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PLOS ONE: papel crucial de TSC-22 en la prevención de la degradación de p53 en Proteasomal cervical Cancer

2016/1/5


Extracto

La función supresora de tumores p53 puede verse comprometida en muchos tumores por el antagonista celular HDM2 y el virus del papiloma humano E6 oncogén que inducen la degradación de p53. Restauración de la actividad de p53 tiene un fuerte potencial terapéutico. Aquí, hemos identificado TSC-22 como una nueva proteína p53 que interactúa con y mostrar su nueva función como un regulador positivo de la p53. Se encontró que el nivel de TSC-22 fue significativamente las reguladas en los tejidos de cáncer de cuello uterino. Por otra parte, la sobre expresión de TSC-22 era suficiente para inhibir la proliferación celular, la promoción de la apoptosis celular en células de cáncer cervical y suprimir el crecimiento de tumores de xenoinjertos en ratones. La expresión de TSC-22 también ha mejorado el nivel de proteína de p53 al protegerla de poli-ubiquitinación. Cuando se une al motivo entre los aminoácidos 100 y 200 de p53, TSC-22 inhibió la HDM2- y mediada por p53 E6 poli-ubiquitinación y degradación. En consecuencia, la sobre expresión ectópica de TSC-22 activa la función de p53, seguido por aumento de la expresión de p21
Waf1 /Cip1 y PUMA en líneas celulares de cáncer cervical humano. Curiosamente, TSC-22 no afectó la interacción entre p53 y HDM2. Knock-down de TSC-22 mediante pequeños ARN de interferencia mejorado claramente la poli-ubiquitinación de p53, lo que lleva a la degradación de p53. Estos resultados sugieren que los TSC-22 actúa como un supresor de tumores p53 mediante la protección de poli-ubiquitinación mediada por la degradación

Visto:. Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, Parque J, Jang ES, et Alabama. (2012) El papel crucial de TSC-22 en la prevención de la degradación proteasomal de p53 en el cáncer cervical. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10.1371 /journal.pone.0042006

Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong

Recibido: 29 Junio, 2011; Aceptado: 2 Julio 2012; Publicado: August 1, 2012

Copyright: © Yoon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado principalmente por el Programa básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (20110026217) y parcialmente asistida por la subvención del Instituto de Ciencias de Corea básico NAP (T3278B) y la concesión interna de Corea del Instituto Nacional de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, dicision publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

TGF
β
estimulado clon 22 (TSC-22) fue identificado por primera vez como TGF-
β
gen inducible en células osteoblásticas de ratón. expresión TSC-22 se induce en una variedad de líneas celulares por TGF-
β
, éster de forbol, suero, y progestina y regula positivamente la TGF
β
señalización [1], [2 ]. TSC-22 contiene un motivo de cremallera, leucina, pero no tiene un motivo de unión a ADN en la región N-terminal. TSC-22 puede homodimerize y heterodimerizarse con TSC-22-gen homólogo 1 (THG-1), y tiene actividad represor transcripcional [3].

Algunos investigadores han identificado las funciones fisiológicas de TSC-22 en el desarrollo proceso. TSC-22 es necesaria para la gastrulación durante la embriogénesis temprana en
Xenopus laevis
[4] y de la ovogénesis en
Drosophila
[5]. También se ha sugerido que TSC-22 induce células eritroides y cardiaca diferenciación de miofibroblastos a través de la activación de la actividad transcripcional de Smad3 y Smad4, y antagonizar el Smad7 en respuesta a TGF-
β
dependiente de la señalización de [6], [ ,,,0],7].

Además, varios estudios se han centrado en las funciones de supresión de tumor de TSC22. TSC22 se piensa que es un supresor tumoral potente en células de cáncer salivales [8], [9] las células de carcinoma gástrico humano [10], carcinoma hepática [11], tumores astrocíticos humanos [12], y grandes linfocitos leucemia granular [13]. Se han notificado los mecanismos detallados de la función supresora de tumores de TSC22 junto con la hipótesis de que el TSC-22 reprime la expresión de los genes anti-apoptóticos
GADD45B
y
Lzts2
[11], negativa regula Ras /Raf señalización [14] e implicado en la muerte de células de carcinoma gástrico mediada por TGF-b de una manera dependiente de caspase3 [10]. Por otra parte, la actividad apoptótica mediada por TSC22 se inhibe por la interacción entre TSC-22 y fortillin, seguido por conduce a TSC-22 desestabilización [15].

(A) ARN total se preparó a partir de pacientes ' especímenes de cáncer y el
nivel de TSC-22
ARNm se evaluó a continuación, con el tiempo real de RT-PCR. Cx; número de serie de muestras de tejidos de pacientes. (B)
HeLa
y
Caski
células se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de 24 h, las células fueron infectadas con Ad-
TSC-22 o Ad-

lacZ
. En los puntos de tiempo indicados, el número de células se determinaron por el ensayo de MTT para analizar las tasas de proliferación celular. (C)
HeLa
células infectadas con Ad
TSC22
o Ad-
LacZ
se cultivaron durante los tiempos indicados, y las células fueron teñidas con yoduro de propidio (PI ). La población de células sub-G1 (células muertas) y el perfil de ciclo celular de las células PI-teñidas se analizaron por citometría de flujo después de tinción PI-. ensayo (D) la fragmentación del ADN se realizó mediante el aislamiento de ADN cromosómico a partir del 1 × 10
6 número de
HeLa
y
Caski
células infectadas con Ad-
TSC22
o Ad
lacZ
durante 72 horas (izquierda). Después de 3 días de la infección por Ad
TSC-22, España p53, Puma, p21, E6 y expresión TSC22 se analizaron mediante hibridación occidental (derecha).

p53 es un bien conocido gen supresor de tumores que actúa mediante la activación de la transcripción de sus genes diana, tales como p21, PUMA,, PKR y BAX [16] - [18]. funciones de p53 están regulados por modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, acetilación, y ubiquitinación. Es bien entendido que p53 niveles están estrechamente reguladas por ubiquitinación MDM2 mediada a través de un bucle de retroalimentación auto-regulador [19], [20]. En ocasiones, la regulación de la expresión de p53 se correlaciona con la tumorigénesis a través de la infección por el virus del papiloma humano que expresa E6, que conduce a la degradación mediada por ubiquitina p53 [21], [22]. A pesar de que la regulación de la p53 ha sido examinada a través de múltiples rutas relacionadas con la tumorigénesis, quedan muchas preguntas sobre el mecanismo de la inhibición de tumores de la vía de p53.

Dado que el mecanismo subyacente a la red de genes supresores de tumores aún no ha sido explícitamente dilucidado, se realizó un análisis de microarrays de ADNc del perfil de expresión génica en el tejido canceroso para encontrar nuevos genes relacionados con el tumor. Se encontró que el TSC-22 expresión se redujo significativamente en tejidos de cáncer de cuello uterino en comparación con los tejidos normales. Posteriormente, exploramos la nueva función de TSC-22 durante la tumorigénesis. Para ello hemos realizado una levadura ensayo de dos híbridos para la detección de nuevas proteínas TSC-22 de unión. A partir de este, p53 se identificó como una proteína de TSC-22 de unión. También se encontró que TSC-22 podría mejorar las actividades de p53 a través de la inhibición de la ubiquitinación mediada por E6 y HDM2 uniéndose directamente a p53. Por otro lado, TSC-22 sobre-expresión estabilizado nivel de proteína p53, lo que lleva a un aumento de la muerte celular y la inhibición de la proliferación celular. Por último, la tasa de crecimiento del tumor se reduce fuertemente por la expresión de TSC-22 en un modelo de tumor de xenoinjerto. Tomados en conjunto, estos resultados indican que el CET-22 desempeña un papel crucial en la inhibición del crecimiento del tumor a través de la regulación de p53 ubiquitination
.
(A) constructos TSC-22 y de ADNc de p53 se cotransformed en células de levadura EGY48 de prueba de la interacción proteína-proteína en el sistema de levadura de dos híbridos. Los transformantes se ensayaron en cuanto a su capacidad para crecer en medio carente de leucina (izquierda) y para la expresión β-galactósido (derecha). (B)
HeLa
células y
Caski
células fueron infectadas con Ad-
TSC-22 Opiniones de los tiempos indicados. Los niveles de proteína se analizaron por Western blot con el anticuerpo DO-1 contra p53, el anticuerpo anti-TSC-22, y el anticuerpo anti-β-actina como control de carga. (C)
HeLa
células fueron transfectadas con 1 g de Flag-TSC-22 vector de expresión. 24 h después de la transfección, p53, Puma, p21, y la expresión TSC22 se analizaron por Western Blot y semi-cuantitativos RT-PCR con proteínas y ARN total obtenido de cada línea celular. (D)
se analizaron las células HeLa que expresan establemente
shRNA específica para el CET-22 y de metas de control de shRNA no para determinar los niveles de proteína y mRNA expresión de p53 y Puma. (E) La actividad de luciferasa de la p53RE (elemento encargado) impulsada por el promotor se evaluaron mediante transfección de la cantidad indicada de la bandera-TSC-22 plásmido en
HeLa
células (panel superior). Actividad de la p53RE-promotor se evaluó en
sh-con
y
sh-TSC-22
expresando
HeLa
células (panel inferior) por ensayos de luciferasa. (F) Una g de Flag-TSC-22 o de la bandera de forma simulada del vector se transfectó en
p53

+ + o
p53

/- /-
HCT116
células. A las 48 h después de la transfección, lisados ​​de células se analizaron por transferencia Western con los anticuerpos indicados. (G) La estabilidad de la proteína p53 se evaluó en
HeLa
células infectadas con Ad-
TSC-22 o Ad-

lacZ
. 24 h después de la infección, las células fueron tratadas con cicloheximida (50 mg /ml) durante los períodos de tiempo indicados. Los lisados ​​celulares se analizaron por Western Blot con anticuerpos anti-p53 (DO-1) con β-actina como control de carga.

Resultados

TSC22 inhibe el crecimiento tumoral

con el fin de analizar el perfil de expresión de genes específicos de cáncer de cuello de útero, se realizó un análisis de microarrays de ADNc con ADNc preparada a partir de tejidos de cáncer de cuello uterino de los pacientes. Curiosamente, nuestros datos de microarrays mostraron que
TSC-22
la expresión de genes se redujo notablemente en todas las muestras de cáncer (datos no mostrados). A continuación, realizó el análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR) para confirmar los resultados de microarrays. Como se muestra en la Figura 1A,
los niveles de 22-TSC
de expresión de mRNA en tejidos de cáncer de los pacientes se redujeron significativamente en comparación con aquellos en el tejido normal.

Estos resultados llevaron a más preguntas. La primera pregunta era si TSC-22 podría suprimir la proliferación de células tumorales o no. Por lo tanto, estamos infectados
HeLa gratis (VPH-18) y
Caski
células (VPH-16) con adenovirus que expresan
TSC-22
o
lacZ
(control de infección). Como se muestra en la Figura 1B, las relaciones de proliferación tanto de las células se redujo significativamente por la infección con Ad
TSC-22
. A continuación examinó si TSC-22 podría inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis en
HeLa
células. Se encontró que la población G0 /G1 se incrementó dramáticamente entre Ad-
Tarjetas telefónicas células infectadas TSC-22- comparación a la de Ad
LacZ-
células infectadas dentro de las 48 h después de la infección. Por otra parte, la mayoría Ad
células infectadas TSC-22-
sufrió la apoptosis en la etapa tardía (Figura 1C). El próximo evaluó la fragmentación cromosómica en el ADN para observar la apoptosis TSC-22 inducida por
HeLa y células

Caski
. Como se muestra en la Figura 1D, el ADN cromosómico de Ad-
TSC-22
infectado con
HeLa
y
Caski
células mostraron muy alto nivel de fragmentación. Además, p21 (inhibidor del ciclo celular) y el puma (inductor de apoptosis) los niveles de expresión fueron notablemente mayor en Ad
TSC-22
infectados
HeLa
y
Caski
celular (Figura 1D panel derecho). Estos efectos fueron más significativos en
HeLa
células crónicamente infectadas por VPH 18-. p53 y el nivel de TSC22 en las células HeLa fueron apenas detectados se comparan (d) a CaSki células (panel derecho Figura 1D). Especulamos que sus diferentes expresiones son causadas por la diferente serotipo de HPV. Estos resultados indican que la sobre expresión de inducido TSC-22 altos niveles de muerte celular. Nuestros resultados sugieren fuertemente que TSC-22 juega un papel fundamental en el crecimiento de células tumorales de cuello uterino y la muerte.

ectópica expresó TSC-22 interactúa con p53 se expresa en ectópica
H1299
células. Dos g de Flag-TSC-22 vector de expresión se cotransfectaron con el vector de expresión Flag-p53 (A) o un no-etiquetada vector de expresión de p53 (B) en
H1299
células cultivadas en placas de 100 mm. 48 h después de la transfección, lisados ​​de células se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-p53 (DO-1) (A) o el anticuerpo monoclonal anti-Flag (B). Los inmunoprecipitados se analizaron por transferencia Western utilizando un conjugado con HRP anti-Flag (A) o anti-p53 (FL393) (B) del anticuerpo monoclonal. (C-D) TSC-22 interactúa con p53 endógeno. Ectópica expresado TSC-22 interactúa con p53 endógeno en las células. células HEK293 se transfectaron con 2 g de Flag-TSC-22 plásmido durante 48 h. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con anti-p53 (DO-1) anticuerpo monoclonal, inmunoglobulina G de ratón (IgG) (C), o un anticuerpo monoclonal anti-Flag (D). Los inmunoprecipitados se analizaron mediante transferencia Western utilizando un conjugado con HRP anti-Flag (C) o anticuerpo anti-p53 (FL393).

TSC-22 se une a
P
53 en una levadura de dos híbridos de ensayo

Tal como se muestra por nuestros datos, TSC-22 contribuye a la inhibición del crecimiento de células cancerosas y la muerte celular. Esto fue consistente con estudios previos que demuestran que TSC-22 es un supresor de tumor potencial [8] - [11], [13], [23] - [25]. Con el fin de dilucidar los mecanismos que subyacen a esta función, seleccionados para las proteínas TSC-22-unión usando una levadura ensayo de dos híbridos. A través de este, p53 se identificó como una proteína de TSC-22-de unión (Figura 2A, panel izquierdo). La interacción entre TSC-22 y p53 se demostró de este modo
in vitro fotos: por tanto el crecimiento celular y un ensayo de β-galactosidasa (Figura 2A, panel derecho).

Determinación de los efectos de TSC- 22 en
p
53

Para entender mejor los efectos de TSC-22 de p53,
HeLa
y
Caski
células fueron infectadas con Ad-
TSC-22
o
lacZ Opiniones de aumentar los períodos de tiempo. Curiosamente, los niveles de p53 endógeno se incrementaron significativamente por transfección de Ad-
TSC-22
de una manera dependiente del tiempo (Figura 2B). El aumento de la expresión de p53 fue más significativo en
HeLa
células que en las células
Caski
. Con el fin de observar el aumento de la actividad de los genes diana de p53 por la expresión de TSC22, la bandera de etiquetado TSC-22 se introdujo en células
HeLa
. la proteína p53 y sus genes diana, incluyendo p21 y el puma, se indujeron claramente por Bandera-
TSC-22
expresión (Figura 2C). Por el contrario, golpeando hacia abajo TSC-22 en
HeLa
células reduce los niveles de la proteína p53 y PUMA (Figura 2D). Sin embargo, el nivel de ARNm de p53 no se vio afectada por knock-down y la sobre expresión de TSC-22 (Figura 2C y 2D, panel inferior).

Para determinar si la actividad de p53 está regulada por TSC-22 expresión en
HeLa
células, se evaluó la
p53RE gratis (elemento encargado) impulsada por la actividad del promotor con TSC-22 expresión y knock-down de TSC-22 en
HeLa células
. Un promotor que alberga un
p53RE
fue activado por TSC-22 expresión de una manera dependiente de la dosis. Por otro lado, la actividad del promotor se redujo en TSC-22 knock-down. Estos datos sugieren que la actividad transcripcional mediada por p53 está regulada por TSC-22 (Figura 2E). Para evaluar si la disminución de PUMA y p21 son causados ​​por la regulación directa de p53 por TSC-22, Bandera de etiquetado
TSC-22
plásmido se introdujo en
HCT116 p53
+ /+
y
p53
- /-
células. Se observó mayor expresión de PUMA en
p53
+ /+, pero no

p53
- /-
células (Figura 2F). Este resultado sugiere que la regulación de PUMA y p21 por TSC22 es dependiente de p53. Para estudiar más a la mejora de la p53 por TSC-22, se evaluó la estabilidad de p53 en Ad
TSC-22 o Ad-

lacZ
infectados
HeLa
células después del tratamiento con cicloheximida . Como se muestra en la Figura 2 G, Ad-
TSC-22
mucho mayor y se estabilizaron los niveles de p53 endógenos. Estos resultados sugieren que TSC-22 promueve la función supresora de tumores de p53 mediante la mejora de la estabilidad de la proteína p53.

(A) Diagrama esquemático muestra el cDNA construye para los mutantes de deleción de p53 marcado con FLAG y p53 de longitud completa , e indica el dominio de unión TSC22. (B)
H1299
células fueron transfectadas con los plásmidos indicados codifican mutantes de deleción de p53 marcado con FLAG junto con el plásmido Bandera-TSC-22. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con el FL393 anticuerpo policlonal anti-p53 (izquierda) o DO-1 anticuerpo monoclonal específico para la región N-terminal (a la derecha), seguido de transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados. Los lisados ​​(5%) también se cargaron en un gel de SDS para la transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Flag (parte inferior de cada panel). (C) Diagrama esquemático que muestra las construcciones de ADNc de los TSC-22 mutantes de deleción de la bandera de etiquetado (panel izquierdo).
H1299
células fueron transfectadas con los plásmidos indicados que codifican los mutantes de deleción TSC22 bandera de etiquetado junto con el plásmido Flag-p53. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-p53 (FL393); co-inmunoprecipitó TSC22 se detectó por Western Blot utilizando el anticuerpo anti-Flag conjugado con HRP (derecha, panel central). Lisado (5%) se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Flag (derecha, panel inferior).

TSC-22 se une a
p
53
in vivo

Para determinar si, transfectadas
de pulmón humano H1299
no pequeñas células de carcinoma de células con el plásmido de expresión Bandera-TSC22 y la expresión de p53 ^ TSC-22 interactúa con p53 en células de mamíferos plásmido, y los ensayos de co-inmunoprecipitación y Western blot realizados a continuación. Se encontró que el TSC-22 específicamente co-inmunoprecipitó con p53 en células que expresan tanto Flag-TSC22 y p53, pero no en células que expresan cualquiera de las proteínas solo (Figura 3A). Por el contrario, p53 específicamente co-inmunoprecipitó con TSC-22 con el anticuerpo anti-Flag (Figura 3B), lo que sugiere una interacción entre TSC-22 y p53. A continuación, tratamos de confirmar la interacción entre p53 endógeno y TSC-22. Ya que no pudimos comprar un anticuerpo apropiado TSC-22 para utilizar en un experimento de co-inmunoprecipitación, esta interacción fue confirmada por recíproca co-inmunoprecipitación con p53 endógena y exógena expresada Bandera de etiquetado TSC-22 en células HEK293 que expresan altos niveles de p53 (Figuras 3C y D). Los resultados sugieren que el TSC-22 interactúa directamente con p53.

TSC-22 se une a p53 en la región, incluyendo Aminoácidos 100 a 200

Para definir aún más la región esencial para la unión TSC-22 a p53, se generaron varios mutantes de deleción de p53 (Figura 4A). Los plásmidos de expresión de p53 y TSC-22 se transfectaron en
H1299
células juntos o por separado. Como se muestra en las Figuras 4A y B, TSC-22 era capaz de unirse a p53 varios mutantes de deleción parcial, incluida la p53
1-300, p53
101 a 393, y p53
1-200. Sin embargo, la eliminación de más una parte de la región interna del dominio de unión a ADN, tales como p53
1-100, p53
201-393, p53
301-393 y p53
201-300, abolió p53-TSC22 de unión (Figuras 4A y B). Estos resultados indican que la región que incluye los aminoácidos 100-200, que es una parte del dominio de unión a p53 de ADN, se requiere para la unión TSC-22. Posteriormente, para identificar la región de unión a p53 de TSC-22, Bandera de etiquetado truncadas TSC-22 mutantes que cada una contenía una α-hélice se expresaron con p53 como se muestra en la Fig. 4C. En la co-inmunoprecipitación experimentos utilizando un anticuerpo anti-p53 (DO-1), TSC-22
54-154 fue co-immunoprecipitated con p53, pero TSC-22
1-110 y TSC-22
54-110 no lo eran. Estos datos sugieren que p53 se une aminoácidos 110-154 de TSC-22. Por desgracia, no hemos podido confirmar aún más la interacción detallada de p53-TSC-22 debido a TSC-22
110 a 154 no fue expresado en nuestro experimento (Figura 4C). Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que TSC-22 y p53 interactúan en dominios específicos de cada proteína.

(A) TSC22 inhibe la ubiquitinación de p53 mediada por HDM2.
H1299
células fueron transfectadas con los plásmidos indicados. Las células transfectadas se trataron con MG132 (20 M) durante 5 h antes de la cosecha. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA. p53 ubiquitina se detectó mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitina se indica como Ub (n) -p53 (panel superior). La expresión de p53 totales, HDM2, Bandera-TSC-22 y HA-Ub proteínas se muestran en los paneles inferiores. (B) TSC-22 no interrumpe la interacción entre p53 y HDM2.
H1299
células fueron transfectadas con Flag-p53 junto con la bandera-TSC-22 o un vector de la bandera de forma simulada en presencia de un vector de expresión HDM2. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-p53 (DO-1) de anticuerpos seguido de transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados. Lisado (5%) se analizó por transferencia Western utilizando anticuerpos indicados (panel inferior). (C) TSC-22 inhibe la ubiquitinación de p53 mediada por E6.
H1299
células fueron transfectadas con los plásmidos indicados en presencia de un vector de expresión de HA-Ub. 48 h después de la transfección, las células transfectadas se trataron con MG132 (20 M) durante 5 h antes de ser cosechadas. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA. p53 ubiquitina se detectó mediante transferencia de Western con el anticuerpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitina se indica como Ub (n) -p53 (panel superior). La expresión de p53 totales, Myc-E6, Bandera-TSC-22, y HA-Ub proteínas se muestran en los paneles inferiores. (D) TSC-22 interrumpe la ubiquitinación de p53 en
HeLa
células.
HeLa
células se cotransfectaron con la bandera-TSC-22 o un vector de la bandera de forma simulada y vector de expresión de HA-Ub. 48 h después de la transfección, las células se trataron con 20 mM MG132 durante 5 h antes de la cosecha. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA. p53 ubiquitina se detectó mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-p53 (DO-1). (E) Estable TSC-22 knock-down o control
HeLa
células fueron tratadas con 20 mM MG132 durante 5 h antes de la cosecha. La ubiquitinación de p53 se analizó como se ha descrito anteriormente.

TSC22 Inhibe HDM2 y p53 mediada por E6 poli-ubiquitinación

Para determinar si la mejora de la estabilidad de p53 por TSC-22 es debido a la inhibición ubiquitinación de p53,
H1299
células fueron transfectadas con HDM2, p53, y TSC-22 plásmidos de expresión, y se trataron con el inhibidor de proteasoma MG132 durante 6 horas con el fin de llevar a cabo
in vivo
ensayos de ubiquitinación . Como se muestra en la Figura 5A, p53 fue altamente ubiquitinated con la expresión de HDM2. Sin embargo, aún más ubiquitinación p53 mediada por HDM2 fue significativamente inhibido por la expresión de TSC-22 (Figura 5A). A continuación queríamos determinar si la inhibición de la ubiquitinación de p53 mediada por HDM2 por TSC-22 es causada por la interrupción de la interacción entre HDM2 y p53. Por lo tanto, hemos introducido p53, HDM2, y TSC22 plásmidos de expresión en
H1299
células como se muestra en la Figura 5B. luego p53 se inmunoprecipitó a partir de los extractos de células con el anticuerpo DO-1. Curiosamente, este experimento demostró que p53 se une simultáneamente a HDM2 y TSC-22. Además, la interacción p53-HDM2 no se interrumpió mediante la expresión de TSC-22. Estos datos sugieren que TSC-22 puede proteger p53 de ubiquitinación mediada por HDM2 uniéndose directamente a p53 en una región separada de la sitio de unión de HDM2.

(A) HDM2 y Myc-E6 se transfectaron con plásmidos indicados en
H1299
células. Las células transfectadas se trataron con MG132 (20 M) durante 5 h antes de la cosecha. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA. p53 ubiquitina se detectó mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitina se indica como Ub (n) -p53 (panel superior). La expresión de p53 totales, HDM2, Bandera-TSC-22 y HA-Ub proteínas se muestran en los paneles inferiores. (B) Bandera de etiquetado de tipo salvaje (WT) o mutante TSC22
1-110 fue co-transfectadas con los plásmidos indicados en las células
H1299
. Las células transfectadas se trataron con MG132 (20 M) durante 5 h antes de la cosecha. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA. p53 ubiquitina se detectó mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitina se indica como Ub (n) -p53 (panel superior). La expresión de p53 totales, HDM2, Bandera-TSC-22 y HA-Ub proteínas se muestran en los paneles inferiores. (C) Los ratones desnudos fueron inoculados con 1 x 10
6
HeLa
células mediante inyección subcutánea. tumores subcutáneos derivados de la
HeLa
células se trataron con los vectores de adenovirus como se indica. Los volúmenes tumorales se muestran como la media de al menos cinco ratones por grupo (n = 10-14 por grupo). Bares = SD. (D) Efecto del tratamiento TSC-22 en el nivel de expresión de p53 en los tumores derivados de células HeLa extirpados en la 27
TH días post-tratamiento tal como se determina mediante análisis de inmunotransferencia. inmunoblot representativo de las tres muestras de cada grupo.

A continuación trató de demostrar que el CET-22 p53 puede proteger de ubiquitinación mediada por E6 porque el E6 y HDM2 dominios de unión a p53 solapamiento. p53 fue altamente ubiquitinated con la expresión de E6 en
H1299
células (Figura 5C, carril 3); Sin embargo, más expresión de TSC-22 bloqueó claramente mediada por E6 ubiquitinación de p53 (Figura 5C, carril 4). A continuación utiliza
HeLa
células que constitutivamente expresan E6 para examinar TSC-22 mediada por la estabilidad de p53 en condiciones fisiológicas. La ubiquitinación de p53 se incrementó en gran medida después del tratamiento MG132 en las células. Por el contrario, esta ubiquitinación desapareció claramente en la sobre expresión de TSC-22 (Figura 5 D). ubiquitinación p53 fue rescatado por la expresión de shRNA específica para el CET-22 en
HeLa
células en ausencia de MG132 (Figura 5E, carril 2). Sin embargo, la diferencia en el nivel de ubiquitinación p53 no fue significativa entre los
sh-con
y
sh-TSC-22
células en presencia de MG132. Exploramos aún más el efecto de TSC-22 en la ubiquitinación de p53 por la expresión tanto de HDM2 y E6. Como se muestra en la Figura 6A, el nivel de ubiquitinación p53 se indujo de manera espectacular tanto por HDM2 y E6. Sin embargo, tanto de HDM2 y mediada por E6 ubiquitinación p53 fue fuertemente interrumpida por TSC-22 expresión (Figura 6A). Además, hemos probado si la interacción TSC-22-p53 es esencial para inhibir la ubiquitinación de p53. Como se muestra en la Figura 6B, C-terminal mutante de deleción TSC-22
110 que no interacciona con p53 (Figura 4C), no inhibió la HDM2 y E6-p53 mediada por ubiquitinación (Figura 6B). Este resultado revela que TSC-22 inhiben la ubiquitinación de p53 a través de la interacción directa. Estos datos sugieren fuertemente que TSC-22 interactúa directamente con p53 y para el E6 y /o medidated-HDM2 ubiquitinación p53, seguido de la estabilización de la proteína de p53.

TSC-22 suprime el crecimiento tumoral en ratones desnudos

a continuación se determinó si TSC-22 inhibe el crecimiento tumoral
in vivo
. Crecimiento exponencial
se inyectaron HeLa
células de cáncer cervical por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes BALB /c desnudos. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm
3, 1 × 10
9 pfu de adenovirus que expresa TSC-22 o
lacZ
fueron inyectadas en los tumores. Después de tres inyecciones intra-tumorales secuenciales de adenovirus, se monitorizaron los animales (5-7 por grupo) para el crecimiento tumoral. El crecimiento tumoral y la morfología se analizaron más de 30 días. La Figura 6C muestra que la masa del tumor en ratones inyectados con Ad-TSC-22 se redujo notablemente en comparación con los tumores inyectados con Ad
LacZ
o que no recibieron tratamiento. A continuación se investigó el efecto de TSC-22 en la estabilización de p53 en los tejidos tumorales cosechadas de control y ratones tratados TSC-22. se observó TSC-22 de la transfección de aumentar significativamente el nivel de expresión de la proteína p53 (Figura 6D). En conjunto, estos resultados demuestran claramente que TSC-22 puede ser un potente supresor de tumores en este modelo animal.

Discusión

En nuestra búsqueda para identificar los genes asociados con el desarrollo del cáncer cervical, patrón de expresión analiza siguiente experimentos de microarrays de ADNc y RT-PCR revelaron que el
TSC-22
gen se redujo constantemente en los tejidos tumorales (Fig. 1A). Varios estudios previos informaron que TSC-22 es regulada hacia abajo en los tumores humanos de las glándulas salivales [23], tumores de hígado de ratón [11], y los tumores cerebrales humanos, tales como astrocitomas [26]. Estos resultados sugieren que la regulación por disminución de TSC-22 puede jugar un papel en el desarrollo del cáncer en diversos tejidos. Sin embargo, estos informes anteriores no abordaron el problema de TSC-22 se redujo en las células cancerosas. Una explicación razonable es que TSC-22 puede inhibir el desarrollo de células cancerosas. Nuestros resultados mostraron que TSC-22 proliferación celular dramáticamente inhibida y la muerte celular inducida cuando se expresa con un sistema de expresión de adenovirus (Figuras 1C y D). Del mismo modo, el aumento de TSC-22 expresión se asocia con aumento de la apoptosis en células de carcinoma gástrico humano [10].

Dado que TSC-22 es un represor de la transcripción [3], el papel de TSC-22 en la supresión tumoral ha sido sugerido por Mari
et al
. [11]. A través de experimentos utilizando TSC-22 siRNA, este grupo demostró que el daño gen inducible por 45 β ADN (Gadd45ß) y supresor tumoral putativo 2 (Lzts2) son supuestos objetivos de TSC-22. Sin embargo, las relaciones a través del cual estos objetivos juegan un papel fundamental en la supresión tumoral por TSC-22 no fueron revelados directamente. En nuestro intento de encontrar una nueva función de TSC-22 en la supresión tumoral, hemos identificado una proteína de unión en una levadura de dos híbridos experimento. Este estudio mostró que TSC-22 se une directamente a p53 (Figura 2A). Se observó además que TSC-22 hasta reguladas los niveles de proteína de p53 sin alterar los niveles de ARNm de p53. TSC-22 sobre-expresión y knock-down experimentos mostraron que TSC-22 facilita la función de p53 como un activador transcripcional de genes diana que pueden inhibir la tumorigénesis (Figura 2C-G). Estos resultados indican que el aumento de los niveles de proteína p53 se asocian con la regulación post-traduccional por TSC-22. interacción TSC22-p53 fue evaluada por
in vivo
ensayos en los que p53 se co-inmunoprecipitó con TSC-22 (Figura 3-4).

La sobreexpresión de la TSC-22 ubiquitinación claramente impedido de p53 por HDM2, que regula el volumen de negocios de p53 a través de su actividad de E3. Varios reguladores que la función de influencia p53 través de la modulación de la interacción HDM2-p53 han sido identificados, incluyendo p14ARF [27], [28], YY1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Numb [ ,,,0],33], y Nucleostemin [34]. . Entre estos reguladores, Numb es más similar a TSC-22 porque Numb se une a p53 y HDM2, evitando de este modo la ubiquitinación y la degradación de p53 [33]

En efecto, hemos detectado un complejo ternario que contiene las tres proteínas: TSC-22, HDM2 y p53. Por lo tanto, TSC-22 no compite con HDM2 para la unión a p53. TSC-22 se une al dominio de unión al ADN de p53, que es esencial para la función de p53. Por lo tanto, queda por determinar si se requiere esta interacción para activar los genes diana de p53 en el núcleo.

Curiosamente, el aumento de la muerte celular y la inhibición de la proliferación por TSC-22 expresión se observó con mayor frecuencia en
420−1.75×A
550)]/(time×volume×A
600).

Co-immunoprecipitation

To

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