análisis IHC, archivado bloques de tejido de la cabeza y del cuello carcinomas de células escamosas (HNSCCs) y los tejidos normales, así como los carcinomas de células escamosas de esófago (ESCCs) fueron recuperados desde el banco de tumores, revisados por la patólogo y se utiliza para el corte de secciones de tejido para inmunotinción con anticuerpos Ep-ICD y EPEX como se describe a continuación. Los datos clínicos y patológicos registrados incluyeron etapa clínica del tumor, localización de las lesiones, la diferenciación histopatológica, la edad y el género en un pre-diseñado Performa como se describe anteriormente por nosotros [29]. Tejido microarrays (TMA) de cáncer de mama y el tejido mamario normal adyacente (IMH-371), el cáncer de próstata y el tejido de próstata normal adyacente (IMH-303), el cáncer de pulmón (IMT-305), cáncer de colon y de recto (IMH-306) , cánceres epiteliales comunes que comprenden de hígado, vejiga urinaria, ovarios, páncreas, mama y próstata (IMH-327) se adquirieron a partir imgenex Corp (San Diego, CA). Veintiún bloques de tejido de la hiperplasia prostática benigna (HPB) fueron recuperados de la banco de tejidos en el Hospital Monte Sinaí, revisado por el patólogo y se utiliza para el corte de secciones de tejido para la inmunotinción con anticuerpos Ep-ICD y EPEX.
Los anticuerpos y la línea celular
anticuerpo monoclonal de conejo Ep-ICD
anti-humano se obtuvo de Epitomics Inc. (Burlingame, CA). anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano EPEX (MOC-31) se obtuvo de AbD serotec (Raleigh, NC). El anticuerpo α-Ep-ICD 1144 reconoce el dominio citoplásmico de EpCAM humana y se ha utilizado en nuestro reciente estudio sobre Ep-ICD en el cáncer de tiroides [28]. MOC-31 reconoce el dominio extracelular del EpCAM. Ambos anticuerpos se han utilizado en nuestro estudio reciente en el cáncer de tiroides [28].
La línea celular de adenocarcinoma de colon humano CX-1 se cultivó en medio RPMI-1640 que contienen 100 mg /ml de estreptomicina y penicilina 100 U /mL , 10% de suero bovino fetal (FBS) y aminoácidos no esenciales 1%. El perfil de STR de la línea celular se encontró que era de acuerdo con el perfil conocido de CX-1 en las bases de datos de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania).
características clinicopatológicas de pacientes
Cincuenta y siete pacientes HNSCC, de edades comprendidas entre 29 y 75 años se inscribieron en este estudio. Sus diagnósticos se basan en el examen clínico y el análisis histopatológico de las muestras de tejido. Los tumores se clasificaron histológicamente carcinoma de células escamosas, así diferenciada (WDSCC), carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado (MDSCC) o carcinoma de células escamosas pobremente diferenciado (PDSCC). Veinte tejidos tomadas de un sitio distante de HNSCCs (con diagnóstico histológico de epitelio normal a que se refiere aquí como los tejidos normales de cabeza y cuello) también fueron evaluados para Ep-ICD y la expresión EPEX.
Cuarenta y seis pacientes CECA se inscribieron en este estudio. Sus diagnósticos se basan en el examen clínico y el análisis histopatológico de las muestras de tejido. Los tumores fueron clasificados histológicamente SCC así, moderadamente diferenciados o mal. Veinte tejidos tomados de un lugar distante de ESCCs (con diagnóstico histológico de epitelio normal se hace referencia aquí como los tejidos normales del esófago) también se evaluaron para la expresión de proteínas Ep-ICD. Del mismo modo, cuarenta tejidos tomadas de un sitio distante de ESCCs (con diagnóstico histológico de epitelio normal a que se refiere aquí como los tejidos normales del esófago) fueron evaluados para la expresión EPEX.
TMA de cáncer de mama y el tejido mamario normal adyacente, cáncer de próstata y tejidos adyacentes normales de próstata, cáncer de pulmón, de colon y el cáncer de recto, cánceres epiteliales comunes que comprenden de hígado, vejiga urinaria, ovarios, páncreas, mama y próstata fueron examinados. Para Ep-ICD, el número de tejidos analizados fueron de 38 cánceres de mama y 25 tejidos normales correspondientes, 49 cánceres de próstata y 9 correspondientes tejidos normales y 21 hiperplasias benignas de la próstata, 57 HNSCCs y 20 correspondientes tejidos normales, 46 ESCCs y 20 correspondientes tejidos normales, 59 cada uno de los cánceres de pulmón y colon, 10 cada una de vejiga, cáncer de ovario y páncreas, y 9 cánceres de hígado. Para EPEX, el número de tejidos que estaban disponibles para el análisis inmunohistoquímico incluyó 40 cánceres de mama y 29 tejidos normales correspondientes, 49 cánceres de próstata y 9 correspondientes tejidos normales y 21 hiperplasias benignas de la próstata, 39 HNSCCs y 20 correspondientes tejidos normales, 47 ESCCs y 40 correspondientes tejidos normales, 59 casos cada uno de los cánceres de pulmón y colon, y 10 casos cada uno de vejiga, ovario y cáncer de hígado.
El análisis inmunohistoquímico de la expresión de Ep-ICD en los cánceres epiteliales
parafina de serie secciones incrustadas (5 micras de espesor) de HNSCCs, ESCCs y sus tejidos normales se utilizaron para Ep-ICD y EPEX inmunotinción como se ha descrito recientemente [28]. Las diapositivas TMA y las secciones de tejido individuales se de-parafinadas por cocción a 62 ° C durante 1 hora en la orientación vertical y rehidratada en xileno y serie calificada alcohol. A partir de entonces, las condiciones de la recuperación de antígeno se optimizaron y se llevó a cabo en tampón de 0,01 M de citrato, pH 6,0 durante 3 minutos a 115 ° C, utilizando un horno de TTmega (Milestone Inc. Shelton, CT). actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de secciones en metanol que contiene 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos. Después de bloquear la unión no específica con el caballo normal o suero de cabra, las secciones se incubaron con anticuerpo α- Ep-ICD monoclonal de conejo 1144 (dilución 1:200) durante 30 minutos y biotina de cabra anti-conejo anticuerpo secundario durante 30 minutos o incubaron con MOC-31 (dilución 1:200) durante 30 minutos con el anticuerpo secundario biotinilado correspondiente (caballo anti-ratón o de cabra anti-conejo) (vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) durante 30 minutos. Las secciones se incubaron finalmente con Elite Vectastain ABC Reactivo (Vector Laboratories) y diaminobenzedine se utilizó como cromógeno.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
Los TMA imágenes fueron adquiridas mediante el Sistema Integrador Visiopharm (Visiopharm , Horsholm, Dinamarca). Ep-ICD y EPEX tinción immunopositive se evaluó en cinco áreas de las imágenes adquiridas de las secciones de tejido y el promedio de estos cinco puntuaciones se calculó. Las secciones se puntuaron como positivos si las células epiteliales mostraron immunopositivity en la membrana plasmática, el citoplasma y /o núcleo cuando es observado por dos evaluadores que desconocían la histopatología clínica y el diagnóstico. Estas secciones se puntuaron sobre la base de porcentaje de positividad de la siguiente manera: 0, & lt; 10% de células; 1, 10 a 30% de células; 2, 30-50% de las células; 3, 50-70% de las células; y 4, & gt; 70% de células mostraron inmunoreactividad como se describió anteriormente [28]. Las secciones también se anotó semi-cuantitativamente sobre la base de la intensidad de la siguiente manera: 0, ninguno; 1, leve; 2, moderado; y 3, intenso. Por último, una puntuación total (que va de 0 a 7) se obtuvo mediante la adición de las puntuaciones de positividad porcentaje y la intensidad para cada cáncer y sección de tejido normal. Los datos inmunohistoquímicos fueron sometidos a análisis estadístico como se describe anteriormente [29].
El análisis estadístico
Los datos IHC se sometieron a análisis estadístico con el programa SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL) y GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Se utilizaron gráficos de dispersión para determinar la distribución de la puntuación total de la membrana nuclear, y la expresión de Ep-ICD citoplasmática en los tejidos normales y cancerosas. característico (ROC) curva de funcionamiento del receptor se realizaron análisis para calcular la sensibilidad, especificidad y el área bajo la curva (AUC) valores de cada tipo de cáncer para nuclear y citoplásmica Ep-ICD. Sobre la base de la sensibilidad y especificidad óptima, un valor de corte de puntuación de IHC ≥4 se definió como immunopositive manera uniforme para todos los tipos de cáncer analizados para su análisis estadístico.
Análisis
inmunofluorescencia de Ep-ICD y localización EPEX en CX -1 línea celular de cáncer de colon
CX-1 en las células de cáncer de colon se cultivaron en portaobjetos de vidrio hasta 60% de confluencia y luego se incubaron con cualquiera de α-Ep-ICD anticuerpo monoclonal de conejo 1144 (1:100 dilución) o el ratón MOC-31 monoclonal de anticuerpos (1:100). Para Ep-ICD, el anticuerpo secundario utilizado fue un isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) marcado con anticuerpo de cabra anti-conejo (Sigma-Aldrich, 1:200 dilución). Para EPEX, el anticuerpo secundario utilizado fue un isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con anticuerpo de cabra anti-ratón (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1:200 dilución). Las diapositivas fueron vistos usando un microscopio de fluorescencia Olympus en posición vertical (BX61) y las imágenes fueron analizados utilizando el software Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA).
Resultados
El análisis inmunohistoquímico de la expresión de Ep-ICD en células epiteliales humanas cánceres
los parámetros clínicos conocidos, histopatología, y las puntuaciones Ep-ICD IHC para cada tipo de cáncer se proporcionan en los cuadros suplementarios S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10. Entre los tipos de cáncer que se compararon con los tejidos normales (Tabla 1), cánceres de mama mostraron 82% de positividad nuclear Ep-ICD (31 de 38 tejidos) y el 84% de positividad citoplasmática Ep-ICD (32 de 38 tejidos). Basado en un punto de corte de 4 IHC, ninguno de los 25 tejidos normales de mama analizados se consideraron positivos para la energía nuclear Ep-ICD; 56% (14 de 25 tejidos) no mostró tinción nuclear detectable en las células de mama lobular o ductal células, mientras que los restantes 11 casos mostraron resultados de IHC bajas. Los cánceres de próstata mostraron 82% de positividad nuclear (40 de 49 tejidos) y el 82% de positividad citoplasmática (40 de 49 tejidos). Nuclear Ep-ICD fue positiva en 2 de 9 tejidos normales de la próstata, y se observó positividad citoplasmática en 1 9 de tejidos. Entre los 21 tejidos de BPH analizados, se observó positividad citoplasmática en 1 de 21 tejidos; ninguno de los tejidos fueron nuclear Ep-ICD positiva basada en un punto de corte de 4. En HNSCCs, Ep-ICD positividad nuclear fue de 65% (37 de 57 tejidos) y la positividad citoplásmica fue del 74% (42 de 57 tejidos). CECA positividad nuclear fue del 37% (17 de 46 tejidos) y la positividad citoplasmática fue del 70% (32 de 37 tejidos). Nuclear y citoplasmática Ep-ICD se observa cada ser positivos sólo en 1 de 20 tejidos normales en cáncer de cabeza y cuello. Para la CECA, se observó positividad nuclear en 2 de 20 tejidos normales y se observó positividad citoplasmática en 6 de los 20 tejidos normales. Todos los cánceres epiteliales restantes muestran la acumulación nuclear y citoplásmica de Ep-ICD (Tabla 1). Cabe destacar que, aunque el uso de un punto de corte de ≥4 para determinar la positividad condujo a la reducción nuclear y la positividad citoplasmática en los cánceres de páncreas, un examen de la puntuación reveló que un punto de corte de 3,5 habría identificado 7 de 10 casos de acumulación Ep-ICD nuclear y 5 de 10 casos de acumulación Ep-ICD citoplasmática (Véase el cuadro complementario S8).
Las microfotografías representativas se muestran en la Figura 1 demuestran Ep-ICD inmunotinción en tejidos normales y cancerosas. El panel A muestra la localización de membrana predominante de Ep-ICD y ninguna tinción nuclear en el tejido de mama normal (I), mientras que el tejido de cáncer de muestra acumulación Ep-ICD nuclear y citoplásmica (II). Panel B (Ia) representa bajo nivel de membrana Ep-ICD en las células epiteliales y las células basales muestran ligeras tinción nuclear en el tejido de la próstata normal y en la hiperplasia benigna de la próstata (Ib). El tejido de cáncer de próstata muestra una intensa citoplásmica y un aumento de la tinción nuclear (panel B, II). En las células endoteliales, se observó consistentemente fuerte tinción Ep-ICD. En los adipocitos, la tinción varió de ausente a leve en algunas células. Los linfocitos se tiñeron fuertemente en los tejidos tumorales, mientras que se observó ninguna en los tejidos normales. tinción músculo liso estaba ausente o débil en todos los casos. No detectable tinción Ep-ICD se observó en el tejido esofágico normal (panel C, I), mientras que el ESCC mostró intensa nuclear y la inmunotinción citoplasmática (panel C, II). La mucosa normal de cabeza y cuello mostró débil membrana Ep-ICD (panel D, I), mientras que se observó una intensa nuclear y citoplasmática inmunotinción en CECC (panel D, II).
Las microfotografías representativas representan Ep-ICD inmunotinción en tejidos normales y cancerosas. El panel A muestra la localización de membrana predominante de Ep-ICD y ninguna tinción nuclear en el tejido de mama normal (I), mientras que el tejido de cáncer de muestra acumulación Ep-ICD nuclear y citoplásmica (II). El panel B muestra bajo nivel de membrana Ep-ICD en las células epiteliales y las células basales muestra algo de tinción nuclear en el tejido de la próstata normal (Ia) y en la hiperplasia benigna de la próstata (B, Ib), mientras que el tejido de cáncer de muestra intensa citoplásmica y nuclear tinción (II). El panel C muestra la tinción no detectable Ep-ICD en el tejido esofágico normal (I), mientras que el ESCC muestra intensa nuclear y la inmunotinción citoplasmática (II). Panel D representa la cabeza y el cuello mucosa normal que muestra la membrana débil Ep-ICD (I), mientras que el HNSCC muestra intensa nuclear y la inmunotinción citoplasmática (II). Aumento original × 400.
Aumento nuclear y la inmunorreactividad citoplásmica y reduce o se observó ausencia de tinción de la membrana de Ep-ICD en los cánceres de la vejiga (Figura 2, panel A), pulmón (B), hígado (C), ovario (D), colon (e), y el páncreas (F). En particular, se observó tinción de membrana Ep-ICD en algunos casos de cáncer epitelial de cada analizada. fotomicrografías representativas de cáncer de próstata y cáncer de colon representa heterogénea tinción Ep-ICD se muestran en la Figura 3 A, B. Algunas áreas de la sección de tejido mostró membrana citoplasmática predominante y débil, pero no la localización nuclear de Ep-ICD (Figura 3A, B - izquierda cuadrado), mientras que las otras áreas de la misma sección de tejido se detectó la acumulación nuclear y citoplasmática de Ep-ICD con ausencia de expresión membranosa Ep-ICD (Figura 3A, B - cuadrado derecha). Las fotomicrografías de control positivos y negativos se muestran en la Figura 4.
Aumento nuclear y la inmunorreactividad citoplásmica y reduce o se observó ausencia de tinción de la membrana de Ep-ICD en los cánceres de la vejiga (Panel A), pulmón (Panel B ), el hígado (Panel C), ovario (Panel D), colon (Panel e) y el páncreas (Panel F). aumento original × 400.
Membrana, citoplasmática, y la expresión de Ep-ICD nuclear en el cáncer de próstata (A) y el cáncer de colon (B). Algunas áreas de la membrana predominante sección de tejido espectáculo y débil frente al citoplasma, pero no la localización nuclear de Ep-ICD (A, B - cuadro de la izquierda), mientras que las otras áreas de la misma sección a mostrar el tejido nucleares y acumulación citoplasmática de Ep-ICD con la ausencia de expresión membranosa Ep-ICD (A, B - cuadrado derecha). aumento original × 400.
Se muestran las microfotografías de control negativo y positivo. controles negativos Ep-ICD para HNSCC (A), cáncer de próstata (B), el cáncer de colon (C), cáncer de mama (D), la CECA (E), y el esófago normal (F); paneles G y H son controles positivos para tinción Ep-ICD. aumento original × 400.
Análisis gráfico de dispersión
Los gráficos de dispersión en la figura 5A y 5B muestran la distribución de las puntuaciones nucleares y citoplasmáticos de inmunotinción Ep-ICD en todos los tipos de cáncer epitelial analizó . Nuclear Ep-ICD se observó en 39 de los 57 tejidos HNSCC y en 18 de los 46 tejidos CECA. Treinta y siete de estos 39 tejidos HNSCC examinados y 17 de los 18 tejidos CECA mostraron puntuación de IHC ≥4. Citoplasmática de tinción Ep-ICD se detectó en 42 de los 57 tejidos (74%) HNSCC examinado y 32 de los 46 tejidos (70%) CECA. cáncer de mama, cáncer de próstata, y positivamente-tinción HNSCCs y ESCCs todas las elevaciones destacadas que se exponen tanto nuclear y citoplasmática Ep-ICD en comparación con los tejidos normales y los tejidos de la próstata hiperplasia benigna analizados. De pulmón, colon, hígado, vejiga, ovario, y los tipos de cáncer de páncreas cada demostró expresión prominente de nuclear y citoplásmica Ep-ICD. Los gráficos de dispersión en la figura 5C muestran la distribución de las puntuaciones de membrana Ep-ICD en todos los tipos de cáncer epitelial analizados.
Los diagramas de dispersión que muestran distribución de las puntuaciones de inmunotinción totales determinados por IHC de secciones de tejido de cáncer de mama (n = 38), próstata (n = 49), pulmón (n = 59), ovario (n = 10), colon (n = 59), la vejiga (n = 10), HNSCCs hígado (n = 9), positivamente tinción (n = 39) y ESCCs (n = 19), y de mama normal (n = 25), próstata (n = 9) y BPH (n = 21), de esófago normal (n = 20), y la cabeza y el cuello (n = 20) tejidos. El eje vertical da la puntuación total IHC como se describe en los métodos. Se usó un punto de corte de ≥4 para determinar la positividad. N, normal, Ca, cáncer. se observó A. aumento de la acumulación nuclear de Ep-ICD en la mayoría de los cánceres epiteliales analizados. B. Incremento se observó acumulación citoplasmática de Ep-ICD en casi todos los cánceres epiteliales analizados. C. Membrana localización de Ep-ICD variada en los diferentes tipos de cáncer y tejidos normales examinados.
El análisis inmunohistoquímico de la expresión EPEX en los cánceres epiteliales humanas
IHC análisis similares de expresión en EPEX estos cánceres epiteliales humanos también se llevó a cabo usando MOC31, un anticuerpo específico contra el dominio extracelular de EpCAM (EPEX) en todos los diez cánceres epiteliales (Figura 6 y 7). fotomicrografías representativas en la figura 6, panel de E muestran un bajo nivel de la membrana expresión EPEX de mama normal (A) y de próstata (B, Ia), HPB (B, Ib), y el esófago normal (C) y la cabeza y el cuello (D) tejidos . Los tejidos de cáncer correspondientes que representan aumento del nivel de EPEX en la membrana se muestran en la Figura 6, el panel II (de mama A-; B-próstata; C- esófago; y la cabeza y el cuello D-). Por el contrario, muchos de los tejidos de cáncer de cada tipo de cáncer mostraron ausencia de membrana EPEX; fotomicrografías representativas se muestran en el panel III (A-D). La Figura 7, panel I muestra membrana intensa EPEX en el cáncer de colon (A), de hígado (B), la vejiga (C), pulmón (D), ovario (E) y el cáncer de páncreas (F). Figura 7 Panel II (A-F) muestra reducida o ausencia de membrana EPEX en un subconjunto de cada uno de estos cánceres epiteliales. Los controles positivos y negativos se muestran en la Figura complementario S1
.
Las microfotografías representar MOC31 membrana teñida EPEX en los cánceres epiteliales. El panel de E muestra bajo nivel de expresión de membrana EPEX de mama normal (A) y de próstata (B, Ia), HPB (B, Ib), y el esófago normal (C) y la cabeza y el cuello (D) los tejidos. Los correspondientes tejidos de cáncer que representan aumento del nivel de EPEX en la membrana se muestran en el panel II (A-D). Por el contrario muchos de los tejidos de cáncer de cada tipo de cáncer mostraron ausencia de membrana EPEX (panel III, A-D). aumento original × 400.
se observó la expresión
Membrana EPEX en todos los cánceres epiteliales. Panel I muestra membrana intensa EPEX en el cáncer de colon (A), de hígado (B), la vejiga (C), pulmón (D), de ovario (E) y el cáncer de páncreas (F). Los paneles II A-F muestran una reducción o ausencia de membrana EPEX en un subconjunto de cada uno de estos cánceres epiteliales. aumento original × 400.
Análisis de Ep-ICD y la inmunofluorescencia EPEX en la línea celular de cáncer de colon CX-1
En CX-1, una línea celular de cáncer de colon agresiva, y EPEX Ep-ICD se detecta tanto en la membrana plasmática (Figura 8). Se observó una intensa expresión en la membrana en las uniones célula-célula con tanto EPEX y los anticuerpos específicos de dominio Ep-DAI (Figura 8 - A, D, F y G). Además, se observó acumulación de Ep-ICD en el citoplasma y núcleos de las células cancerosas, pero no acumulación EPEX se encontró en los núcleos (Figura 8 - C, E, G). La exploración de la señal de fluorescencia cuantitativa de EPEX y EP-CIE apoya claramente estas observaciones (Figura 8H).
Los anticuerpos secundarios son FITC anti-ratón (verde) y TRITC anti-conejo (rojo). A) EPEX; B) Ep-ICD; C) DAPI; D) EPEX y DAPI (A & amp; C fusionó); E) Ep-ICD y DAPI (B & amp; C fusionó); F) EPEX y EP-ICD (A & amp; B se fusionó); G) EPEX, Ep-ICD y DAPI (A, B, C fusionaron); I) La medición de la densidad de los tres colores a través de la línea en las células de H.
curvas ROC Curve Análisis
ROC se generaron para nuclear y citoplasmática Ep-ICD en el CECC, CECA, los cánceres de próstata, y de mama (Figura 9) y sus resultados se resumen en la Tabla 2. Basándose en este análisis, se utilizó un punto de corte de ≥4 para determinar la positividad nuclear y citoplásmica. El análisis reveló que la acumulación de Ep-ICD nuclear distingue los cánceres de próstata y cánceres de mama de los tejidos normales con una sensibilidad del 82% y con una especificidad del 100% para los de mama y 78% para la próstata. En HNSCCs, nuclear Ep-ICD fue capaz de distinguir los cánceres de los tejidos normales con una sensibilidad del 65% y 95% de especificidad, mientras que en ESCCs, nuclear Ep-ICD mostró una sensibilidad del 37% y 90% de especificidad. Se encontró que los valores de AUC para ser 0,905 para el cáncer de mama, cáncer de próstata 0,867, 0,822 para la CECC, y 0.630 para la CECA. Citoplasmática expresión Ep-ICD en el cáncer de mama y de próstata tuvo una sensibilidad del 82% y 84% respectivamente, con una especificidad del 100% para los de mama y 89% para la próstata. En CECC, frente al citoplasma de expresión Ep-ICD tenía una sensibilidad del 74% y una especificidad del 95%, mientras que frente al citoplasma de Ep-ICD tenía sensibilidad y especificidad del 70% cada uno en ESCCs. Los valores de AUC para citoplasmática Ep-ICD eran 0.928 en el cáncer de mama, cáncer de próstata en 0.880, 0.864 en el CECC, y 0,758 en CECA.
curvas ROC que describen la relación entre las sensibilidades y especificidades de 1-Ep nuclear y citoplasmática expresión -ICD en estos cánceres epiteliales. El eje vertical de cada curva indica la sensibilidad y el eje horizontal indica el 1-especificidad. La sensibilidad, la especificidad y los valores de AUC para los cánceres se resumen en la Tabla 2.
Discusión
El presente estudio pone de manifiesto la ocurrencia frecuente de la acumulación nuclear y citoplasmática de Ep -ICD en diez tipos de cáncer epitelial. El epitelio normal de los tejidos de mama, próstata y esófago analizados mostró membrana distinta Ep-ICD localización. Es importante destacar que reduce o se observó ausencia de membranosa Ep-ICD en los cánceres de mama, próstata, cabeza y cuello y esófago, en paralelo por una marcada acumulación Ep-ICD en el núcleo y el citoplasma de las células tumorales respectivas. Sin embargo, un subconjunto de tumores de cada uno de estos diez tipos de cáncer mostró expresión en la membrana de alta Ep-ICD que se correlaciona con la alta expresión EPEX en la membrana se detectó usando un dominio externo Ep-CAM (EPEX) anticuerpo específico (MOC31), lo que sugiere el aumento de expresión de la proteína de longitud completa como se detecta por Ep-ICD y los anticuerpos específicos EPEX. En particular, el análisis inmunohistoquímico de los cánceres epiteliales utilizando MOC31 mostró una mayor expresión en la membrana EPEX en comparación con los tejidos normales en algunos tumores, mientras que los otros demostraron una reducción o ausencia de membrana EPEX, apoyando nuestras observaciones con anticuerpos específicos de dominio Ep-ICD. Vale la pena señalar que los cánceres que muestra reducen o ausencia de membrana EPEX o Ep-ICD habían aumentado notablemente Ep-ICD en el citoplasma y núcleos de dichas células tumorales. Notablemente, EPEX no se detectó en cualquiera de los núcleos de las células tumorales en cualquiera de los cánceres analizados. En conjunto, estas observaciones están a favor de una mayor expresión y el aumento de derramamiento de EPEX por las células tumorales en un subconjunto de todos los tumores epiteliales estudiados.