Extracto
La disfunción de Paneth y células caliciformes en el intestino contribuye a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la colitis -asociado cáncer colorrectal (CAC). Aquí, se presenta un papel para el NAD
+ - dependiente de SIRT1 deacetilasa de histonas en el control de la defensa anti-bacteriana. Los ratones con una específica intestinal
Sirt1
deficiencia (
Sirt1
int - /-
) tener más de Paneth y células caliciformes con la consiguiente reorganización de la microbiota intestinal. Desde un punto de vista mecanicista, los efectos sobre la maduración de las células de ratón intestinal están mediados por los cambios SIRT1 dependiente en el estado de acetilación de SPDEF, un regulador maestro de Paneth y células caliciformes. Nuestros resultados sugieren que la orientación SIRT1 puede ser de interés en el tratamiento de la EII y el CAC
Visto:. Lo Sasso G, Ryu D, L Mouchiroud, Fernando SC, Anderson CL, Katsyuba E, et al. (2014) La pérdida de la función intestinal Sirt1 Mejora Antibacteriano Defensa y Protege de cáncer colorrectal inducida por la colitis. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10.1371 /journal.pone.0102495
Editor: Salvatore Papa, Instituto de Hepatología - Birkbeck, Universidad de Londres, Reino Unido
Recibido: 20 de mayo de 2014; Aceptado 19 de junio de 2014; Publicado: 11 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Lo Sasso et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. GLS está soportado por un saliente Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) /Marie Curie. JA laboratorio KS es apoyado por becas de la Escuela Politécnica Federal de Lausana, el programa Ideas de la UE (ADG-231138), la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31003A-140780 y 310030-143.748), la Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 y KFS-2809-08-2011), y el NIH (R01AG043930). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Paneth y células caliciformes son células epiteliales intestinales altamente especializados que sintetizan y secretan péptidos y moco anti-microbianos. Estos factores representan la primera línea de defensa contra los patógenos y son esenciales para mantener el equilibrio sutil entre las diferentes especies de bacterias que colonizan el intestino de los mamíferos [1]. impacto microbiota Dysbiotic sobre la salud del huésped y contribuir a la patogénesis de varias enfermedades intestinales, tales como enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y el cáncer colorrectal colitis asociada (CAC) [2].
La diferenciación y la maduración de Paneth y células caliciformes es controlada por las cascadas de señalización Wnt y Notch que cooperan para promover la especificación de los diferentes linajes de células [3]. Por otra parte, la SAM señaló dominio que contiene el factor de transcripción ETS (SPDEF), un efector aguas abajo de ambas vías de Wnt y Notch, es conocido para mejorar la diferenciación tanto de Paneth y células caliciformes de su progenitor común [4]. SPDEF fue inicialmente identificado como un regulador del antígeno específico de la próstata [5], pero más tarde también se asocia a mama, pulmón, y el epitelio intestinal, con posible implicación en la progresión del cáncer en los tejidos [6], [7].
SIRT1 (SIRT1), un NAD
+ - desacetilasa dependiente de [8], que está involucrado en una amplia gama de procesos celulares incluyendo el metabolismo, la proliferación celular y la apoptosis, y la respuesta inmune [9]. El papel de SIRT1 en la regulación de la homeostasis intestinal sólo se está empezando a ser dilucidado. Recientemente se ha propuesto una participación de SIRT1 intestinal en ácidos biliares y el colesterol metabolismo sistémico [10]. Además, los estudios que se centran en el papel de SIRT1 en el desarrollo del cáncer colorrectal mediante Apc
min /+ ratones como modelo, mostraron resultados contradictorios de apoyo tanto del tumor promover [11] y el supresor de tumores [12], [13] funciones.
Utilizando ratones con una intestinal específica
Sirt1
deleción (
Sirt1
int - /-
), se muestra aquí que la SIRT1 regula Paneth y cubilete maduración de las células y la producción de proteínas anti-bacterianas. Estos efectos dependen de los cambios en SIRT1 mediada en el estado de acetilación de SPDEF. Por otra parte, intestinales
Sirt1
eliminación tiene un impacto importante en el microbioma intestinal y protege a los ratones de la EII y CAC. En particular, los efectos de
Sirt1
deficiencia en la producción de proteínas antibacterianas son conservadas evolutivo en
C.elegans
destacando el carácter antiguo de esta función de SIRT1. Tomados en conjunto nuestros resultados sugieren que la orientación SIRT1 puede ser de interés para el tratamiento de la EII y el CAC
Materiales y Métodos
Generación de Sirt1
Int. - /- Y Sirt1
int - /- LGR5
ratones EGFP-IRES-CRE-ERT2
Para la generación de
Sirt1
floxed (
Sirt1
L2 /L2
) ratones, ADN genómico que abarca el
Sirt1
locus se amplificó a partir de la cepa 129Sv por PCR de alta fidelidad. Los fragmentos de ADN resultantes se ensamblan en el vector de orientación del Institut Clinique de la Souris (Estrasburgo, Francia). La construcción en la que los exones 5, 6 y 7 estaban flanqueadas por sitios LoxP continuación, se sometió a electroporación en células madre embrionarias 129Sv (ES) (Figura S1B). Se seleccionaron las colonias resistentes a G418 y se analizaron para la recombinación homóloga mediante PCR y los clones positivos se verificaron mediante la hibridación de transferencia de Southern. clones de células ES correctamente dirigidos fueron inyectadas en blastocistos y se transfirieron a hembras pseudopreñadas, lo que resulta en la descendencia quimérica que se acopla a hembra C57BL /6J que expresan la recombinasa Flp bajo el control del promotor de citomegalovirus ubicua [14]. Descendencia que transmite el alelo mutado y que perdió el transgén Flp (
Sirt1
L2 /WT
ratones) a continuación fueron seleccionados, y backcrossed a los ratones C57BL /6J durante diez generaciones. Para el análisis de la microbiota intestinal Sirt1
int - /- y Sirt1
L2 /L2 fueron co-alojados en condiciones libres de patógenos específicos dentro de la misma habitación. Los ratones tratados con OMA /DSS fueron alojados individualmente después del destete para evitar diferencias en la ingesta de DSS. Sin embargo, Sirt1
int - /- y Sirt1
L2 /L2 fueron tratados en condiciones libres de patógenos específicos dentro de la misma habitación. En particular, Sirt1
int - /- y Sirt1
L2 /L2 ratones provienen de los mismos padres. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y suizos y aprobados por las autoridades cantonales del Cantón de Vaud. Por otra parte, todos los experimentos con animales se ajustaban a la legislación suiza Bienestar Animal y revisados por la Junta de Ética Estado del Cantón de Vaud (Animal Welfare Act 2005; Licencia N ° Proyecto 2463-2463.1-2605 licencia para el profesor Johan Auwerx). Por último, todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Estado independiente de la junta ética oficina Veterinaria Vaud, que actúa de conformidad con la Ley de Protección de los Animales, las directrices internacionales de la AAALAC, la legislación suiza y de la UE. Los ratones se sacrificaron mediante una breve exposición a CO
2. Este método conduce a la asfixia rápida y sin dolor en ratones. Todos los experimentos se llevaron a cabo a partir de octubre de 2011 y abril de 2014.
Los plásmidos
vector de expresión de mamífero PUSE-SIRT1 se adquirió de Upstate. La secuencia de codificación SPDEF pertenece al ratón Factor de Transcripción de recursos [15]. Se amplificó y se ligó al pCDNA3-FLAG o pGEX-GST. pCruzHA SIRT1G261A (plásmido 10963) [16] y pGL2Basic-EcadK1 (plásmido 19290) [17] fueron adquiridos por Addgene. pGEX-GST SPDEFK294Q se ha generado mediante mutagénesis dirigida al sitio.
C.elegans
ensayos
C.elegans
cepas fueron cultivadas a 20 ° C en placas de agar de crecimiento de nematodos medios de comunicación (NGM) sembrado con
E. coli cepa OP50
menos que se indique lo contrario. Las cepas utilizadas fueron de tipo salvaje N2 Bristol, VC199
sir-2.1 (ok434)
IV, SAL129 [
pha-1 gratis (e2123) III;
lys-1 |: : GFP +
pha-1 | (+)], y SAL105 [
pha-1 gratis (e2123) III;
lys-7 de la Unión :: GFP +
PHA 1 | (+)]. Las cepas fueron proporcionados por el
Caenorhabditis
Centro de Genética (Universidad de Minnesota). Se alimentan de bacterias RNAi experimentos se llevaron a cabo como se describe [18]. El
sir-2.1 gratis (R11A8.4) clon fue adquirido de GeneService y secuenciados.
La cuantificación de la expresión de GFP
se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos descritos [19]. Para la adquisición de derechos de
lys-7
:: la expresión de GFP, los animales fueron montados en 2% de agarosa en almohadillas tetramisol 10 mM (Sigma) y se examinaron usando un Zeiss Axioplan-2 microscopio (Carl Zeiss).
extracción de ARNm y el análisis de RT-qPCR
ARN fue aislado de los tejidos utilizando el reactivo TriPure (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se genera a partir de 1 g de ARN total usando QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). QRT-PCR se realizó utilizando LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) y se analizaron mediante el cálculo ΔΔCT. Los valores se normalizaron a la ciclofilina expresión. Los cebadores se enumeran en la Tabla S1 S1 en el archivo.
Ensayo de la luciferasa
células PC3 (ATCC) en placas de 96 pocillos /fueron co-transfectadas con un indicador que contiene el elemento de respuesta SPDEF del E humana promotor -cadherin, pGL2Basic-EcadK1 y pcDNA3, pCDA3-FLAG-SPDEF o pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q con o sin vectores de expresión PUSE-SIRT1 (jetPEI transfección; PolyPlus). El medio se retira después de 24 hr, se añadieron las células se lavaron con PBS frío, y luciferasa de sustrato (Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega) antes de la medición de la luciferasa por el Victor × 3. β-galactosidasa se utilizó para la normalización.
in vitro de acetilación y desacetilación ensayos
in vitro de acetilación y desacetilación Los ensayos se realizaron como se describe por primera vez [20]. Brevemente, 1 g de proteína SPDEF recombinante, obtenida de la cepa BL21, se incubaron con 500 ng de p300 recombinante en tampón de acetilación (50 mM Tris-HCl, pH 8, NaCl 100 mM, glicerol al 10%, PMSF 1 mM, 1 mM TDT, 1 mg /ml bepstatin, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina, 1 mM de butirato de sodio y 150 mM de acetil-CoA) durante 1 hora a 30 ° C. Después de la incubación, las muestras se resolvieron en SDS-PAGE y se analizaron por transferencia de Western o se utilizan para los ensayos de desacetilación in vitro. Para los ensayos de desacetilación, 1 g de SPDEF acetilado se incubó con 500 ng de proteína recombinante SIRT1 en tampón de desacetilación (50 mM Tris-HCl, pH 9, MgCl2 4 mM, DTT 0,2 mM, 1 mg /ml bepstatin, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina, y NAD mM 1
+) durante 30 minutos con agitación constante. Las muestras incubadas se resolvieron en SDS-PAGE y se analizaron por transferencia de Western o utilizan para asignar un residuo acetilado con nano-LC-MS /MS. p300 recombinantes, SIRT1, SIRT6 y proteínas SIRT7 fueron hechas por el Dr. Michael O. Hottiger (Universidad de Zurich). desacetilación basado en células fue ensayada en células HEK293T transfectadas por pCDA3-FLAG-SPDEF o pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q con o sin PUSE-SIRT1 o vectores de expresión pCruzHA-SIRT1G261A por jetPEI kit de transfección (Polyplus). 22 horas más tarde, medio se reemplazó con medio fresco (medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g /l de glucosa, suero de ternera fetal al 10%, NEAA 0,1 mM, 50 mg /ml de gentamicina y butirato de sodio 1 mM). Después de 2 horas, celulares lisados enteros se prepararon usando tampón de lisis IP (50 mM Tris HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 10 mM de butirato de sodio y nicotinamida 10 mM) suplementado con completa Los comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Se utilizaron 0,5 mg a 1 mg de lisados celulares enteros para la inmunoprecipitación (IP). IP se realizó con FLAG-agarosa afinidad gel como se describe por el proveedor (A2220, Sigma-Aldrich). Después de IP, las muestras se aplicaron a SDS-PAGE y se analizaron por Western Blot.
Cultivo celular, transfección, y anticuerpos
células
HEK293 y PC3 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco, incluyendo 4,5 g /l de glucosa, suero de ternera fetal al 10%, NEAA mM 0,1 y 50 mg /ml de gentamicina a 37 ° C bajo un 5% de CO
2 atmósfera. células HEK293T y PC3 se transfectaron usando el reactivo jetPEI (
Polyplus transfecciones
, Illkirch, Francia) según las instrucciones del fabricante. Anticuerpos: lisozima (Abcam, Ab36362), Chra (Santa Cruz, sc-13090), acetilado lisina (Señalización celular, 9441L), Sirt1 (Abcam, ab12193), β-catenina (Sigma, A5441), L-FABP (Santa Cruz , sc-50380), PCNA (Santa Cruz, SC-56), HSP90 (BD transducción Laboratories, 610418), anti-FLAG (Sigma, F1804), tubulina (Santa Cruz, sc-5286), SPDEF de western blot (Sigma , AV32533), SPDEF para IHC fue proporcionado amablemente por el Prof. J. Whitsett.
fraccionamiento subcelular
citoplasma y nucleoplasma fracciones se obtuvieron de
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /-
aislado cripta. Las criptas se aislaron siguiendo un protocolo publicado [21]. Finalmente las células individuales de las criptas-derivado se lavaron con PBS enfriado en hielo, y se incubaron en tampón A (mM KCl 10, MgCl2 1,5 mM, 0,5 mM DTT10 mM, 10 HEPES-KOH, pH 7,4) que incluye un cóctel inhibidor de proteinasa (Roche) para 5 minutos. Después de 50 golpes en un homogeneizador Dounce, la fracción de citoplasma se recogió por centrifugación (1,4 k × g durante 5 min, 4 ° C). Los sedimentos se lavaron dos veces con tampón A. Los núcleos se incubó en tampón B (NaCl 150 mM, 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) que contiene un cóctel de inhibidores de proteinasa de 30 min en hielo. Nucleoplasma se recogió por centrifugación (2 k × g durante 5 min, 4 ° C). Las proteínas se cuantificaron utilizando el método de Lowry y se procesaron para el ensayo de western blot.
GFP
+ células análisis
Las criptas de
Sirt1
L2 /L2- Opiniones y
Sirt1
int - /- LGR5
EGFP-IRES-CRE-ERT2
intestinos se aislaron como se ha descrito anteriormente (véase
fraccionamiento subcelular
párrafo) [22]. Las células individuales se analizaron por FACS para detectar la GFP
+ células.
El fraccionamiento de las células a lo largo de las vellosidades de las criptas del eje
El aislamiento secuencial de ratón de pequeñas células epiteliales intestinales a lo largo del crypt- eje de las vellosidades se realizó como se describe anteriormente [23] con algunas modificaciones. Brevemente, se eliminó la totalidad del intestino delgado (duodeno a íleon terminal), lava, y se corta en trozos pequeños (2-5 mm) y se incubó a 37 ° C durante 15 min en 15 ml de tampón A (NaCl 96 mM, 1,5 mM KCl, 27 mM de citrato sódico, 8 mM KH
2 PO
4, y 5,6 mM Na
2HPO
4, pH 7,3). A continuación, se incubó durante 10 min en 15 ml de tampón B (PBS más EDTA 1,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, y 1 mg /ml de albúmina de suero bovino) en un zarandeo 37 ° C incubadora. A la finalización de la incubación de 15 minutos, los enterocitos separados se recogieron (Fracción 1) y 15 ml de tampón fresco B añadió al tejido. Este procedimiento se repitió cuatro veces más, los pasos que duran 25, 25, 25 y 30 min, respectivamente (fracciones 2, 3, 4 y 5), para un total de 120 min de tiempo de incubación. A la finalización del período de incubación final, las células recogidas de cada una de las 5 fracciones se recogieron por centrifugación a 1500 rpm a 4 ° C durante 5 min. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces y se lisaron en tampón RIPA. La actividad fosfatasa alcalina se ensayó por kit de ensayo de fosfatasa alcalina (BioVision).
análisis de espectrometría de masas
carriles de gel se cortó en trozos y se sometió a digestión en gel con endoproteinasa Glu-C o tripsina. digiere péptidos se resuspendieron y se analizaron mediante nano-LC-MS /MS utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Elite (Thermo Fischer Scientific) acoplado a un sistema de UltraPerformance LC (UPLC) (Thermo Fischer Scientific último 3000 RSLC). El análisis de datos se realizó con Proteoma Descubridor (v. 1.3) y las búsquedas se realizaron con la mascota y Sequest contra una base de datos de ratón (UniProt liberar 2013_01). Los datos fueron procesados adicionalmente, inspeccionado y se visualizaron usando el software Andamios 3.
La hibridación in situ
El
sondas in situ y usados en este estudio corresponden a etiquetas de secuencias expresadas o ADNc secuenciado completamente obtenidos de Applied abiertas. Los números de acceso para estas sondas son las siguientes: ratón
Olfm4
BC141127 (9.055.739), ratón
Defa4
BC134360 (40134597). Para asegurar la especificidad de las sondas, se generó ambos sentido y antisentido sondas por
in vitro
transcripción utilizando DIG mezcla de marcaje de ARN (Roche) según las instrucciones del fabricante y a los métodos publicados [24]. ISH se realizó utilizando el instrumento totalmente automatizado Ventana XT (Roche). Productos químicos eran de Roche Diagnostics. En pocas palabras, formol secciones incluidas en parafina fijadas se de-con parafina y rehidratada y tratan previamente por digestión enzimática (protease1, 4 minutos a 37 ° C). La hibridación se realizó añadiendo a cada diapositiva 50 o 100 ng de la sonda diluida en RiboHybe a 65 ° C durante 6 horas.
Ensayo Bactericida
ensayos bactericidas se realizaron como se describe [25] con algunas modificaciones. En pocas palabras, el intestino delgado de ratones adultos se enjuagó con PBS enfriado en hielo y segmentos incubó en mM EDTA 30 para eluir las células epiteliales. Las proteínas totales de las células epiteliales se extrajeron usando tampón NP40 de lisis (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,5 mM, EDTA 5 mM, 5% [vol /vol] glicerol, 1% [vol /vol] NP40) suplementado con inhibidor de proteasa completo. 100 g de proteínas se incubaron durante 60 minutos a 37 ° C en tampón que contiene 10 mM iPIPES crecimiento exponencial
E. coli K12
(ATCC, 10
6 UFC /ml). 20 l de muestra se diluyeron y se sembraron en medio sólido LB-agar. bacterias supervivientes se cuantificaron como UFC en las placas después de la incubación durante la noche a 37 ° C. Las bacterias incubadas en iPIPES sin proteínas añadidas se consideraron como controles.
Colitis y modelos de cáncer colorrectal asociados-Colitis
Se indujo la colitis inducida por DSS como se ha descrito anteriormente [26]. Se evaluaron los cambios diarios en el peso corporal. El sangrado rectal se puntuó en una escala de 0 a 5, indicando que no hay (0) o muy grave (5) sangrado rectal. Ilea y dos puntos se snap-congelado o fija con 4% de Forma-Fixx (Thermo Scientific) y se incluyeron en parafina.
In vivo
permeabilidad intestinal se examinó en ratones como se describe [27]. Se indujo la colitis inducida por el cáncer colorrectal (OMA modelo /DSS) como se ha descrito anteriormente [28]. Después del sacrificio, los dos puntos de ratón se abrieron longitudinalmente y después de 2 horas de fijación en el 4%-formal Fixx, se tiñeron con azul de Coomassie brevemente para visualizar los tumores. Los tumores se contaron en un modo ciego por un patólogo. tamaño de los tumores fue ensayada por manómetro. Pequeños trozos de Ilea y proximal dos puntos terminales se snap-congelado y el resto fijadas con 4% Forma-Fixx (Thermo Scientific) y embebidos en parafina.
El análisis estadístico
Los datos fueron verificados con el prueba de Shapiro-Wilk para la normalidad en I antes de realizar las pruebas de significación. Se consideraron como una distribución aproximadamente normal variables con un valor W ≥0.80. Dos comparaciones de variables se calcularon utilizando Welch de dos colas
t-test
. Para comparaciones múltiples, se realizó la prueba de Bartlett para verificar si hay igualdad de varianza (p & gt; 0,10) y luego se utilizó un modelo lineal se realizó con la prueba post-hoc de Bonferroni. Las variables con un valor de Shapiro-Wilk W & lt; 0,80 fueron considerados como no-normal y las comparaciones se calcularon mediante la prueba de Wilcoxon signed-rank. El método de Kaplan-Meier se utilizó para el análisis de supervivencia en los gusanos. Los datos se expresan como media ± SEM, y para todas las comparaciones de significación,
p
valores inferiores a 0,05 se consideraron como estadísticamente significativo.
* p & lt; 0,05;
** p & lt; 0,01;
*** p & lt; 0,001. Este estudio tuvo un carácter exploratorio y no había tamaño del efecto de pre-especificado. El tamaño de la muestra fue elegido sobre la base del estudio de viabilidad y potencial de poder estadístico. Los tamaños de muestra son consistentes con los reportados en estudios similares. El análisis estadístico para el análisis de la microbiota intestinal se informó en la Información Suplementaria.
Resultados
Sirt1
eliminación aumenta la respuesta anti-microbiana en los mamíferos y nematodos
primero se determinó la localización de la proteína SIRT1 lo largo del eje de la vellosidad /cripta. Desde SIRT1 parece altamente enriquecido en las pequeñas criptas intestinales (Figura S1A), que criados ratones transgénicos Villin-Cre con ratones en los que los exones 5-7 de la
Sirt1
gen estaban flanqueados por sitios LoxP (
Sirt1
L2 /L2
) para generar intestinal específica
Sirt1
ratones knockout (
Sirt1
int - /-
) (Figura S1 B-C). A diferencia de una deleción ya se ha informado de
Sirt1
exón 4 [29], no se detectaron fragmentos truncados SIRT1 y potencialmente activas en
Sirt1
int - /- ratones
(Figura S1C).
Sirt1
int - /-
intestinos mostraron un aumento significativo en el número de Paneth (lisozima
+ y Defa4
+) y cubilete (PAS
+), pero no de enteroendocrina (Chra
+) las células (Figura 1A, la Figura S1D). En consecuencia, los niveles de mRNA de Paneth (
Lys, Crypt1, Crypt4, Defa-R
) y cubilete (
Klf4 Muc2
) marcadores de células, así como la abundancia de proteínas lisozima y
Defa4
ARNm detectada a través de
In situ
hibridación, fueron inducidos en los extremos proximal y distal del intestino
Sirt1
int - /- ratones
(Figuras 1B-C, Figura S1D-e ).
A, imágenes representativas de Paneth (lisozima
+ células), cubilete (ácido periódico de Shiff
+ células), y enteroendocrina (cromogranina A
+ células) tinción celular. (N = 3 ratones de campo; 5-10 por ratón, 50-100 cripta /vellosidad por línea). Bar = 50 micras. B-C, los niveles de ARNm y proteínas de Paneth (
Lys, MMP7, Crypt1, Crypt4, Defa-R
) y cubilete (
Klf4 Muc2
) marcadores se incrementan en los extremos proximal y distal intestino delgado de los
Sirt1
int - /- ratones
(N = 6-8). Para el análisis RTqPCR,
rps12
se utilizó como gen de referencia. ß-actina se utilizó como control de carga en la transferencia de Western. D, aumento de la expresión de genes implicados en la defensa de patógenos en el
sir-2.1 gratis (
ok434
)
C. elegans
mutante (N = 6, cada uno N significa una única población de $ $ 500 gusanos).
Act1
y
Y45
se utilizaron como referencia. E,
SIR-2.1
induce siRNA
lys-1 | y
lys-7
impulsada expresión de GFP en
lys-1 :: GFP
y
lys-7 :: GFP reportero
gusanos. En la misma figura una imagen representativa de
lys-7 :: GFP
antes y después de
se muestra
siRNA 2.1 sir-(DIC, contraste de interferencia diferencial). Los resultados se expresan como media ± SEM. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
A continuación evaluó si
Sirt1
se correlaciona con los genes implicados en la defensa anti-bacteriano utilizando la población de referencia genética del ratón BXD (www.genenetwork. org) [30]. Como no se dispone de datos de expresión génica intestinal, se analizaron las células hematopoyéticas, que son parte del arsenal de las células que protegen contra los patógenos. De acuerdo con nuestras observaciones,
Sirt1
expresión se correlaciona negativamente con la expresión de varios genes relacionados con defensina (Figura S1F).
Para probar si el vínculo entre el
Sirt1 Opiniones y la defensa anti-bacteriano se conserva evolutivo, se utilizó
C. elegans
. Sorprendentemente, la expresión de una amplia variedad de genes implicados en la defensa antimicrobiana (
lyz-1, lyz-7, lyz-8
) [31], así como la de los genes inducidos por patógenos específicos ( F01D5.5, F56D6.2, C17H12.8, C29F3.7, K08D8.5) [32] se mejoró en
sir-2.1
[33] gusanos mutantes (Figura 1D). Por otra parte, en
lys-1 :: GFP Opiniones y
lys-7 :: GFP
reportero cepas [31], s
IR-2.1
siRNA induce significativamente tanto
lys-1 | - y
lys-7
dependiente de la expresión de GFP (Figura 1E). Estos datos indican, por tanto, que el efecto de
Sirt1 Hoteles en la respuesta anti-microbiana se conserva evolutiva de los mamíferos a los gusanos.
Intestinal
Sirt1
impactos de deleción en la microbiota intestinal
Teniendo en cuenta el papel fundamental que Paneth y células caliciformes desempeñan en la protección del intestino de los mamíferos de la colonización bacteriana aberrante, a continuación analizaron el impacto de un
Sirt1
eliminación de la microbiota intestinal.
Sirt1
int - /-
intestinos no sólo tienen un ciego más grande (Figura 2A), indicativa de un microbioma modificada [34], que también tenía una mayor capacidad bactericida (Figura 2B). El uso de ADN extraído de ya sea el contenido intraluminal ciego o tejido de colon, se amplificó la región V3 del gen 16S rRNA bacteriano. Después de la retirada de baja calidad y lee todas las unidades taxonómicas operacionales simples (UOT) (Tabla S2 en Archivo S1), el 98% de la lee cayó en el núcleo del microbioma medible (CMM-ver métodos). La comunidad microbiana fue dominada por 4 filos,
Firmicutes, Bacteroidetes, proteobacterias y Verrucomicrobia gratis (Figura 2C) [35]. Para asignar la composición de la comunidad microbiana y la estructura a través de la
Sirt1
mutación se utilizó un método basado en la OTU. En los análisis basados en la red, las comunidades microbianas del ciego de
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /- ratones
resaltan las diferencias entre los genotipos de la comunidad (Figura 2D), una observación apoyada además por análisis Coordenadas Principales (PCA; Figura 2E). especies microbianas indicador que contribuyen a las diferencias entre la comunidad
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /- ratones fueron identificados
y UOT muestran en la Figura 2F y en la Tabla S3 en presentar S1. Curiosamente, la mayoría de UOT enriquecido en
Sirt1
int - /- ratones fueron
del género
Barnesiella
,
Bacteroides
, y
Prevotella
(phylum
Bacteroidetes
), que se encuentra en el intestino humano y de ratón normal, que se redujo notablemente en la EII [36], [37]. Por el contrario, el género
Clostridium gratis (phylum
Firmicutes
) se amplió en
Sirt1
L2 /L2
ratones (Figura 2F y en la Tabla S3 en S1 Archivo). Estos resultados muestran que intestinal
Sirt1
deleción y los consiguientes cambios en Paneth y células caliciformes modifican el microbioma intestinal.
A, Representante imagen que muestra un aumento significativo en el tamaño ciego en
Sirt1
int - /- ratones
. B, la capacidad bactericida del intestino delgado (duodeno) en
Sirt1
int - /- Opiniones y
Sirt1
L2 /L2
ratones se ensayó por ensayo de formación de colonias unidad. Los resultados se expresan como% del control (sin proteínas) (N = 7). C, Distribución de Phyla microbiana en el tejido del colon y el contenido cecal
de Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /- ratones
. /- -
Ratones D, análisis de las comunidades bacterianas cecal en
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int Red-based. Cada círculo representa un animal grande y más pequeño cada punto representa un OTU;
Sirt1
L2 /L2 gratis (azul) y
Sirt1
int - /- gratis (rojo). E, análisis de coordenadas principales (PCA) (p = 0,012 PERMANOVA, y ANOSIM p = 0,007) que muestra una separación significativa de las comunidades microbianas entre
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /- ratones
. F, mapa de calor que muestra la parte superior 20 Otus diferente entre
Sirt1
L2 /L2
y
Sirt1
int - /- ratones
. Los valores de abundancia fueron transformados log y estandarizado y se representan dentro de Matlab. * Indica
Barnesiella
,
Bacteroides
, y
Prevotella
; ° indica
Clostridum
género (véase también el cuadro S1 S3 en archivos). Los resultados se expresan como media ± SEM. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
Intestinal
Sirt1
eliminación protege de la colitis y el cáncer colorrectal colitis inducida por
Teniendo en cuenta estas últimas observaciones, se estudió el impacto de
Sirt1
en la patogénesis de la colitis y el CAC.
Sirt1
int - /- ratones,
expuestos a dextrano sulfato sódico (DSS), mostraron una colitis leve caracterizada por la pérdida de peso más bajo, la puntuación de hemorragia, una tendencia hacia una reducción de la permeabilidad intestinal, y una disminución en la expresión de genes inflamatorios (Figura S2A-D). Estos resultados nos incitó a estudiar como
Sirt1
int - /- ratones reaccionan a
CAC. Los ratones se inyectaron por lo tanto, con el carcinógeno AOM (azoximetano) antes de una posterior exposición a tres ciclos de DSS (Figura 3A). Sorprendentemente, el número y tamaño de los tumores en
Sirt1
int - /-
intestinos eran más pequeñas (Figuras 3A-B). El mejor estado de salud de los
Sirt1
int - /- ratones
fue subrayada aún más por la longitud del colon más largo y la recuperación del peso corporal más rápido después del último ciclo de DSS (Figuras 3C-D)
A-B, representación esquemática del protocolo OMA /DSS (panel superior izquierdo) y la imagen representativa de los dos puntos de
Sirt1
int - /- Opiniones y control de los ratones después de la inducción CAC (Barra = 200 micras) (parte inferior izquierda del panel).
Sirt1
int - /-
ratones muestran significativamente menos tumores (panel derecho). B, imagen representativa de una sección del colon de un int
Sirt1
- /- Opiniones y control del ratón después de la inducción CAC (paneles de la izquierda). El tamaño del tumor (panel derecho). C, la longitud del colon en el momento del sacrificio (OMA /DSS). D, Porcentaje de cambio del peso corporal. Para el experimento /DSS AOM se usaron 8 ratones para cada genotipo. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001. E-F, análisis de coordenadas principales (PCA) de secuencias bacterianas a partir de tejido del colon realizó mediante matriz de distancia UniFrac no ponderado. E,
Sirt1
int - /-
de colon tejidos antes y después del tratamiento con AOM (PERMANOVA p = 0,003, p = 0,016 ANOSIM). F,
Sirt1
L2 /L2 tejido
colon con y sin tratamiento de otitis media aguda (p = 0,067 PERMANOVA, ANOSIM p = 0,038). G-H, de mayor significación estadística UOT antes y después de la OMA en ambos
Sirt1
L2 /L2 gratis (G), y
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int - /- gratis (H), tejidos de colon; * Indica
Helicobacter
y
Desulfovibrio gratis (véase también el cuadro S4 en S1 Archivo). Yo, PCA de secuencias bacterianas a partir de tejido del colon después de la otitis media aguda (p = 0,767 PERMANOVA, ANOSIM p = 0,167).
El análisis de la comunidad microbiana después de la exposición DSS /OMA reveló cambios significativos en
Sirt1
int - /- ratones (
Figura 3E), mientras que la variación fue menor en
L2 /L2
ratones (Figura 3F). especies de microbios indicadores, antes y después de DSS /OMA, se identificaron (Figuras 3G-H y en la Tabla S1 S4 en archivos). Es de destacar que UOT que pertenece al género
Helicobacter
y
Desulfovibrio
solamente se incrementaron después de DSS /OMA en
L2 /L2
ratones (Figura 3G y en la Tabla S4 en S1 File). Curiosamente, aunque el papel de
Helicobacter
en el cáncer colorrectal sigue siendo controvertida [38],
Desulfovibrio
se considera a participar en la patogénesis de la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn [39]. comunidades microbianas en
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L2 /L2
y
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int - /- ratones después del tratamiento
DSS /OMA no fueron significativamente diferentes (Figura 3I). En total, la hipótesis de que los cambios en la comunidad microbiana general en condiciones normales (Figura 2), así como en géneros específicos después de DSS /OMA, pudieron determinar la diferente susceptibilidad de los dos genotipos de la colitis y el CAC.
unidades SPDEF hiper-acetilada Paneth y la maduración de las células caliciformes intestinales en específico
Sirt1
eliminación
para entender los cambios moleculares que subyacen a estos fenotipos prominentes, hemos explorado diferentes vías posibles que contribuyan a Paneth y células caliciformes desarrollo y maduración. Dado que los tipos de células intestinales se diferencian a partir de células madre intestinales (ISC) [3], se evaluó en primer lugar si
Sirt1
supresión podría afectar a la población de ISC. Tubulina se utilizó como control de carga. Métodos.