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PLOS ONE: post-operatorio de plasma osteopontina predice la metástasis distante en humanos colorrectal Cancer


Extracto

Antecedentes

El pronóstico global de cáncer colorrectal (CCR) es insatisfactoria debido a la metástasis del cáncer después de la operación . Este estudio tiene como objetivo investigar la importancia clínica de la osteopontina plasmática (OPN) como niveles mínimamente invasivos, predictivos y biomarcadores sustitutos para el pronóstico de los pacientes con CCR.

Métodos

Este diseño estudio aleatorio consiste en pre Las muestras de plasma-operatorio y post-operatorio de un total de 79 pacientes. Determinamos los niveles plasmáticos de OPN por ELISA y examinamos su correlación con los parámetros clínico de los pacientes con CCR. Los efectos de OPN sobre la CRC metástasis endógenos y exógenos fueron investigados por el examen de los efectos sobre los reguladores de epitelio de transición messenchymal ensayo y la migración.

Resultados

Nuestros resultados demuestran por primera vez la clínica correlación de plasma OPN con metástasis de pacientes con CRC. postoperatorio alto nivel OPN plasma (& gt; 153,02 ng /ml) asociado con el desarrollo de metástasis después de la resección curativa (p & lt; 0,001). Por otra parte, el nivel de OPN en plasma post-operatorio correlaciona con la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con CCR (p = 0,009) y fue un factor independiente para predecir el desarrollo de metástasis en pacientes con CCR después de la resección curativa (p = 0,036). Nuestro
in vitro
modelo mostró que la OPN expresión ectópica induce la migración celular a través DLD1 Caracol y TWIST1 sobreexpresión y la represión E-cadherina, y el aumento de la migración de células secretoras nivel de OPN.

Conclusiones

los resultados del estudio sugieren que OPN plasma post-operatorio correlaciona con la metástasis después de la operación, lo que sugiere que es un biomarcador no invasivo potencial para el desarrollo de futuras metástasis en pacientes con CRC. Además, OPN ha demostrado estar involucrados en el proceso metastásico y por lo tanto la inhibición de OPN es un enfoque terapéutico potencial para el tratamiento de pacientes con CRC

Visto:. Ng L, Wan TM-H, Lam CS-C, Chow AK-M, Wong SK-M, hombre JH-W, et al. (2015) post-operatorio de plasma osteopontina predice la metástasis distante en cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 10 (5): e0126219. doi: 10.1371 /journal.pone.0126219

Editor Académico: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos |
Recibido: 28 Agosto, 2014; Aceptado: March 30, 2015; Publicado: 11-may 2015

Derechos de Autor © 2015 Ng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo [1]. Anualmente, más de 1,2 millones de personas desarrollan CRC a nivel mundial, con más de 600.000 pacientes mueren de la enfermedad en 2008 [2]. Las tasas de incidencia y mortalidad de CRC han disminuido como resultado de la mejora de las pruebas que permiten la detección temprana del cáncer, cuando se puede tratar más fácilmente mediante cirugía y quimioterapia junto con radioterapia [3]. A pesar de los avances en el tratamiento clínico, el pronóstico global de los pacientes con CCR sigue siendo insatisfactoria debido a la metástasis del cáncer. Por lo tanto, es importante desarrollar biomarcadores adicionales con el fin de mejorar el pronóstico de los pacientes con CRC por predicción o la detección temprana de metástasis ocultas.

basados ​​en sangre, mínimamente invasivos marcadores habría aumento importante en la detección y el seguimiento de CRC pacientes con CCR. El antígeno carcinoembrionario (CEA) y CA19-9 se han evaluado comúnmente en pacientes con CRC, pero con resultados variables dependiendo del diseño del estudio y la población de estudio [4], y su asociación clínica con la metástasis del cáncer no se han demostrado hasta el momento. Aunque numerosos biomarcadores están en proceso de evaluación para la detección de CRC a partir de suero, ninguno de ellos tiene la suficiente sensibilidad y especificidad para ser considerado en las directrices actuales [4].

La osteopontina (OPN) es una glicoproteína secretada con un multi estructura y funciones características de una proteína extracelular -domain [5]. Se trata de una pequeña unión a integrina ligando
N
glicoproteína -vinculada (hermanos) que se une a receptores de la superficie celular incluyendo integrinas y CD44 [6]. OPN se expresa en muchos tejidos y se secreta en los fluidos corporales, incluyendo la sangre, la leche y la orina [7-9], que tiene importantes papeles fisiológicos en la remodelación ósea, la respuesta inmune y la inflamación [10]. También es una proteína asociada a tumor y niveles elevados de OPN están asociados con la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis a través de la actividad alterada de metaloproteinasas de la matriz, el receptor del factor de crecimiento epidérmico y PI3K-AKT señalización [11, 12]. Estos estudios preclínicos sugieren que la OPN en plasma podría ser un biomarcador no invasivo importante de metástasis sistémicas ocultas. De acuerdo, en un reciente meta-análisis de más de 228 publicaciones, los niveles de OPN alta tumorales o plasma correlacionan con una menor supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global en múltiples tipos de tumores, incluyendo el cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de hígado [13].

el aumento de los niveles de ARNm y proteínas de OPN se ha demostrado en el CCR en comparación con el tejido no tumoral [14-17], y la alta expresión correlacionada con características metastásicas como la metástasis de los ganglios linfáticos y metástasis a distancia [17]. Sin embargo, Nitsche
et al
's estudio que investigó más de 200 pacientes con cáncer de colon en estadio II demostró que el nivel de tejido tumoral de osteopontina era útil para detectar la presencia de cáncer de colon, pero no para predecir el pronóstico de la pacientes [18]. Estos estudios sugirieron que el nivel de tejido OPN aún no era confirmativo para detectar o predecir CRC metástasis. nivel de OPN sangre ha sido sugerido como un posible biomarcador detective de CRC, sin embargo, su correlación clínica con el CRC metástasis no se ha demostrado hasta el momento. Además, la mayoría de los estudios de cáncer se centró en la importancia clínica de nivel OPN plasma antes de la operación, mientras que el nivel post-operatorio en pacientes con cáncer rara vez se ha investigado. Por lo tanto, en este estudio, examinaremos el significado clinicopathogical, así como el potencial pronóstico de los niveles de OPN en plasma pre-operatorio y post-operatorio de pacientes con CRC.

Materiales y Métodos

Pacientes y especímenes

el protocolo de recogida de muestra humana ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Hong Kong, y toda la investigación clínica se ha llevado a cabo de acuerdo con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Consentimiento informado, se ha obtenido de los participantes. muestras de sangre antes de la operación se obtuvieron de 96 pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica de CRC primaria en el Departamento de Cirugía, Hospital Queen Mary, Universidad de Hong Kong, entre 1998 y 2007. Las muestras de tejido se obtuvieron de 32 de los 96 pacientes, inmediatamente congelados en nitrógeno líquido y se mantiene a -80 ° C hasta su análisis. La sangre en el postoperatorio se obtuvo de los pacientes durante su post-operatorio visita de seguimiento a nuestra clínica (por lo general dentro de los 6 meses después de la operación quirúrgica). La sangre fue anticoagulada por EDTA y después se centrifugó a 2500 rpm durante 10 min. Se recogió el plasma, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 ° C hasta su uso. datos y CEA en la sangre nivel clínico-patológico se obtuvieron de la base de datos de pacientes de nuestro hospital.

Enzima ensayo de inmunoabsorción ligado

niveles plasmáticos de OPN OPN o el nivel de secreción de CRC líneas celulares se midieron utilizando un kit comercial ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (amp I +; D Systems, Inc., Minneapolis, MN) y 100 l de diluido (1: 125) las muestras de plasma /200 l de medios de cultivo celular diluida. Las placas se recubrieron durante la noche en primer lugar con anticuerpo de captura de OPN. Después de tres lavados con PBS-0,5% de Tween 20, las placas se bloquearon con 1% de BSA en PBS filtrada durante 1 hora. 0,1 ml de cada muestra se añadió a la placa y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de la adición de 100 l de anticuerpo biotinilado OPN y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se añadieron 100 l de solución de estreptavidina conjugada con rábano picante y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 100 l de solución de sustrato de tetrametilbencidina y se incubaron durante 5 minutos en la oscuridad, seguido por la adición de 50 l de solución de parada. La absorbancia se midió a 450 nm con la corrección de longitud de onda a 570 nm.

extracción de RNA y DNasa I tratamiento

El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol y Purelink RNA mini kit (Life Technologies, Carlsbad, CA ). Brevemente, se homogeneizó 50-100 mg de muestra de tejido congelado en 1 ml de reactivo Trizol usando un homogeneizador, mientras que las células adherentes en placa de cultivo se lisaron directamente mediante la adición de 1 ml de reactivo Trizol, pipeteando los lisados ​​varias veces, y la transferencia a un 1,5 estéril tubo de centrífuga ml. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, 0,2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo Trizol utilizado fue añadido y el tubo se agitó vigorosamente a mano durante 15 s. Después de 3 min-incubación, la muestra se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min. La fase acuosa superior incolora se transfirió a un nuevo tubo estéril y se añadió un volumen igual de 70% de etanol y la mezcla se mezcló bien. La muestra se transfirió a un cartucho de giro y se centrifugó a 12.000 x g durante 15 segundos a temperatura ambiente, seguido de la etapa de lavado con 700 l de tampón de lavado I una vez y 500 l de tampón de lavado II dos veces. El cartucho de giro se secó por centrifugación a 12.000 x g durante 1 min. 30 l de agua RNased-Free se añadió al cartucho de centrifugado, se incubaron durante 1 min y el ARN se eluyó en un nuevo tubo de centrifugación a 12.000 x g durante 2 min. El ARN se procedió a la DNasa I digestión mediante la adición de 3 l de 10X tampón de ADNasa I y 3 l DNased I, grado de amplificación (Life Technologies) a 24 l muestra de ARN. Después de 15 min-incubación a temperatura ambiente, el ARN se purificó usando Purelink RNA mini kit (Life Technologies). Brevemente, se añadió 1 volumen de tampón de lisis recién preparado con 2-mercaptoetanol (10 l por tampón de lisis 1 ml) y un volumen de etanol absoluto para cada muestra de ARN y se mezcla bien. La muestra se transfirió a un cartucho de giro y se centrifugó a 12.000 x g durante 15 segundos a temperatura ambiente, seguido de la etapa de lavado con 700 l de tampón de lavado I una vez y 500 l de tampón de lavado II dos veces. El cartucho de giro se secó por centrifugación a 12.000 x g durante 1 min. 30 l de agua RNased-Free se añadió al cartucho de centrifugado, se incubaron durante 1 min y el ARN se eluyó en un nuevo tubo de centrifugación a 12.000 x g durante 2 min. El rendimiento y la calidad del ARN se analizaron por NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

síntesis de cDNA y cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa

2.0 g ARN total fue inverso-transcrito con SuperScriptII RT-PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó en un volumen final de 15 l que contenía 1,5 l RT transcripción, 0,2 mM de cada cebador, tinte de referencia 1X ROX y 7,5 l de FastStart universal SYBR Green Master (ROX) (Roche Diagnostics, Suiza, Basilea). Un control de transcripción de RT se incluye para cada gen para asegurar que la señal fue verdaderamente impulsado por la amplificación del gen diana. El primer secuencias fueron los siguientes: OPN-Cebador: 5'-3-TGGGGGTCACTGCAATTAG, OPN-Cebador inverso: '5' TGGGGCTAGGAGATTCTG-3 '; E-cadherina-Cebador: 5'-TGGAGGAATTCTTGCTTTGC-3 '; E-cadherina-Cebador inverso: 5'-CGTACATGTCAGCCAGCTT-3 '; Caracol-Cebador: 5'-CAGACCCACTCAGATGTCAA-3 ', Caracol-Cebador inverso: 5'-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3'; TWIST1-Cebador: 5'-GGGAGTCCGCAGTCTTAC-3 ', TWIST1-Cebador inverso: 5'-CCTGTCTCGCTTTCTC-TTT-3'; GAPDH- Cebador: 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG -3 ', GAPDH- Cebador inverso: 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA -3'. PCR en tiempo real se llevó a cabo usando el Sistema de ABI 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster, CA) a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y a 56 ° C para 1 minuto. Cada ensayo se realizó por triplicado, se calculó el promedio y el nivel de expresión de ARNm diana se expresó como veces a la expresión de GAPDH. Para los experimentos de línea celular, pliegue de cambio se calcula a partir del cambio en la abundancia de transcripción de interés (normalizado a GAPDH) del grupo experimental en comparación con la abundancia de transcripción de interés (normalizado a GAPDH) del grupo de control.

construcción de plásmidos

OPN secuencia codificante de longitud completa se amplificó por OPN-
Kpn I-
cebador CGGGGTACCGTGCCAGCCAAACAACAAA y OPN-XbaI-cebador inverso TGCTCTAGATGCAAAGTGAGAAATTGTATTT, utilizando Platinum
Taq
ADN polimerasa de alta fidelidad (vida Technoloies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ciclo de PCR fue de 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 2 min. El producto OPN PCR se purificó por el sistema de purificación Qiagen PCR (Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector pcDNA3.1 (Invitrogen) y OPN purificó productos de PCR fueron digeridos por
Kpn I y

Xba
enzimas de restricción I (New England Biolabs), se purificó y se ligó por ligasa de ADN (New England Biolabs). El producto de ligación se transformó en células competentes DH5a (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos fueron extraídos por el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) fidelidad secuencia se confirmó mediante secuenciación de ADN.

líneas celulares, cultivo de tejidos, transfecciones y reactivos

CRC líneas celulares se mantuvieron en DMEM con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5% de CO
2 a 37 ° C. células DLD1 y SW480 fueron transfectadas transitoriamente con control de vector o plásmido de expresión de OPN usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. DLD1-OPN1 y de control de vectores clones estables se generaron por selección en medio de cultivo que contiene 1 mg /ml de G418 (Roche) durante 3 semanas. células HCT116 y SW620 fueron transfectadas transitoriamente con ARNsi de control negativo o oligonucleótidos OPN siRNA (Invitrogen) usando Lipofectamine 3000 reactivo (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

extracción de proteínas y análisis de transferencia Western

Cell -lines se cosecharon, se recogió y se lisaron en tampón RIPA (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA) que contiene 1 mmol /L de fluoruro phenoylmethylsulfonyl durante 1 hora en hielo. El lisado se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo estéril. La concentración de proteína se determinó usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). proteína lisada se suspendió en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio, hervido, resuelto en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y se transfirió a membranas de PVDF (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los anticuerpos contra la E-cadherina y GAPDH (para la normalización) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Se muestran transferencias de Western representativas de experimentos que se repitieron 3 veces. Densitonmetry se realizó en las transferencias de Western utilizando el software ImageJ.


In vitro
migración y la invasión de ensayo

Las células se recogieron, se resuspendieron en medio libre de suero y se sembraron en transwell cámara (Corning o BD Biosciences). Doscientos cincuenta microlitros de una suspensión de 50.000 células en medio libre de suero se añadieron a la cámara superior que se colocó en una placa de 24 pocillos con la parte inferior llena con 750 l de medio completo como un quimioatrayente. Después de 3 días el número de células migradas se determinó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada experimento se realizó por duplicado, y los resultados se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.

El análisis estadístico

La asociación de los niveles plasmáticos de OPN con variables continuas se probó con la correlación de Pearson. Se aplicó la prueba t de Student para comparar las diferencias entre los dos grupos. Las diferencias en las tasas de recurrencia en diferentes grupos de pacientes con CCR se evaluaron mediante la prueba exacta de Fisher. supervivencia libre de enfermedad se analizó mediante el método del producto límite de Kaplan-Meier y log-rank test. Univariantes y multivariantes en un modelo de riesgos proporcionales de Cox se realizaron para predictores pronósticos. Todos estos análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, San Jose, CA, EE.UU.) o el paquete estadístico SPSS 10.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La significación estadística se estableció en p ≤ 0,05.

Resultados

Comparativa de nivel de OPN plasma entre los donantes sanos y pacientes con CRC

primero se determinó el nivel de OPN plasma de 56 donantes normales y 83 pacientes con CRC antes de la resección quirúrgica de los tumores. El nivel medio de OPN plasma de pacientes con CRC era 160.31 ng /ml, que fue significativamente mayor que el de los donantes normales (115.27 ng /ml; p & lt; 0,001). Hemos dividido aún más a los pacientes en estadio temprano (estadio I a II, n = 45) y etapa avanzada (estadio III a IV, n = 38). El nivel de OPN media en plasma de pacientes en etapa de avance (187,91 ng /ml) fue significativamente mayor que el de los donantes normales (p & lt; 0,001), mientras que el nivel de los pacientes en fase inicial (137,00 ng /ml) era insignificantemente mayor (p = 0,052). Estos resultados sugieren que la OPN en plasma podría ser un biomarcador no invasivo para la detección de pacientes con CRC estadio tumoral avance, pero su sensibilidad en la detección de pacientes disminuyeron etapa CRC tempranas.

Correlación del nivel de OPN en plasma pre-operatorio con OPN transcripción expresión y clinicopathological parámetros

a continuación examinó la correlación entre el nivel de OPN en plasma pre-operatorio y el nivel de transcripción de OPN tumoral emparejados en 32 pacientes con CCR. Como se muestra en la figura 1A, hubo una correlación positiva entre el nivel de OPN en el plasma y el tumor de CRC (R = 0,452, p = 0,0010), lo que sugiere que el nivel de OPN en plasma en pacientes con CRC era indicativo de su expresión CRC OPN. A continuación, examinó la correlación de los niveles de OPN en plasma pre-operatorio de 83 pacientes con CCR con sus datos clínico-patológicos (Tabla 1). nivel plasmático de OPN no se correlacionó con la edad, el género y la metástasis de los ganglios linfáticos. Significativamente se detectó alto nivel de OPN plasma en pacientes con el tamaño del tumor de más de 5 cm (180,4 frente a 140,7 ng /ml, p = 0,003; 1C), etapa superior (187,9 frente a 137,0 ng /ml, P & lt; 0,001; Fig 1D) y metastásico CRC (197,0 frente a 148,7 ng /ml, p = 0,003; Fig 1E). El nivel de OPN plasma antes de la operación también se correlacionó positivamente con el tamaño del tumor (R = 0,390, p & lt; 0,001; figura 1B). Estos resultados revelaron que el plasma antes de la operación OPN fue un biomarcador no invasivo potencial de progresión tumoral y la metástasis. También se examinó si el nivel de OPN en plasma pre-operatorio correlacionada con la futura metástasis de pacientes con CRC que no mostró metástasis a distancia en funcionamiento. Nuestros resultados mostraron que tal nivel no mostró diferencias significativas entre los pacientes con y sin metástasis futuro (132,09 vs 130,63 ng /ml, p = 0,951; figura 1F)., Que indica que el nivel OPN plasma antes de la operación no era de pronóstico para el futuro metástasis

(
Un
) correlación de los niveles de OPN en plasma antes de la operación con el nivel de transcripción de OPN tumoral emparejados en 32 pacientes con CRC (R = 0,452, p = 0,010; correlación de Pearson). (
B
) Correlación de nivel OPN plasma antes de la operación con el tamaño del tumor (R = 0,390, p & lt; 0,001; correlación de Pearson). (
C
) Comparación de los niveles preoperatorios de OPN en plasma en pacientes con tumores mayores de 5 o & lt; 5 (p = 0,003; prueba t de Student) (izquierda). (
D
) Comparación de los niveles de OPN en plasma preoperatorios en pacientes con estadio inferior (I y II) o superior (III-IV) (p & lt; 0,001; prueba t de Student). (
E
) Comparación de los niveles de OPN en plasma preoperatorios en pacientes con o sin metástasis a distancia (p = 0,003; prueba t de Student). (
F
) Comparación de los niveles de OPN en plasma preoperatorios en pacientes con o sin metástasis postoperatorio (p = 0,951; prueba t de Student). Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Significado clínico de los niveles de OPN en plasma post-operatorias

A continuación estudiamos el valor pronóstico de los niveles de OPN en plasma después de la operación de el desarrollo de metástasis después de la operación en otra cohorte de 89 pacientes de CRC. 40 de ellos desarrollaron metástasis después de la operación dentro de los 30 meses, y estos pacientes muestran niveles significativamente más altos de OPN en plasma post-operatorio de los 49 pacientes no metastásicos (187,0 vs 145,7 ng /ml, p = 0,004; Figura 2A). Aplicando el nivel global media postoperatoria de OPN en plasma (153.02 ng /ml) de los pacientes con CCR en este estudio como el valor umbral, CRC pacientes con alto nivel de OPN en plasma después de la operación eran más propensos a desarrollar metástasis a distancia (29 de las 45 pacientes) que aquellos con bajo nivel de OPN en plasma post-operatorio (11 de 44, p & lt; 0,01; figura 2B). Para ilustrar el rendimiento de la OPN plasma post-operatorio como biomarcador predicción, se construyó la curva ROC. El área bajo la curva (AUC) de la curva ROC fue de 0,711 (Figura 2C; IC del 95%: 0,601-0,821), y la sensibilidad y especificidad fueron 0,700 y 0,694, respectivamente

(
A
) Comparación de los niveles de OPN en plasma post-operatorio en pacientes con o sin metástasis postoperatorio (p = 0,004; prueba t de Student). (
B Opiniones) Las tasas de incidencia de metástasis postoperatorio en pacientes con CCR con elevada (≥153.02 ng /ml) o baja (& lt; 153.02 ng /ml) después de la operación el nivel de OPN en plasma. curva (C) ROC usando el nivel de OPN en plasma post-operatorio para discriminar pacientes con metástasis post-operatorio de los que no tienen metástasis post-operatorio. (D) La correlación de OPN en plasma después de la operación con la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con CCR (p = 0,009; prueba de log-rank). Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Comparación de importancia pronóstica entre OPN plasma y sangre CEA

Para confirmar que el nivel de OPN en plasma post-operatorio fue un factor pronóstico importante para el futuro metástasis, se examinaron los valores pronósticos de nivel de OPN en plasma nivel de OPN en plasma post-operatorio y pre-operatorio para la supervivencia libre de enfermedad (DFS) de 44 en estadio I o III de pacientes con CRC operación minuciosa y seguimiento de la información. Los pacientes en estadio IV CRC donde la metástasis distal puede estar presente antes de la cirugía fueron excluidos de este análisis. Como se muestra en la figura 2D, los pacientes de CRC con nivel OPN plasma post-operatorio inferior mostraron una significativamente más larga DFS que aquellos sobre el nivel de umbral (p = 0,009), mientras que antes de la operación nivel OPN plasma no se correlacionó con DFS de pacientes con CRC (S1 Higo). También examinamos el valor pronóstico de los niveles de CEA (S1) Fig. Ninguno de los dos pre-operatoria ni postoperatoria CEA correlacionada con DFS (p = 0,235 y 0,410, respectivamente).

Los factores de riesgo para la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes de CRC

Se aplicaron los análisis univariados y multivariados para determinar los factores de riesgo para la DFS de los 44 pacientes con CRC anteriores (Tabla 2). Entre los factores clínicos examinados en el análisis univariado, único nivel de OPN en plasma post-operatorio se correlacionó significativamente con la DFS. Además, nuestro análisis multivariante mostró que después de la operación de OPN nivel y la metástasis de los ganglios linfáticos fueron factores de riesgo para la DFS.

efecto in vitro de transcripción elevada y niveles de OPN OPN secretoras

Por último , se investigó el
in vitro
efectos de la sobreexpresión de OPN en el nivel de secreción de OPN y función metastásica de las células de CRC. primero se compararon los niveles de transcripción y secreción de OPN de dos líneas de células relativamente no metastásicos DLD1 y SW480, y dos líneas de células metastásicas SW620 y HCT116 [19, 20]. Después de 3 días, ambos niveles fueron significativamente inferiores para DLD1 y las células SW480 cuando se compara con SW620 y células HCT116 (Fig 3A y 3B), lo que sugiere que el nivel de OPN transcripción correlacionado con su nivel de secreción, y el alto nivel de OPN correlacionan con el potencial metastásico de CRC Células. A continuación de forma estable overexpressed OPN en células DLD1 y generan dos transfectantes de OPN estables (DLD1-OPN#1 y DLD1-OPN#3), ambos expresados ​​mayor nivel de OPN transcripción, proteína y proteína secretora que el control DLD1-vector (Figs 3C, 3E y 4A). Se determinó el efecto sobre la proliferación, la invasión celular y la migración celular. Nuestros resultados mostraron que OPN sobreexpresión induce significativamente la migración celular en las células DLD1 (Fig 4B), pero no alteró la capacidad de tasa de crecimiento y la invasión de células (S2 Fig). Para confirmar el efecto de OPN sobre la migración celular, transitoriamente derribo OPN expresión en DLD1-OPN clon estable mediante la técnica de siRNA. En comparación con las células transfectadas de control siRNA, células DLD1-OPN transfectadas con siOPN muestran significativamente menor nivel de OPN transcripción y proteínas, así como proteínas de secreción de OPN (figuras 3D, 3E y 4D). Más importante aún, la tasa de migración también fue reprimida significativamente después siOPN transfección (figura 4E), el fortalecimiento de la función reguladora de OPN sobre la migración celular. Además, se analizó el efecto del nivel de OPN secretora sobre la migración celular mediante la aplicación de un medio de cultivo de DLD1-OPN clones estables o control de vectores (1: 1 mezclado con medio de cultivo fresco) como quimioatrayente para el ensayo de migración celular usando células DLD1 como modelo. Se encontró que el medio de cultivo con alto nivel de OPN inducida significativamente la migración de células DLD1 (Figura 4C). Además, la migración de células DLD1 fue significativamente afectada usando medio de cultivo de células transfectadas siOPN DLD1-OPN#1 en comparación con la de las células transfectadas siCTL (Fig 4F).

(
A y B
) Comparación de (
Un
) transcripcional y (B) los niveles de secreción de OPN de dos líneas de células débilmente metastáticas (CRC DLD1 y SW480) y dos CCR metastásico líneas celulares (HCT116 y SW620) (ANOVA de una vía) .
(C)
OPN expresión de mRNA de dos clones DLD1-OPN estables (DLD1-OPN#1 y#3) y el control de vectores (DLD1-Vector) y el efecto de la sobreexpresión estable de OPN en la expresión del ARNm de los reguladores de la EMT E -cadherin, Twist and Caracol (ANOVA de una vía).
(D)
OPN expresión de ARNm de siCTL o siOPN transfectadas DLD1-OPN#1 en las células y el efecto de OPN siRNA sobre la expresión de ARNm de los reguladores de la EMT E-cadherina, Twist and Caracol (prueba t de Student).
(E)
Efecto de la sobreexpresión de OPN o siRNA en la expresión de la proteína E-cadherina. GAPDH sirvió como control de carga. Densitometría se realizó en las transferencias de Western utilizando el software ImageJ y un asterisco indica la diferencia fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con el control (DLD1-V1 o DLD1-OPN1 siCTL; Una forma ANOVA o t-test de Student). Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes.

(
Un
) Comparación de los niveles de secreción de OPN relativas de dos clones estables DLD1-OPN (DLD1-OPN#1 y#3) con la de control de DLD1-vector (Una forma ANOVA). (
B Opiniones) Comparación de la cantidad de DLD1-OPN clones estables (DLD1-OPN#1 y#3) células migraron con la de las células control DLD1-vector (ANOVA de una vía). (
C
) Comparación de la cantidad de células DLD1 migradas usando medio de cultivo de DLD1-OPN clones estables (DLD1-OPN#1 y#3) o DLD1-vector de control como quimioatrayente (Una forma ANOVA). (
D
) Comparación de los niveles de secreción de OPN relativas de DLD1-OPN#1 clon estable transfectadas con siRNA control (siCTL) o OPN siRNA (siOPN) (prueba t de Student). (
E
) Efecto de siCTL o transfección de OPN siRNA sobre la migración de DLD1-OPN#1 en las células estables (prueba t de Student). (
F
) Comparación del número de células migradas DLD1 utilizando medio de cultivo de DLD1-OPN clones estables transfectadas con siCTL o siOPN como quimioatrayente (prueba t de Student). Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Además, nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión de OPN en las células DLD1 induce significativamente la transcripción de Caracol y Twist, que son inductores de la transición epitelio-mesenquimal a (EMT), proceso por abajo de la regulación de la e-cadherina y la promoción de la migración celular, invasión y metástasis [21-23]. Como era de esperar, los niveles de transcripción y proteínas de la E-cadherina se redujeron significativamente en DLD1-OPN clones estables (figura 3C-3E). Por otro lado, a raíz de siOPN transfección, la transcripción de caracol y de la torcedura se reprimidos, y resultaron en la elevación de la transcripción E-cadherina y la traducción (Fig 3D y 3E). Estos resultados sugieren que la inducción del proceso de EMT es responsable de la migración celular mejorada de células DLD1 OPN-overexpressing.

Discusión

El pronóstico global de los pacientes con CRC sigue siendo insatisfactoria debido a la metástasis del cáncer, por lo tanto, es importante desarrollar biomarcadores adicionales con el fin de mejorar el pronóstico de los pacientes con CRC por predicción o la detección temprana de metástasis ocultas. marcadores basados ​​en sangre, mínimamente invasivos, siendo de aumento importante debido a la facilidad y comodidad de la recogida de muestras. CEA y CA 19-9 en la sangre han sido evaluadas comúnmente en pacientes con CRC, pero con resultados que varían en función del diseño del estudio y la población de estudio [4], y su asociación clínica con la metástasis del cáncer es deficiente. Por lo tanto, creemos que el desarrollo de biomarcadores basados ​​en la sangre adicional sería crucial para mejorar el pronóstico de los pacientes con CCR metastásico.

El aumento de los niveles de ARNm y proteínas de OPN se ha demostrado en el CCR en comparación con el tejido no tumoral [ ,,,0],14-17]. OPN expresión está regulada por una amplia variedad de estímulos que están asociados con la progresión y la metástasis CRC [24-27], que implica rutas reguladoras complejas. Diversos factores de crecimiento y diferenciación también aumentan la expresión de OPN, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante-β, proteínas morfogénicas óseas y citoquinas inflamatorias [28]. Además, la transcripción de OPN está también directamente activado por un número de reguladores transcripcionales, incluyendo Wnt de señalización y Tcf-4 [28], que es una vía desregulado conocido promoción de CRC. En presencia de β-catenina, Tcf-4 coopera para estimular la OPN promotor de activación y la producción de proteína [29]. Creemos que la activación de estos factores y vía de señalización durante la progresión tumoral CRC induce la expresión de OPN y la posterior metástasis de las células de cáncer.

Plasma OPN es un potencial marcador de pronóstico no invasivo para la progresión tumoral, invasión y metástasis en gastrointestinal tipos de cáncer [30]. Mientras nivel OPN alta plasma se ha asociado con características metastásicas en una variedad de cánceres, tales como cáncer gástrico [31], carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas de esófago [32], carcinoma de células renales [33], cáncer de próstata [34] y el cáncer de mama pacientes [35], su correlación con CRC metástasis no se ha demostrado hasta el momento.

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