Extracto
Antecedentes
La disparidad global en la incidencia de cáncer sigue siendo un problema importante de salud pública. Nos hemos centrado en el cáncer de próstata ya que la enfermedad microscópica en los hombres es común, pero la incidencia de la enfermedad clínica varía más de 100 veces en todo el mundo. Ca
2 + señalización es un regulador central de la proliferación celular, pero ha recibido poca atención en la prevención del cáncer. Nosotros y otros han informado de una reducción dependiente de la dosis fuerte en la incidencia de cáncer de próstata y de pulmón dentro de las poblaciones expuestas al boro (B) en el agua potable y los alimentos; y en el tumor y la proliferación celular en modelos de cultivo de células animales y
. Métodos /Principales conclusiones
Hemos examinado el impacto de B sobre Ca
2 + tiendas usando el cáncer y no cáncer humano líneas celulares de próstata, Ca
2 + indicadores Rhod-2 AM y Indo-1 AM y microscopía confocal. En las células DU-145, la inhibición de Ca
2 + liberación fue evidente después del tratamiento con agonistas de timbres que contienen RyR cADPR, 4CmC o la cafeína y los respectivos niveles de BA (50 M), (1, 10 m) o (10, 20 , 50.150 M). LNCaP células cancerosas menos agresivas requieren 20 BA M y la línea celular no tumoral PWR1E requiere 150 BA M para inhibir significativamente la cafeína estimula la liberación de Ca
2 +. BA (10 M) y la dantroline antagonista RyR (10 mM) fueron equivalentes en su capacidad para inhibir ER Ca
2 + pérdida. La citometría de flujo y análisis de microscopía confocal mostró la exposición de las células DU-145 a BA 50 M durante 1 hora disminuyó almacena [Ca
2 +] en un 32%.
Conclusión /Importancia
B muestran provoca una disminución dependiente de la dosis de Ca
2 + liberación de los almacenes sensibles receptor de rianodina. Esto ocurrió a concentraciones de BA presentes en la sangre de las poblaciones geográficamente dispares. Nuestros resultados sugieren niveles sanguíneos más altos de BA reducen el riesgo de cáncer de próstata mediante la reducción intracelular de Ca
2 + señales y almacenamiento
Visto:. Henderson K, Stella SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) Receptor activado Ca
2 + liberación es inhibida por el ácido bórico en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10.1371 /journal.pone.0006009
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 17 Noviembre 2008; Aceptado el 20 mayo del 2009; Publicado: 23 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Henderson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo para esta subvención fue financiada por fondos personales (CE) y, en parte, por la Universidad de California Sustancias Tóxicas investigación y el programa de entrenamiento (TSR & amp; TP) para el apoyo parcial de KH y SK. CE es el tutor de doctorado de KH y SK. TSR & amp; financiación TP era para becas estudiantiles restringidas a apoyo a los estudiantes y no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no. existen intereses en competencia.
Introducción
Una de las formas en las células responden a los estímulos del medio ambiente es mediante la apertura de canales entre los sitios de calcio almacenado, tales como el retículo endoplasmático (ER), aparato de Golgi, mitocondrias y ( MT), que contienen altas gratuitas Ca
2 + concentraciones (500 m), y el citoplasma, que contiene bajas libre de Ca
2 + concentraciones (100 nm) [1]. Un rápido aumento de la citoplasmática Ca
2 + se puede lograr por la entrada capacitativa de calcio (CCE) asociado a la liberación de Ca almacenado
2 + por el receptor de rianodina (RyR) y el IP
3 receptor (IP
3R) en el citoplasma seguido por una afluencia de Ca extracelular
2 +. CCE activa Ca
2 + proteínas que regulan numerosas funciones celulares, incluyendo la transcripción de genes, la proliferación celular, la secreción de la vesícula, y la apoptosis de unión a [2], [3]. Citoplasmática de Ca
2 + concentraciones se volvió a la normalidad como Ca
2 + se elimina por los transportistas como el Na
2 + - Ca
2 + intercambiador en la membrana plasmática, la ATPasa endoplásmico sarcoplásmico ( SERCA) en la membrana del ER, Ca
2 + uniporter en las mitocondrias, y mediante la unión a alta afinidad proteínas de unión a [4], [5]. En este informe se presentan pruebas de que los niveles fisiológicos de ácido bórico (BA) inhiben almacenan Ca
2 + liberación de los sitios sensibles RyR agonistas.
El boro (B) es el 9
º elemento más abundante en agua de mar (425 M B) y hasta hace poco descartado como biológicamente irrelevantes [6]. B se une al oxígeno en la naturaleza y en los fluidos fisiológicos 98,4% está presente en forma de B (OH)
3 ácido bórico y 1,6% como B (OH)
4
- borato. Biología ha utilizado este elemento de la estructura de varias moléculas, incluyendo: antibióticos en hongos [7]; quórum de detección automática inductor 2 en bacterias [8]; y el dímero ramnogalacturonano-II en las plantas [9]. En las plantas, se requiere B para la elongación celular, la floración y la formación de semillas y es un componente integral de los cultivos alimentarios. No cargado BA cruza la membrana plasmática de las células epidérmicas de la raíz en el citosol por difusión pasiva y esto es facilitado por NIP5; 1 transportadores [10]. BA se convierte parcialmente en borato en el citosol (pKa 9,6) y se transporta en el xilema utilizando el transportador de exportación BOR1 [11], [12]. Un homólogo humano de NaBC1has BOR1 nombradas ha informado a estar presentes en las líneas celulares de mamíferos y para aumentar la proliferación celular a bajas concentraciones de BA [13], pero esto aún no se ha confirmado por otro laboratorio. El efecto de la BA en el crecimiento y la proliferación celular en la trucha, pez cebra y de la HEK mamífero y células HeLa sigue una forma de U invertida con mayores concentraciones que causan inhibición del crecimiento celular [13] - [15]. Las concentraciones de 60 a 100 BA mu M inhiben la proliferación celular en las células de cáncer de próstata, mientras que altas concentraciones de 500 a 1000 BA mu M se requiere para inhibir la proliferación de células epiteliales de próstata no tumorales en el mismo marco de tiempo [16].
niveles sanguíneos humanos de BA reflejan la geología local, la calidad del agua, y las plantas en la dieta con una gama mundial de 2 a 120 M (21 a 1232 ng B /g de sangre húmeda) en vida libre de los hombres y mujeres sanos [17 ], [18]. Varios estudios en humanos han observado una disminución en el riesgo de cáncer de próstata y de pulmón, y citopatología cervical anormal en proporción a la cantidad de B ingerida de los alimentos y el agua [19] - [22]. Un estudio no observó un efecto protector, pero difiere de otros estudios en el uso de una base de datos de alimentos diferentes B y el contenido estimado de B de algunos alimentos [23], [24].
La plausibilidad biológica para el efecto quimiopreventivo de BA es apoyado por varias líneas de investigación. En ratones inmunocomprometidos, la suplementación BA redujo el crecimiento de los tumores de próstata humanos trasplantados, disminución de la IGF-1 concentraciones en los tejidos, y bajó la próstata niveles de antígeno específicos en suero [25]. En cultivo celular, BA redujo la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata humanos en una manera dependiente de la dosis y se inhibe la migración celular y la invasión [16], [26], [27]. Descubrimos la relación entre la capacidad de BA para inhibir la proliferación de células de cáncer de próstata y la señalización del calcio después de los estudios de espectrometría de masas mostraron la afinidad de BA para NAD
+ se redujo por la fosforilación y por lo tanto potencialmente sujeto a la regulación biológica [28], [29]. BA también ha demostrado ser un inhibidor no competitivo de ADP-ribosil ciclasa [30]. Esto nos llevó a estudiar su impacto en el NAD
+ /cADPR Ca
2 + Camino de emisión. Hemos demostrado que los niveles farmacológicos de BA (250 y 1000 mM), pero no el ácido metilborónico, disminución de NAD
+ liberación estimulada de Ca
2 + sin afectar la liberación de calcio cuando se aplica en su propia [27]. No estaba claro de estos estudios si BA fue la inhibición de Ca
2 + en libertad al interferir con NAD
+ conversión a cADPR, el bloqueo de la liberación de Ca
2 + tiendas, o interferir con el CCE. Asimismo, planteó la posibilidad de que las concentraciones de BA en el rango normal de la sangre podrían ser capaces de inhibir Ca
2 + liberación del receptor de rianodina (RyR) tiendas sensibles. Aquí se demuestra que los niveles fisiológicos de BA inhiben Ca
2 + liberación de los almacenes de respuesta RyR en las células epiteliales de próstata humanos y Ca
2 + niveles más bajos luminales.
Métodos
Cell
culturas
los experimentos se utilizan líneas celulares de cáncer de próstata DU-145 y LNCaP y la línea celular PWR1E no tumoral. Las células se cultivaron y se mantuvieron en placas de cultivo celular a 37 ° C en 95% de aire y 5% de CO
2 incubador humidificado. Para los experimentos de confocal, las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio durante 24 horas antes de los ensayos que realizan y estudió en una confluencia de menos del 80%. células DU-145 y PWR1E fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y LNCaP fue un regalo del Dr. Allen Pantuck del Departamento de Urología de la Escuela de Medicina Geffen de la Universidad de California, Los Ángeles. RPMI medios de cultivo celular se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y L-glutamina (200 mM). Se mantuvieron células no tumorales PWR1E en medios que contienen queratinocitos estreptomicina (100 mg /ml), L-glutamina (200 mM), 2,5 g de EGF humano recombinante, y 25 mg de extracto de pituitaria bovina (Gibco, Carlsbad, CA). Boron agota medios de comunicación se preparó usando el boro resina específica de intercambio iónico, Amberlite IRE-743 (Sigma) como se describe anteriormente [16] y modificado como sigue. Se añadieron nueve gramos de resina de intercambio iónico en autoclave IRA-743 a 500 ml de medio y se mezclaron en un rotador Orbit de 75 a 100 rpm durante 15 a 20 horas a 9 ° C.
Medición de Ca
2 + transitorios
Almacenamiento Ca
2 + se controlaron los cambios utilizando el colorante sensible al calcio Rhod-2, éster AM (Biotium, Hayward, CA) que se acumula en los organelos. Rhod-2, éster AM tiene una Kd de 1 mM y se ha demostrado que en compartimientos, en particular en la mitocondria, pero como se muestra, en otros orgánulos también (Fig. 1). También utilizamos ER Rastreador Rastreador verde verde y Mito (Molecular Probes, Carlsbad, CA) en conjunción con Rhod-2, éster Am. Son marcadores fluorescentes altamente específicos para el retículo endoplasmático y las mitocondrias, respectivamente. Se analizaron Ca
2 + cambios en respuesta a BA y diversos agonistas mediante la selección de las regiones de interés en las células que se superponen la Rhod-2 rojo Ca
2 + etiqueta con el rastreador ER verde (fig. 1A) [31] - [33]. Rhod-2, éster de AM se preparó como una solución madre 1 mM en DMSO y se diluye en cualquiera de medio RPMI completo o medio completo de queratinocitos a 3 M. Se incubaron las células con éster de Rhod-02 a.m. (5 M) y ER o Mt Tracker (0,5 M, 250 nM, respectivamente) en medio RPMI o medio de queratinocitos durante 30 minutos a 37 ° C. Ca
2 + liberación fue estimulada mediante agonistas en combinación con diferentes concentraciones de BA en solución de Ringer. Las imágenes se recogieron con un Zeiss 510 LSM 5 Pascal montado en un microscopio vertical (Zeiss Axioplan 2) equipado con un Axoplan X63 (NA 0,95) objetivo de inmersión en agua. Un láser de HeNe fue utilizado para excitar Rhod-2 a 543 nm. 488 nm de un láser de diodo se utiliza para excitar o ER Mt Tracker. La emisión se recogió en un tubo fotomultiplicador través de un filtro LP 560 nm para Rhod-2 y un filtro de 505 LP para ER y rastreadores Mito. ampliación adicional, series de tiempo, y la sustracción del fondo se controlan mediante software de adquisición de Zeiss LSM. Todas las imágenes fueron adquiridas como de 12 bits.
A. Dos células DU-145 etiquetados con fluoróforo calcio intracelular fluorescente roja, Rhod-2, y la etiqueta fluorescente verde retículo endoplásmico, ER Tracker. El amarillo indica superposición de Ca
2 + y ER y el círculo es la región de interés (ROI) analizados en estos experimentos. Las flechas indican orgánulos: Nucl (nucleolo), nuc (núcleo), ER (retículo endoplasmático) B. Dos DU-145 células marcada con rojo fluorescente intracelular de Ca
2 + fluoróforo, Rhod-2, y la etiqueta mitocondrial fluorescente verde, Mito rastreador. El amarillo indica la superposición de calcio y mitocondrias. Las flechas indican los orgánulos:. Nucl (nucleolo), nuc (núcleo), MT (mitocondrias) guía empresas
Análisis de Ca
2 + liberación mediante microscopía confocal
Se aplicaron tratamientos BA en Ca
2 + solución libre de Ringer prepara utilizando agua ultrapura para eliminar B [16], [34]. Ca
2 + liberación de la RyR se activó mediante la adición de 25 mM a 10 mM cADPR digitonina permeabilized células, o 20 mM de cafeína o 100 M 4-cloro-m-cresol (4cmc) en células intactas [35] , [36]. La inhibición de Ca
2 + liberación se consiguió usando 10 M dantroleno o concentraciones variables de BA en presencia de un agonista [37]. SERCA se inhibió usando ácido ciclopiazónico 10 mM (CPA) [2]. Todas las aplicaciones de fármacos eran para una segunda duración 30 en solución libre de calcio de Ringer (NaCl 143 mM, KCl 5 mM, MgCl 1
2, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, 1 mM EGTA-2H
2O, 1 mM EGTA) con el fin de ver Ca
2 + liberación de los almacenes sin el aporte de Ca externa
2 +. la aplicación del fármaco fue seguido por un lavado de tres minutos en los que contiene la solución de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 mM
2, mM MgCl 1
2, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM) de calcio. Las soluciones se entregan a la cámara de perfusión a una velocidad de 1 ml /min utilizando una sola pasada, sistema de perfusión de alimentación por gravedad. Confocal imágenes fueron tomadas cada segundo y comenzaron a 2 minutos antes de la primera aplicación del tratamiento con el fin de establecer una línea de base de la intensidad de fluorescencia. El cambio en la intensidad de fluorescencia (f) causada por la aplicación del fármaco se comparó con una medición de línea de base promedio que consistía en tres mediciones antes de la aplicación del fármaco (fo). Todas las mediciones se normalizaron a la línea base de esta manera el uso de la razón F-fo /fo. Normalmente se analizaron 6-10 células en un campo de vista y todos los experimentos se realizaron en un mínimo de tres preparaciones independientes. El orden de aplicación del fármaco se basa en un experimento inicial, que consistió aplicaciones consecutivas agonistas de sólo. Si el 2
nd aplicación del agonista provocó una menor Ca
2 + liberación de la 1
st, las células fueron tratadas con el agonista más BA en primer lugar. Esto evita la posibilidad de que mide la inhibición de Ca
2 + en libertad debido a BA fue en parte debido a las células refractarias realizados hasta por un tratamiento previo con agonistas.
Análisis de los niveles de calcio almacenados
DU-145 células de cáncer de próstata fueron tratados con BA durante 1 a 72 horas en medios desprovistos de boro utilizando Amberlite IRA-743 de resina de intercambio iónico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como se describe anteriormente. Justo antes de células de análisis fueron retirados de la placa usando 1% digestión con tripsina, se centrifuga y etiquetados durante 45 minutos en los medios de comunicación de serie con 3 M de éster AM Rhod-2 para el almacenamiento de Ca
2 + análisis. A fin de supervisar citoplasmáticos Ca
2 + niveles, las células se marcaron con 5 M Indo-01 a.m. (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 45 minutos. a continuación, las células marcadas se lavaron y se resuspendieron en 1 ml de medio normal. La fluorescencia se analizó usando un flujo analítico Beckton Dickinson BD-LSR I citómetro. Rhod-2 de excitación se logró con un láser de argón 514 nm y se analiza en el (581 nm) de canal FL-2. Indo-1 se excita con un láser UV (351 nm) y se analizaron en 400 nm (FL5) y 510 nm (FL4) filtros de paso de banda. Resultados para indo-1 células marcadas se dan como razones de fluorescencia (FL5 /FL4). Dispersión frontal y lateral se utilizaron para puerta de salida fragmentos celulares [38]. el caudal bruto citometría de datos fueron analizados utilizando el software FlowJo (TreeStar Software, San Carlos, CA, EE.UU.). Los resultados se presentan como Ca
niveles% 2 + en comparación con células no tratadas. Almacenamiento Ca
2 + niveles también fueron analizados en BA células tratadas y no tratadas mediante la comparación de Ca
2 + almacenamiento de vaciado en respuesta a 100 mM thapsigargina usando microscopía confocal [39].
El análisis estadístico de los datos
los datos se presentan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante emparejado de Student o la prueba t no pareada o ANOVA de una vía para comparaciones múltiples con la prueba post-hoc de comparación múltiple de Dunnett utilizando GraphPad Prism 4.0. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. La ecuación para no lineal un sitio de unión (hipérbola) Y = Bmax * X /(K
d + X) se utilizó para calcular K
d y los valores de Bmax usando el software GraphPad.
Químicos y materiales de
B fue retirado del agua y los medios mediante los métodos descritos anteriormente [13]. La cafeína, 4-CMC, ATP, CPA, dantroleno, thapsigargin, cADPR, digitonina y ácido bórico se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) diluido en calcio solución de Ringer libre para asegurar que si DMSO era niveles actuales eran no mayor que 0,1 %. Todas las soluciones se prepararon fresca antes de la perfusión. Superfusión con DMSO al 0,1% en solución de Ringer libre de calcio no afectó ER Ca
2 + niveles o las respuestas de imagen.
Resultados
El objetivo del estudio fue determinar si las concentraciones fisiológicas de BA inhiben la liberación de Ca
2 + de tiendas sensibles RyR en las células epiteliales de cáncer de próstata humano y no tumorales. células DU-145 se cargaron con Rhod-2 y ER rastreador o rastreador de Mito para determinar si Rhod-2 compartimentada en uno o ambos compartimientos. No fue posible delinear Ca
2 + señalización de la ER en comparación con las mitocondrias en células vivas mediante microscopía confocal. Rodio-2 marcado Ca
2 + en las mitocondrias, ER, nucléolo, y otras áreas en la célula (Fig. 1A-B). En nuestros experimentos, una combinación de ER Tracker y Rhod-2 se utiliza para definir las regiones de interés en los sitios de Ca almacenado
2 + (fig. 1A). Esta zona incluye Ca
2 + tiendas ubicadas en la sala de emergencia y las mitocondrias (Fig. 1A-B). La aplicación de BA de 0,1-1000 M solos no demostró un efecto inmediato mensurable sobre el almacenamiento de Ca
2 + mediante microscopía confocal (datos no mostrados).
El ácido bórico inhibe Ca
2 + liberación de respuesta a los agonistas del receptor de rianodina
para determinar si BA inhibida Ca
2 + liberación de la RyR, se trataron las células DU145 con tres agonistas diferentes RyR en combinación con BA. Análisis de la competencia de unión a ligando mostró BA era un sitio único inhibidor competitivo reversible de cADPR, un agonista endógeno de RyR (Fig. 2A-C). La constante de disociación de equilibrio, (K
D) para cADPR era 15.10, pero en presencia de BA aumentó a 49,39. La inhibición por BA se invirtió mediante el aumento de la concentración de cADPR y la presencia de BA no cambió el número máximo de sitios de unión (Bmax) (Tabla 1).
A. 50 M BA inhibida 25 cADPR M inducida por Ca
2 + liberación (n = 6; *** p & lt; 0,001). B. Estudio de unión a ligando competitivo mostró BA era un antagonista competitivo de superables cADPR en un modelo único sitio. Las concentraciones de BA se mantuvieron a 50 mM. A bajas concentraciones cADPR BA cambió la respuesta de liberación de Ca
2 + a la derecha, pero esto se invirtió en concentraciones más altas cADPR y la respuesta máxima (Bmax) no se ha modificado. Cada punto de datos es la media de n = 6. R
2 es 0,9155 y 0,8606 para cADPR sin y con BA, respectivamente.
A continuación, analizamos el efecto de BA en otra agonistas RyR en células intactas. Se utilizó primero la cafeína [20 mM] un agonista que potencia la sensibilidad RyR a su ligando nativo, Ca
2 +. En respuesta a dos aplicaciones consecutivas de la cafeína, la segunda liberación fue ligeramente mayor que el primero (Fig. 3A). A continuación, esta secuencia se repitió con BA añadido en combinación con cafeína en la segunda aplicación. Los resultados de estos experimentos muestran que BA reduce Ca
2 + liberación de una manera dependiente de la dosis de 10 a 150 M BA (Fig. 3B-F). A continuación, examinó el efecto de BA en 4CmC, un agonista directo del RyR. aplicaciones consecutivas de 50 M 4CmC resultaron en equivalentes de Ca
2 + liberación (Fig. 4A). Según se observó con la cafeína, BA disminuyó 4CmC estimulado Ca
2 + liberación de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4B-E). Sin embargo, la inhibición se inició a 1 BA M y alcanzó un máximo en 10 BA M.
A. Ca
2 + liberación en las células DU-145 en respuesta a solicitudes consecutivas de cafeína 20 mM (n = 6, * p = 0,0168). B. BA 10 M inhibió significativamente la liberación de Ca
2 + (n = 6, ** p & lt; 0,01). C. M 20 M BA inhibió significativamente la liberación de Ca
2 + (n = 6, * p = 0,0163). D. 50 M BA inhibió significativamente la liberación de Ca
2 + (n = 6, ** p = 0,0042). E. 150 M BA inhibió significativamente la liberación de Ca
2 +, n = 6, *** p = 0,0001. F. combina el análisis de datos que muestra el efecto dosis-respuesta inhibitoria de BA en el cafeína estimulado Ca liberación
2 +, (n = 6 por concentración, ** p & lt; 0,01). Las figuras 2-9, cada barra representa la respuesta media de 6 experimentos (n = 6) replicado 3 veces. Las exploraciones de línea a la derecha de cada gráfico de barras son respuestas representativas de un solo experimento.
A. aplicaciones consecutivas de 4-CMC no alteraron la respuesta la liberación de calcio (n = 6, NS). B. BA 0,1 M no inhibió la liberación de Ca
2 +. C. 1,0 M BA inhibe la liberación de Ca
2 + (n = 6, * p & lt; 0,05). D. 10 M BA inhibe la liberación de Ca
2 + (n = 6, *** p = 0,0005). E. Análisis de datos combinadas mostrando una dosis dependiente de Ca
2 + respuesta de liberación (n = 6 por concentración (** p & lt;. 0,01) guía empresas
Los estudios anteriores han demostrado que el efecto inhibidor de BA sobre la proliferación celular en el IC
50 para las células DU-145 fue de aproximadamente 10% menos eficaz en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP menos agresivo. Además, BA no fue capaz de lograr una reducción del 50% en la proliferación en no tumoral PWR1E próstata células epiteliales en experimentos con un máximo de 4 veces la IC
50 para DU145 [16]. Hemos examinado estas líneas celulares para determinar si BA también fue menos eficaz en la inhibición de la cafeína sensible a Ca
2 + en libertad. la inhibición de la Ca
2 + liberación en respuesta a la cafeína en las células tumorales de próstata LNCaP se produjo más de 20 mM-150 mM BA (Fig. 5A-D). Así, las células LNCaP fueron menos sensibles a BA en comparación con DU-145. Las células LNCaP fueron no responde al tratamiento 4CmC (no mostrado). El PWR1E no tumoral, línea celular de próstata hiperplásica requiere 150 BA mu M para inhibir la cafeína estimula Ca
2 + liberación (Fig. 6A-D). células PWR1E no eran sensibles al tratamiento 4CmC (no mostrado).
A. inhibición 20 M BA de la liberación de calcio (n = 6, * p = 0,0226). B. inhibición del 50 M BA de Ca liberación
2 + (n = 6, ** p = 0,0019). C. inhibición BA 150 mM de cafeína induce la liberación de Ca
2 + (n = 6, *** p & lt; 0,0001). D. Los datos combinados muestran una inhibición dependiente de la concentración de cafeína estimulan la liberación (n = 6, ** p & lt; 0,01) guía empresas
A.. aplicaciones cafeína consecutivos en células PWR1E próstata. (N = 6, NS). B. BA 50 mM y la cafeína inducida por Ca
2 + liberación no muestra inhibición (n = 6, NS). C. BA 150 mM de cafeína inhibe induce la liberación de Ca
2 + (n = 6, ** p = 0,0029). D. Los datos combinados que no muestran respuesta a la dosis y la inhibición sólo a 150 M (n = 6, * p & lt; 0,05).
El ácido bórico inhibe cyclopiazonic ácido inducida por Ca
2 + en libertad desde el RE
La liberación de ER Ca
2 + tiendas en algunas células no excitables pueden estimularse utilizando ácido ciclopiazónico (CPA), que inhibe la SERCA en una manera similar a thapsigargin, pero se pueden lavar fuera [40] . BA (0,1 a 1.000 M) por sí mismo no alteró los niveles de calcio de almacenamiento durante el curso de tiempo del experimento (no se muestra). Las respuestas a las solicitudes consecutivas de CPA [10 mM] no decaen (Fig. 7A). La aplicación simultánea de CPA y 1 BA mu M causó una disminución significativa en la liberación y 10 BA M causado una inhibición casi completa (Fig. 7B-D). A continuación, prueba el efecto de dantroleno, un conocido inhibidor de la RyR en Ca
2 + en libertad por el CPA. Se encontró que 10 M dantroleno inhibe CPA estimulado Ca
2 + en libertad a un nivel equivalente al 10 BA M (Fig. 8A-B).
Las células fueron probados con CPA + BA seguido de CPA. A. aplicaciones consecutivas de CPA no alteraron la liberación de Ca
2 + (n = 6, NS). B. 0,1 M M BA no inhibió CPA estimula la liberación de Ca
2 + (n = 6, NS). C. BA 1,0 M inhibió CPA estimula la liberación de Ca
2 + (n = 6, ** p = 0,0037). D. BA 10 mM inhibió CPA estimula la liberación de Ca
2 + (n = 6, *** p & lt; 0,0001) guía empresas
A.. Las células se ensayaron con CPA (10 M) + dantroleno (10 M) seguido de CPA (n = 6, *** p & lt; 0,0001 B. BA inhibida CPA estimulado Ca
2 + liberación de una manera dependiente de la concentración La.. efecto inhibidor de dantroline y BA fueron equivalentes a 10 mM, CPA (n = 6, ** p & lt; 0,01).
tratamiento con ácido bórico reduce el almacenamiento [Ca
2 +] sin efecto en citoplasmática [Ca
2 +]
Nuestros resultados muestran BA inhibieron Ca
2 + en libertad nos lleva a analizar [Ca
2 +]
niveles relativos st usando Rhod-2 las células teñidas y [Ca
2 +]
niveles cyt relativas usando Indo-1 células teñidas y citometría de flujo. La exposición de células DU-145 a BA [10-50 M] durante 24 horas no afectó a la [Ca
2 +]
CYT (Fig. 9A). Sin embargo, las reducciones [Ca
2 +]
Se produjo st (22%) con 10 M BA dio lugar a una reducción del 32% en la [Ca
2 +]
st 50 BA M a 1 hora (Fig. 9B). Las concentraciones de BA ni más alto ni el tratamiento con BA 10 mM hasta las 72 horas resultó en una reducción adicional de la [Ca
2 +]
st (Fig. 9BC). a continuación, realizó mediciones confocal de thapsigargina estimulados Ca
2 + en libertad después de las células DU-145 se trataron previamente con BA (50 M) durante 24 horas y se observó una disminución del 35% en Ca
2+. desbloqueo (Fig 9D).
A. Relativa [Ca
2 +]
cyt tras la exposición a 0, 10 y 50 BA mu M durante 24 horas (n = 5, NS). B. [Ca
2 +]
pt 0 por ciento de tratamiento en las células DU-145 tratadas con BA 0-250 M durante 24 horas. El ácido bórico [10-50 M] redujo los niveles de ER de calcio en más de un 22% -32% en comparación con las células no tratadas (n = 5, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). C. Reducción de la [Ca
2 +]
st en las células DU145 tratadas con 50 mM BA de 1-72 horas (n = 5, ** p & lt; 0,01). D. confocal de medición mostró pretratamiento de las células con BA durante 24 horas bajaron thapsigargina estimula la liberación de Ca
2 + en comparación con las células no tratadas (n = 6, *** p & lt; 0,0001) guía empresas
Discusión.
Este estudio reporta el hallazgo inesperado de que almacena Ca
2 + liberación y los niveles luminales puede ser modulada por los niveles fisiológicamente relevantes de BA en DU-145 células epiteliales de cáncer de próstata. Esto es relevante para la comprensión de riesgo de cáncer ya que los niveles sanguíneos de BA se determinan por el consumo de B en agua y alimentos derivados de plantas [17] potable. Es probable que sea la primera respuesta celular a la exposición B y por lo tanto un punto de partida para la comprensión de cómo el riesgo de cáncer de próstata y de pulmón se reduce en B de una manera dependiente de la dosis [16], [21], [22]. BA exhibe los atributos de un antagonista del clásico en que no tiene un efecto inmediato sobre la liberación de Ca
2 + cuando se aplica por sí misma y sus efectos fueron agonista dependiente. BA la posología inhibió de forma dependiente de Ca
2 + liberación en respuesta a cADPR, un agonista endógeno del RyR, y agonistas de la cafeína y el 4-CMC (fig. 2-5). En nuestro análisis de la competencia de unión a ligando, BA muestra la característica de un único antagonista del sitio en que era reversible a mayores concentraciones de cADPR (fig. 2B). BA aumentó K
d, desde 15.1 a la 49,4, pero no afectó Bmax (Tabla 1). BA se ha demostrado que se unen a cADPR a altas concentraciones, sin embargo, la capacidad de BA para inhibir cADPR, la cafeína y la liberación 4CmC inducida por Ca
2 + indica que a concentraciones fisiológicas BA puede unirse al sitio de unión cADPR en el RyR la estabilización de la Ca
2 + canal en su estado inactivo [30].
proliferación de las células LNCaP han sido informado de que alrededor del 10% menos de células no tumorales sensibles y PWR1E son más de 4 veces menos sensible a BA de DU-145 células [16]. También se observó este patrón de sensibilidad en la capacidad de BA para inhibir la cafeína estimula la liberación de Ca
2 +. La concentración mínima eficaz durante DU-145 fue de 10 M BA, LNCaP fue de 20 M de BA, y PWR1E fue de 150 M BA (Figura 3F, 5D & amp;. 6D). Además de la capacidad de respuesta a la disminución de BA, tanto LNCaP y PWR1E no eran sensibles al tratamiento 4CmC. RyR isoformas 1 y 2, pero no 3 son conocidos para ser activado por 4CmC en algunas líneas celulares [41]. Es posible que las diferencias de la línea celular eran debido a diferencias en isoformas RyR o su expresión. líneas de células LNCaP se ha demostrado que expresar RyR 1 y 2, pero no 3 [42]. No hemos podido localizar en la literatura estudios que identificaron isoformas RyR en DU-145 o células PWR1E en cualquier línea celular de próstata.
Pruebas de función renal han mostrado BA es reabsorbido por el riñón en mujeres no embarazadas y embarazadas [43]. El descubrimiento de una electrogénico, de tensión regulada bicarbonato de borato de co-transportador acoplado sodio (NaBC1) en los túbulos renales de rata puede explicar esta observación, pero aún no ha sido confirmado por otro laboratorio. expresión NaBC1 induce la proliferación en las células HEK y Hela por activación de la vía MAPK 16 horas post-tratamiento [13]. No se sabe en este momento si NaBC1 se expresa en líneas celulares de tumor de próstata y no tumorales, pero las diferencias en su expresión se ha planteado como una posible explicación para la variación en la sensibilidad celular a BA entre las células tumorales de próstata y no tumorales [10 ].
para explorar aún más la capacidad de BA para inhibir la liberación de Ca almacenado
2 + hemos probado sus efectos en presencia de CPA (Fig. 7-8). CPA inhibe el canal de SERCA que resulta en el vaciado del Ca
2 + tiendas [44]. Nuestro estudio demostró que la CPA dosis dependiente BA bloqueado mediada Ca
2 + liberación en las células DU-145. También se observó una reducción de almacenamiento de Ca
2 + niveles de 22% a 32% de 10 a 50 M BA trataron células DU-145 en comparación con las células no tratadas. STIM proteínas están implicadas en la activación de Ca
2 + afluencia en la sala de emergencia [45] - [48]. Si BA reduce Ca
2 + fuga a través de los canales RyR la mayor pérdida por fuga puede ocurrir a través presenilinas y otras proteínas no de canal que no estimulan las proteínas STIM. Esto resultaría en una disminución almacenado Ca
2 + niveles que son incapaces de señalar la recarga.
La importancia de Ca
2 + en el control del ciclo celular y la proliferación es una zona bien establecida de la investigación del cáncer, pero no se ha estudiado como un modo de acción en la prevención del cáncer [49] - [51]. la capacidad de BA para modular la proliferación celular se ha relacionado con cambios en la expresión de las ciclinas y de la vía MAPK en las células DU-145, HEK293 y HeLa [13], [16], [26]. Sin embargo, es posible estos efectos se producen en respuesta a la reducción de Ca de liberación o de almacenamiento
2 +. En el cáncer de la línea celular LNCaP de próstata, Humez observó que IGF (5 ng /ml), lo que aumenta el crecimiento celular, el aumento de ER [Ca
2 +]
ER, mientras que TNF alfa (1 ng /ml), que reduce la proliferación celular, reducción del [Ca
2 +]
ER [52].
en conclusión, BA ha sido previamente reportado para reducir el riesgo de cáncer de próstata en seres humanos y reducir el crecimiento del tumor y la próstata proliferación de células cancerosas, la migración y la invasión. Nuestros resultados demuestran que los niveles fisiológicos de agonista BA inhibición estimularon la liberación de Ca almacenado
2 + de una manera dependiente de la dosis y almacenan inferior Ca
2 + niveles de almacenamiento.