Abstract> Objetivo
Los niveles elevados de esterol regulador elemento vinculante proteína-1 (SREBP-1) se han encontrado en el cáncer de endometrio (CE), lo que sugiere que es esencial para el desarrollo de la CE. La obesidad y la diabetes se han establecido como factores de riesgo conocidos de CE, mientras que también se han encontrado polimorfismos SREBF-1 de genes para ser asociado con la obesidad y la diabetes tipo II. Por lo tanto, la hipótesis de que el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen SREBF-1 puede estar asociado con un mayor riesgo de EC.
Método
Se analizó la secuencia de SREBF-1 en muestras de tejido de 30 casos de la CE y 6 controles benignos utilizando método de alto rendimiento. Sobre la base de los resultados primarios, se seleccionaron un SNP (rs2297508) como marcador genético para llevar a cabo un estudio de casos y controles basado en el hospital con 139 casos y 129 controles CE benignos. Las muestras se examinan bajo el microscopio para determinar su histopatología antes del análisis de SNP mediante RT-PCR.
Resultados
A través de análisis de secuencias, encontramos 10 SNPs de SREBF-1 asociado a la CE, incluyendo 3 nuevos SNPs. El catorce por ciento de la CE mostró que el SNP rs2297508 con alelo C, mientras que sólo el 7% tenían el alelo C estaba presente en los controles benignos (p = 0,027, OR = 1.983). Además, el alelo C se asoció con la diferenciación del cáncer (p & lt; 0,05) y la profundidad de la invasión miometrial (p & lt; 0,05).
Conclusión
Nuestro estudio indica que SNP (rs2297508) de SREBF -1 puede servir como un factor de predisposición genética para el desarrollo de la CE y la detección de este marcador genético puede ser útil en la detección precoz
Visto:. Qiu CP, Lv QT, Dongol S, Wang C, Jiang J (2014) polimorfismo de nucleótido único de SREBF-1 gen asociado con un mayor riesgo de cáncer de endometrio en mujeres chinas. PLoS ONE 9 (3): e90491. doi: 10.1371 /journal.pone.0090491
Editor: Kwang-Hyun Baek, Universidad CHA, República de Corea
Recibido: 24 Agosto, 2013; Aceptado: 31 Enero 2014; Publicado: 10 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio se llevó a cabo en el laboratorio cardiovascular del Qi del hospital Lu, de la Universidad de Shandong y fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81072121, 81372808 [JJ] y 81173614 [QTL]), así como la planificación Desarrollo de la Ciencia y Tecnología de Shandong (2011GSF12122 [XZ] y 2012G0021823 [JJ]). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio (CE) es la neoplasia ginecológica más común en el mundo occidental y el cuarto tipo de cáncer más común en las mujeres. La incidencia de la CE ha aumentado un 21% desde 2008, y la tasa de mortalidad ha aumentado significativamente en las últimas dos décadas [1]. La Sociedad Americana del Cáncer estima que 49.500 nuevos casos y 8.200 muertes en 2013 [2]. La etiología de la CE es multifactorial e implica una mayor exposición a factores de riesgo genéticos estrógenos [3] y. Hasta ahora, se ha demostrado que varios SNPs están asociados con un mayor riesgo de CE, como nucleósido difosfato quinasa 1 (nm23-H1; rs16949649 y rs2302254), inhibidor de serpina peptidasa, clade E (PAI-1; rs1799889) y progesterona receptor (PGR; rs11224561) [4] - [6]. Para comprender los factores genéticos de riesgo global y encontrar objetivos eficaces, es necesario identificar los SNPs relacionados.
Proteínas de unión de elementos reglamentarios
de esteroles (SREBPs) son factores de transcripción de la cremallera hélice-bucle-hélice-leucina ( LZ-HLH) de la familia. Tres isoformas de SREBP se han identificado en células de mamíferos: SREBP-1a, SREBP-1c y SREBP-2 [7]. Dos genes (SREBF-1 y SREBF-2) son responsables de expresar estas proteínas de las cuales gen SREBF-1 está localizado en el cromosoma 17 p11.2. Hay una superposición en las vías y las funciones entre los SREBPs individuales, pero la mayoría de los estudios sugieren que SREBP-1 regula principalmente metabolismo de ácidos grasos y SREBP-2 es el principal regulador del metabolismo del colesterol [8]. SREBP-1 regula la homeostasis de los lípidos mediante el control de la expresión de las enzimas limitantes de la velocidad clave necesarias para la síntesis de ácidos grasos y colesterol [9]. lipogénesis aberrante es un rasgo metabólico importante que participa en la rápida proliferación de las células tumorales malignas. Varios estudios han demostrado que las células tumorales son capaces de reactivar la síntesis de lípidos de novo y que expresan niveles elevados de la sintasa de ácidos grasos (FASN) [10], que está regulada por SREBP-1 [11]. De acuerdo con estos hallazgos, SREBP-1 se ha demostrado que tiene una asociación con muchos otros tumores malignos tales como cáncer de mama, cáncer de próstata y el cáncer colorrectal, así como [12] - [15]
A través del mecanismo de. la biosíntesis de lípidos, SREBP-1 se ha propuesto para ser un factor causante de la obesidad [16]. La obesidad, por otro lado se considera responsable de diversos mecanismos que precipitan en la carcinogénesis [7]. A través del mecanismo de resistencia a la insulina, la obesidad induce la secreción de insulina de las células pancreáticas. La insulina a su vez tiene un efecto estimulante sobre SREBP1 [17]. Recientemente, un mayor nivel de SREBP-1 se ha detectado en células EC en comparación con el endometrio normal, y que era más prominente en de grado más alto CE. Además, se encontró desmontables de SREBP1 para reprimir eficazmente la capacidad de proliferación de las células de la CE y el crecimiento del tumor in vitro, lo que indica, además, que SREBP-1 juega un papel importante en la progresión de CE [18].
Para nuestro conocimiento , ningún estudio hasta la fecha ha informado de la posible asociación de SREBF-1 polimorfismo genético con el riesgo de EC. Se postula que el SNP en SREBF-1 podría estar asociado con un mayor riesgo de EC, junto con varios criterios clínicos como el grado patológico, estadio clínico, el tipo histológico, etc. La SNP de SREBF-1 puede servir como factores de predisposición genética para el desarrollo de la CE y la detección de tales marcadores genéticos podría ser de gran valor para una detección más temprana de esta enfermedad.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Los consentimientos informados escritos aprobados fueron compradas a los todos los participantes y las muestras se recogieron con la aprobación del Comité de Ética del hospital de la Universidad de Shandong Qilu.
en nuestro estudio, se realizó un análisis de casos y controles con un total de 139 casos y 129 controles. En primer lugar nos revisaron todo el gen de SREBF-1 en 30 pacientes no relacionados de la CE y 6 controles para identificar los SNPs asociados. Sobre la base de los resultados obtenidos, se optó por un SNP (rs2297508) que fue encontrado en ocho de los treinta pacientes y ninguno de los seis controles y se realizó un estudio de casos y controles con el fin de verificar su asociación con la CE.
Estudio
Un total de 268 candidatos fueron reclutados imparciales estocásticamente. Se recogieron las muestras de espécimen 139 CE y 129 controles benignos sobre la base de sus informes patológicos. Las muestras endometriales de 139 pacientes con cáncer se obtuvieron a través de la resección quirúrgica después de la histerectomía a cabo en el hospital Qilu Departamento de Ginecología. Las muestras de tejido para los controles se obtuvieron de los pacientes con problemas de fertilidad y con patologías benignas como leiyomyomas, adenomiosis, etc. Las muestras individuales se examinaron bajo el microscopio para el diagnóstico patológico para ambos grupos. Los pacientes de la CE se dividieron en dos grupos, 91 sin diabetes y la obesidad y la diabetes con 48 y /o la obesidad y esta información se obtuvo de los registros de los hospitales. Los controles normales con la diabetes o la obesidad (IMC ≧ 28 Kg /m
2) fueron excluidos debido a la posible asociación de SNP (rs2297508) con dos de los trastornos metabólicos como se describe en el estudio de Liu JXet al. [20 ]. Además, los controles no tenían antecedentes conocidos de diabetes, obesidad o cualquier otros tumores malignos en su familia. La edad media de 48 pacientes con obesidad y /o diabetes fue de 53,09 ± 6,7 y el de los 91 pacientes sin diabetes o la obesidad fue 54,36 ± 9,7 (p = 0,196). La edad media de los controles normales (52,46 ± 7,7) fue comparable a la de los 91 pacientes (P = 0,215). Los pacientes de la CE fueron tratados quirúrgicamente en el Hospital Qilu entre 2008 y 2012. Ellos fueron clasificados en endometrioide (tipo I) y no endometrioide (tipo II) CE y los tumores fueron escalonadas de acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia 2009 (FIGO ) clasificación.
preparación de ADN
El espécimen de tejido fresco recogidos se almacenó a -80 ° C de refrigeración. ADN genómico fue extraído de los tejidos usando un kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN extraído se disolvió en tampón TE [10 mMTris (pH 7,8), EDTA 1 mM] y entonces la concentración se midió con una referencia al valor de DO de 260 nm (BIO-RAD SmartSpec Plus). La preparación final se almacenó a -20 ° C para la amplificación PCR. Las amplificaciones se llevó a cabo utilizando una desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, seguido de 30 ciclos con una duración de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C y una extensión final de 10 min a 72 ° DO. Los cebadores directo e inverso fueron 5 'GACCTGAGGCTCCTGTGCTAC 3' y 5 'AAGTCAGTCCATCCTCCCGT 3', respectivamente.
Selección de SREBF-1 puntos polimorfismo
Con el fin de acceder a la información adecuada acerca de la posible asociación de SNPs SREBF en-1 con cáncer de endometrio, lo primero que exhibió todo el gen de SREBF-1 en 30 pacientes no relacionados y 6 controles mediante la técnica de secuenciación de alto rendimiento utilizando PSTAR-II plus (IDN01-M-P2). Los 36 sujetos fueron escogidos al azar y emparejados sobre la base de sus edades. Hemos sido capaces de identificar los 10 SNPs, incluyendo tres nuevos detectados queridos. Todos los resultados se analizaron mediante Pstar II-6.0.4 del software build3. Para el estudio de asociación, se seleccionaron sólo un SNP (rs2297508) en función de su frecuencia alélica que exhibió una relación evidente y significativa de la CEE.
SREBF-1 genotipado
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se utilizó el análisis para determinar el genotipo de SNP (rs2297508) en SREBF-1. Las secuencias de los cebadores para el SNP fueron los siguientes: GF 5 'CTCCCCCAGCACCTACGG 3', CF 5 'CTCCCCCAGCACCTACGC 3' como cebador directo y R5 'CTCCCCACTCCTCCCACTAAC 3' como cebador inverso. El sistema de reacción (20 ul) para RT-PCR incluía 10 ul Todo en Uno qPCR mezcla, 0,4 ul cebador directo F (2 M), 0,4 ul cebador inverso R (2 mM), ADN genómico 2 ul y 7,2 ul ddH2O . El procedimiento de reacción se llevó a cabo en un tiempo real instrumento de PCR (Paso Uno más (ABI)) que se divide en tres etapas: Etapa de mantenimiento a 95 ° C durante 20 s, etapa de ciclo de 40 ciclos cada uno, incluyendo 3 s a 95 ° C y luego 30 s a 60 ° C, la fusión de fase curva a 60 ° C durante 60 s seguido de 95 ° C durante 15 s.
Análisis estadístico
Hardy-Weinberg se realizaron análisis para comparar las frecuencias genotípicas utilizando χ
2 pruebas entre los controles (χ
2 = 1,24, p = 0,26). La comparación de las frecuencias genotípicas entre los pacientes y los controles CE se realizaron con Pearson χ
2 test. También se evaluó la relación entre la distribución de los genotipos de los SNPs SREBF-1 y los criterios clínicos de la CE (divididos sobre la base de la presencia o ausencia de diabetes y obesidad, edad, tipo histológico, clasificación patológica y estadios clínicos). Los análisis se realizaron utilizando el software SPSS computadora (versión 17.0). P & lt; 0,05 se consideró el nivel de significación estadística
Resultados
SNP identificación y genotipado
Nuestra revisión identificó 10 polimorfismos (SNP1 a SNP10), incluyendo 3 sitios nuevos detectados (. Figura 1). Se detectó el alelo C en SNP9 (rs2297508) en ocho de treinta pacientes (26,7%), pero en ninguno de los controles. Otros SNPs detectados mostraron poca diferencia entre pacientes y controles. (Tabla 1) A continuación, se selecciona SNP9 (rs2297508) para su estudio y analizaron todas las muestras experimentales y controles utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Los resultados (GG, GC o CC) fueron analizados por el Paso Uno V2.1 Software. La genotipificación se realizó sobre la base de las curvas de amplificación diferentes observados para diferentes genotipos (Fig. 2) guía
A:. SNPs en SREBF-1 gen. El conjunto SREBF-1gene incluye 22 exones. Diez SNPs (SNP1 a SNP10) se identificaron dentro de la SREBF-1 en nuestro estudio. HIGO. 1 B: ID SNP. SNP1 a SNP10 se enumeran a partir de 5'-3 'de la SREBF-1. "CHR-ID" muestra Identificación del cromosoma diez SNPs en SREBF-1. Listado "RS ID" se ha informado en la UCSC o sitio web NCBI, "-" expresa recién detectado SNP. "Función" columna aparece alteración de la función codificada genéticamente de los SNPs. "Ref SNP" muestra la forma SNP en la secuencia de referencia original. En "ARNm ubicación", correspondientes posiciones de ARNm se mostraron en consonancia con cada SNP. (Para más detalles: los ID de secuencia incluidos en 32.583,1 CCDS). NCBI db está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.
Fig. 2 A, B y C muestran GG, CC y el genotipo GC, respectivamente, como se muestra por los resultados obtenidos por RT-PCR.
Asociación entre rs2297508 SNP y el riesgo de EC
La distribución de alelos de SNP (rs2297508) en SREBF-1 genotipos en los grupos de control es consistente con el equilibrio de Hardy-Weinberg como prueba de χ
2 de prueba (χ
2 = 2,27, p = 0,13). La variación en la distribución de C alelo entre los pacientes y los controles normales de la CE se demostró claramente (P = 0,027). La χ
2 test reveló que los genotipos GC /CC o portadores del alelo C tenían un mayor riesgo de EC (OR = 1.966 y OR = 1,983, respectivamente) en comparación con los portadores de GG o G respectivamente. Los intervalos de confianza de la odds ratio (OR) se utilizó para describir las limitaciones dentro de las cuales los cálculos estimados deben ser válidos. La comparación de las frecuencias genotípicas y alélicas del SNP entre los pacientes y los controles normales de la CE se muestra en la Tabla 2. Los resultados fueron consistentes con nuestro experimento preliminar de alto rendimiento.
Asociación entre rs2297508 SNP y el grado patológico y la profundidad de la invasión miometrial de EC
Hemos tratado de explicar el papel de rs2297508 locus polimórfico de las condiciones coexistentes como la diabetes, la obesidad, así como en diferentes grupos de edades, tipos y grados patológicos patológicos del cáncer , etapas clínicas y la invasión miometrial en pacientes de la CE (Tabla 3). Dado que la diabetes y la obesidad son dos grandes riesgos conocidos por estar estrechamente ligada a CE, y el SNP ser un marcador crucial de la predisposición genética de EC, se podría suponer que no había un efecto potencial de este polimorfismo particular sobre la condición. Dividimos a los pacientes en dos grupos de la CE (con la diabetes o la obesidad y sin). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la frecuencia de alelo fue evidente entre los dos. Otros criterios para dividir los temas en diversos grupos se determinaron de acuerdo con los informes anteriores, así como la significación clínica [4], [5]. Los resultados mostraron que los portadores de la variante SNP C tuvieron grado más alto y más profundo patológica invasión miometrial (OR = 2,042 y OR = 2,233, respectivamente) en comparación con los portadores G. Por otra parte, el /genotipo CC GC y el alelo C se asociaron significativamente con el grado patológico (χ
2 = 4,095, P = 0,043 y χ
2 = 3,893, p = 0,048, respectivamente) y la invasión del miometrio (χ
2 = 4,018, P = 0,045 y χ
2 = 4,170, p = 0,041, respectivamente). Otros criterios como la edad, el tipo y el estadio clínico patológico no mostraron ninguna asociación significativa con el SNP.
Discusión
biosíntesis de lípidos es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular mientras que el aumento de novo la síntesis de lípidos es una característica metabólica común de la carcinogénesis [19]. El aumento de expresión de FASN y LDLR (lipoproteína de baja densidad del receptor) en las células tumorales dan fe de esta declaración [20]. SREBPs pueden regular diferentes enzimas implicadas en ácidos grasos y biosíntesis del colesterol. Además de influir en varias enzimas que participan en la lipogénesis, SREBP también participa en la conversión de andrógenos en estrógenos a través de la reacción de aromatización elevando así el nivel de estrógeno en la circulación. La obesidad también se ha encontrado responsable de la reducción de los niveles de progesterona que tiene un efecto antagonista fuerte sobre la función carcinogénico de estrógeno [21]. Por otra parte, SREBP1 también está asociada con la modulación de la transcripción de la enzima 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 12 (17 β -HSD12) que es responsable de la transformación de la estrona (E1) a una forma más potente, estradiol (E2) [22], [23]. Por lo tanto, podemos deducir es necesario que la actividad de SREBP para el crecimiento del tumor, lo que implica que SREBP desempeña un papel importante en la oncogénesis. Además, el aumento de la expresión aberrante de SREBP-1 se ha encontrado en varios tipos de cáncer, incluyendo CE [18].
En esta investigación hemos postulado que los SNPs en SREBF-1gene tiene potencial papel en la predisposición genética de la CE. Un estudio anterior detecta 19 polimorfismos en SREBF-1 y demostró la asociación entre SREBF 1-polimorfismos y obesidad, así como diabetes de tipo II [19]. Además, los estudios epidemiológicos han confirmado que la obesidad es uno de los principales factores de riesgo de EC mientras polimorfismos SREBF-1 de genes tienen asociaciones con enfermedades metabólicas (diabetes tipo 2 y obesidad) [24]. Otro estudio concluyó que los SNP rs2297508 y rs11868035 en el gen SREBP-1c tienen relaciones con un mayor riesgo de diabetes tipo 2 y la dislipidemia en la población china. El mismo estudio también mostró que el SNP (rs11868035) se asocia significativamente con la resistencia a la insulina (RI) en pacientes diabéticos [25]. Sin embargo, los estudios, lo que demuestra la relación entre SREBF-1 polimorfismos genéticos y cánceres, son raros. Hasta ahora, solamente a Daniele Campa y sus colaboradores han investigado la relación entre los SNPs en SREBF-1 y la oncogénesis del cáncer de mama, pero no se encontraron asociaciones estadísticamente significativas entre los SNPs detectados y el riesgo de cáncer de mama [26]. Por lo tanto, también hemos evaluado aún más nuestra hipótesis de que los polimorfismos genéticos están vinculados con la diabetes y la obesidad, junto con algunos otros criterios clínicos asociados con la CE.
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que examina el papel de SREBF-1 polimorfismos de genes en la CE. En nuestro estudio, hemos encontrado que la distribución del SNP (rs2297508) tenía una demarcación clara entre los pacientes y los controles de la CE benignos. El alelo C en el SNP se asoció con una mayor susceptibilidad a la EC. Por lo tanto, podemos predecir la alta posibilidad de alelo C en el SNP tiene una relación importante con el riesgo de EC y creemos que una mayor exploración podría llevar a los investigadores hacia el desarrollo de una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la CE.
analizar más a fondo la asociación de diferentes características clínicas de los pacientes con EC el SNP. En primer lugar, se evaluó la asociación entre la diabetes y /o la obesidad y genotípica o la frecuencia alélica en los pacientes de la CE. Pero no se encontró significación estadística entre los dos grupos. Es decir, el SNP tiene la misma distribución en pacientes CE, independientemente de la presencia o la ausencia de factores de riesgo como diabetes y la obesidad. Se sugirió que era el metabolismo anormal de los lípidos asociado con el SNP en CE, que es independiente de la diabetes y la obesidad. Por último, comparamos los criterios de edad, tipos patológicos y clínicos etapas, pero no se obtuvieron asociaciones significativas, lo que proporciona evidencia de que no existe una asociación entre el SNP y las características clínicas. Consistencia con el informe presentado por Li W. et al. [21], el alelo C en el SNP mostraron una asociación significativa con tumores de grado alto. Por otra parte, los pacientes con alelo C mostraron un mayor riesgo de desarrollar una invasión miometrial más profundo en comparación con aquellos con G alelo en el locus SNP. Este hallazgo podría ser el resultado de la detección tardía de la enfermedad sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de la influencia de SNP. Puede haber una relación potencial entre el grado patológico del tumor, así como la profundidad de la invasión del miometrio. Sin embargo se necesitan más investigaciones para aclarar este concepto. En resumen, el alelo C parece ser un marcador de un tumor de grado superior y más profunda invasión miometrial en el asunto CE, y por lo tanto podría actuar como un marcador indispensable para ser tomado en cuenta en la evaluación clínica y el tratamiento de la EC en un futuro próximo.
en conclusión, nuestro estudio investigó principalmente la asociación entre el SNP (rs2297508) en SREBF-1 y el riesgo de EC y encontró que el alelo C del SNP es potencialmente un factor de riesgo para EC. Al mismo tiempo, se analizó la asociación del SNP con diferentes criterios clínicos de la CE y los resultados mostraron que los pacientes con mayor frecuencia del alelo C eran más susceptibles de desarrollar tumores de alto grado y invasión profunda del miometrio. Los resultados indicaron que el polimorfismo SREBF-1 podría desempeñar un papel esencial en el aumento de la susceptibilidad genética a la CE. Por lo tanto, suponemos que esto podría ayudar al médico en el diagnóstico clínico de la enfermedad y que también guiará hacia una terapia clínica específica.
En nuestro estudio, hemos empleado secuenciación de alto rendimiento, una técnica fiable con gran exactitud y precisión, 10 para detectar SNPs asociados con la Comunidad, que incluye tres nuevos que podrían ser de importancia para otros estudios en el futuro. Por otra parte, hemos confirmado que el SNP (rs2297508) en SREBF-1 tiene una influencia significativa en la susceptibilidad CE y los criterios clínicos. Sin embargo, nuestro estudio tiene algunas limitaciones. A nivel de objeto, no tenemos datos de estilo de vida tales como la ingesta dietética, actividad física, uso de anticonceptivos hormonales, etc., que puedan incidir en la susceptibilidad de los SNPs a riesgo de las CE. Además, se desconoce si el SNP trabaja en coordinación con otros SNPs en el aumento del riesgo de EC. Los estudios futuros de mayor tamaño de muestra será necesario estudiar la influencia de estos factores sobre la asociación entre el SNP y el riesgo de EC.
Apoyo a la Información
Información S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0090491.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a la doctora Judith A. Strong, Departamento de Anestesiología, Univerisity de Cincinnati College de Medicina por sus comentarios /sugerencia en la preparación del manuscrito.