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PLOS ONE: regulación de cáncer agresivo en Características del melanoma Las células de microARNs

2016/3/28


Extracto

Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes con funciones de regulación, que están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el cáncer. Una estrategia común para la identificación de miRNAs implicados en la transformación celular es comparar las células malignas a las células normales. Aquí nos centramos en la identificación de miRNAs que regulan el fenotipo agresivo de células de melanoma. Para evitar diferencias debido a los antecedentes genéticos, un alto rendimiento de perfiles de miARN comparativo se realizó en dos líneas celulares de melanoma humano isogénicas que muestran grandes diferencias en sus actividades de proliferación neta, la invasión y la formación del tubo. La selección reveló dos cohortes grandes de miRNAs expresados ​​diferencialmente. Especulamos que los miRNAs hasta reguladas en la línea celular más agresiva contribuyen características oncogénicos, mientras que los miRNAs son reguladas por los supresores de tumores. Esta hipótesis se probó experimentalmente en cinco miRNAs supresores tumorales candidato (miR-31, -34a, -184, -185 y -204) y en uno de los genes miARN candidatos oncogénicos (miR-17-5p), todos los cuales nunca han sido reportados antes en el melanoma cutáneo. Cabe destacar que todos los candidatos de supresión de miRNAs inhibe la formación neta de la proliferación, invasión o tubo, mientras que miR-17-5p mayor proliferación celular. miR-34a y miR-185 se muestra además de inhibir el crecimiento de xenoinjertos de melanoma cuando se implantan en ratones SCID-NOD. Por último, se detectaron los seis candidatos miRNAs en 15 muestras de melanoma metastásico diferentes, lo que demuestra la importancia fisiológica de nuestros hallazgos. En conjunto, estos hallazgos pueden resultar fundamental para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de nuevas tecnologías terapéuticas y de estadificación para el melanoma

Visto:. Greenberg E, L Hershkovitz, Itzhaki O, S Hajdu, Nemlich Y, R Ortenberg, et al. (2011) La regulación de las características agresivas de cáncer en células de melanoma por microARN. PLoS ONE 6 (4): e18936. doi: 10.1371 /journal.pone.0018936

Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega

Recibido: 6 de diciembre de 2010; Aceptado: March 13, 2011; Publicado: 25 Abril 2011

Derechos de Autor © 2011 Greenberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Gal Markel con el apoyo de la Fundación para la Investigación médica Recanati (# 6713). Noam Shomron se apoya en Jefe Oficina Científico, Ministerio de Salud, Israel (# 3-4876); La Fundación Kurz-León; La Universidad de Tel-Aviv, Facultad de Medicina, Fundación Schreiber; y el Fondo de Beneficencia Wolfson familia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el melanoma, un cáncer agresivo que surge de los melanocitos, es uno de los principales tumores malignos que amenazan la vida de nuestra era. A pesar de que es responsable de casi el 4% de todos los cánceres de piel, que causa el 75% de las muertes relacionadas con el cáncer de la piel en todo el mundo y se considera que es la neoplasia maligna más común mortal de los adultos jóvenes [1]. Transformación y desarrollo de metástasis requieren la adquisición gradual de características agresivas. Estos incluyen, por ejemplo, el crecimiento no controlado, resistencia a la apoptosis, la motilidad, la capacidad proteolítica y la adhesión (revisado en [2], [3]). Además, la plasticidad de células de melanoma es evidente por su capacidad para formar estructuras tubulares [4]. Estas estructuras vasculares-como funcionales se componen de células tumorales [5] y su presencia se asocia con un mal pronóstico [6], [7]. El desarrollo reciente de terapia dirigida para el melanoma hace hincapié en la importancia de la delimitación molecular de los mecanismos subyacentes de la patogénesis [8].

Los microARN (miRNA) son, no codificante pequeña, 19-22 nucleótidos de largo moléculas de ARN, que funcionan reguladores epigenéticos como específicos de la expresión génica mediante la inhibición de la traducción de proteínas, lo que lleva a la degradación de ARNm, o ambas cosas [9], [10]. Una vez procesado de sus transcripciones horquilla distintivos y se carga en la proteína Argonauta del complejo de silenciamiento, el par miRNAs con el ARNm citoplásmico para dirigir la represión postranscripcional. La región "semilla", que se encuentra entre los nucleótidos 2 a 8 de la miARN maduro, se une a regiones complementarias en la región sin traducir 3 '(3'-UTR) del ARNm diana. Hasta la fecha, cerca de 1.000 miRNAs humanos se han identificado [11], que se cree que regulan a más del 50% de los genes humanos [12].

miRNAs están involucrados en la regulación de muchos procesos biológicos, tales como el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, el ciclo celular, la apoptosis y la angiogénesis (revisado en [13]). También están directamente implicados en el desarrollo del cáncer, la progresión y la metástasis
in vitro
,
in vivo e informó
incluso en los pacientes [10], [14]. En algunos casos, el cáncer se ve facilitada por la pérdida de ciertas miRNAs, como miR-15/16 clúster en la leucemia linfocítica crónica [15], el miR-34a en el melanoma uveal [16] y miR-31 en el mesotelioma [17]. La pérdida de estos miRNAs mejora la capacidad de invasión, migración y proliferación de células cancerosas. En otros casos, el cáncer se ve facilitada por la sobreexpresión de otros miRNAs, como miR-17-92 clúster [13], [18], que promueve la migración y la invasión en varios tumores malignos.

Actualmente, nuestra conocimiento sobre el papel de los miRNAs en el desarrollo y progresión del melanoma es aún limitada. Recientemente, varios estudios de perfiles de miARN comparativa de melanocitos normales y células de melanoma reveladas: 1) Los grupos de miRNAs asociados con la transformación maligna, la progresión y potencial metastásico [19]; 2) los perfiles de expresión específicos que se asociaron con el estado mutacional y la supervivencia [20]; 3) patrones diferencial de genes miARN en el melanoma de los adultos jóvenes y adultos mayores [21]; y 4) La predicción de la supervivencia después de la recidiva [22]. Sin embargo, ninguno de estos estudios describió miRNAs que determinan directamente las características agresivas de melanoma cutáneo, tales como una mayor proliferación, motilidad y la invasión. Pocos miRNAs inhibidoras se identificaron en el melanoma, incluyendo el miR-34a (melanoma uveal) [16], el miR-193b [23], let-7a [24], y miR-211 [25], [26], mientras que el miR-182 [27] y miR-221/222 [28], se mostró a estimular el potencial metastásico de células de melanoma. Teniendo en cuenta la evaluación crítica de agresiva contra el melanoma no agresivo, y el potencial de la terapéutica, nos resulta imprescindible para conocer los eventos moleculares de melanoma agresivo.

Aquí nos centramos en la identificación de alto rendimiento de miRNAs que están directamente involucrados en la determinación de un fenotipo de células de melanoma agresivo. Dos líneas celulares de melanoma isogénicas con un patrón diferente agresiva, las células C8161 altamente agresivos y las células C81-61 poco agresivas, fueron sometidos a la diferencia de cribado de alto rendimiento de miRNAs. La hipótesis de que debido a los antecedentes isogénicas de las células, los grupos miARN expresados ​​diferencialmente se enriquecen de miRNAs con un efecto directo sobre las características de melanoma agresivos. De hecho, proporcionamos evidencia experimental
in vitro
,
in vivo-
y en muestras de melanoma clínicos que previamente conocidos miRNAs promotores de tumores de tumor supresor y se ajustan a esta hipótesis. Sorprendentemente, se describen nuevos miRNAs con poca información con respecto a su papel en el cáncer, como el miR-185. Se discuten las implicaciones científicas y de la traducción de este estudio.

Resultados

agresividad diferencial de las líneas celulares de melanoma isogénica

El altamente agresiva (HAG) C8161 y poco agresiva (PAG) líneas celulares de melanoma cutáneo C81-61 se derivan de diferentes metástasis del mismo paciente [29]. El fenotipo agresivo diferencial de las células HAG y PAG fue confirmada por cuatro ensayos funcionales diferentes: proliferación, invasión a través de Matrigel, la formación de tubos en Matrigel y la formación de tumores en ratones xenoinjertados. De hecho, las células HAG muestran capacidades de proliferación, la invasión y la formación de tubos sustancialmente más altos
in vitro
, que las células PAG (Figura 1, A-C). Además de la inyección, subcutánea de 1 × 10
6 células HAG forman tumores en ratones SCID-NOD dentro de los cinco días después de la inyección, con un tamaño medio de xenoinjerto de 780 mm
3 por día 30. En contraste, la inyección de 1 × 10 células
6 PAG no desarrollaron tumores medibles en un plazo de 30 días (Figura 1D). Los tumores pequeños PAG (~ 200 mm
3) se observaron & gt; después de la inyección de 90 días de las células PAG (datos no mostrados)

(A) La proliferación se determinó con estandarizada XTT ensayo colorimétrico 24 h después de la siembra. . Se determinó el número de células HAG como 100%. La figura muestra un experimento representativo de tres realizados; (B) El porcentaje de invasión de células de la prueba en un ensayo de invasión de Matrigel 20 h. Los resultados fueron corregidos por la tasa de proliferación. La figura muestra un experimento representativo de tres realizados; Se ensayaron (C) células HAG o células PAG para la actividad de la formación del tubo. microfotografías de campo enteros representativos se muestran a partir de un experimento representativo, de cada tres realizado; (D) Las masas tumorales formadas promedio en ratones SCID-NOD 30 días después de la inyección de 1 x 10
6 células de líneas celulares o HAG PAG. Cada grupo incluía al menos seis ratones.

perfil de expresión diferencial de miRNAs entre la AST y células PAG

La notable diferencia fenotípica entre las dos líneas de melanoma isogénicas compone la plataforma para el estudio de la regulación epigenética de características agresivas de los miRNAs. Se realizó un perfil de alto rendimiento comparativo de miRNAs. Es importante destacar que un conjunto de 81 miRNAs se expresa en niveles más altos en el AST en comparación con las células PAG (HAG
alto). Otro grupo de 69 miRNAs se expresó en niveles inferiores de la AST en comparación con las células PAG (HAG
bajo). Un grupo de 48 miRNAs de los 81 HAG
altos miRNAs no se expresaron en absoluto en las células PAG (Figura 2A), mientras que el 56 miRNAs de los 69 HAG
miRNAs bajas no se detectaron en las células HAG (Figura 2B). El resto de los miRNAs expresados ​​diferencialmente se encontraron en ambas líneas celulares en diferentes cantidades, cuantificables, (Figura 2C). La hipótesis de que estos grupos miARN se enriquecen de miRNAs que están involucrados en la regulación directa de las diferencias fenotípicas distintas. Más específicamente, especuló que los HAG
miRNAs bajas se enriquecen en miRNAs en cuenta los efectos supresores sobre diversas funciones celulares por ejemplo, la proliferación (supresiva miRNAs), mientras que los HAG
altos miRNAs se enriquecen en miRNAs con efectos oncogénicos o promotores de tumores (Oncogénicos miRNAs) (Figura 2).

(A) La lista de miRNAs que son expresado en las células HAG, pero no en las células PAG; (B) La lista de miRNAs que se expresan en las células de PAG, pero no en las células HAG; (C) Expresión relativa de miRNAs que se expresan tanto en células de AST y PAG. La expresión de la relación HAG-a-PAG (eje Y) se muestra como 2∧-ΔΔCt. AST
baja representa miRNAs con baja relación HAG-a-PAG. AST
alta representa miRNAs con alta relación HAG-a-PAG.

Selección de miRNAs para ensayos funcionales específicos

Nos hemos centrado principalmente en la AST
miRNAs bajas, lo cual son presumiblemente tumor supresor y podría servir de base para nuevas líneas de tratamiento para el melanoma. miRNAs con potencial-tumor supresor se analizaron para objetivos previsto con el algoritmo TargetScan [30] y en los procesos biológicos afectados con Miranda (miRpath) algoritmo [31]. Todos los procesos biológicos potencialmente afectados fueron clasificados de acuerdo con el valor total P, con un corte de & lt; 0,01. Además enfoque en los procesos robustos fue posible gracias a la selección de los procesos biológicos que incluyen al menos 30 candidatos genes diana. Sorprendentemente, estos pasos computacionales destacaron cuatro procesos biológicos que son altamente involucrados en el cáncer, incluyendo vía Wnt genes (82, P = 1,7 × 10
-9), adhesión focal (100 genes, P = 8,6 × 10
- 9), vía MAPK (120 genes, p = 2 × 10
-7) y la vía de la fosfatidilinositol (35 genes, P = 7,2 × 10
-3). Veintinueve de los miRNAs se prevé que apuntar a los cuatro procesos, con sólo el 12 han sido citadas para ejercer un efecto supresor de forma experimental en cualquier tipo de cáncer.

En total, cinco candidatos supresiva miRNAs, que nunca han sido estudiados en el melanoma, fueron seleccionados para la clonación y pruebas experimentales. Tres miRNAs estaban dentro del rango de expresión (miR-34a, miR-185 y miR-204, Figura 2C) y dos que fueron silenciados (miR-31 y miR-184, Figura 2B) en las células HAG. miR-17 fue seleccionado como un ejemplo para el candidato Oncogénicos miARN (Figura 2C). La expresión diferencial de cada uno de estos miRNAs fue validado en dos preparaciones de ARN independientes (datos no mostrados). Los diferentes roles de miR-17, miR-31 y miR-34a en el cáncer se ha informado antes, aunque nunca en el melanoma cutáneo. Por el contrario, existe escasa evidencia sobre el papel de los miRNAs -184, -185 y -204 en el cáncer. Ejemplar predijo papeles en las funciones biológicas y moleculares relativas a estos miRNAs se resumen en el cuadro complementario S1 [32].

perfil de expresión de miRNAs en especímenes clínicos de melanoma

Quince cultivos primarios derivados de pacientes de melanoma se analizaron para el nivel de expresión de los miRNAs seleccionados. Se establecieron todas las culturas del melanoma de metástasis a distancia. Datos adicionales sobre los pacientes se proporciona en el cuadro complementario S2. Como era de esperar, se observó una considerable variabilidad en la expresión de los genes miARN entre las muestras individuales, principalmente de miR-31 (Figura 3). El nivel de expresión media de más de supresión candidato miRNAs en las muestras clínicas fue entre los correspondientes valores de miARN en las células PAG y HAG, a excepción de miR-185 y miR-31. Mientras que el nivel medio de miR-185 estaba muy cerca de las células PAG, miR-31 niveles fueron claramente más alta incluso que las células PAG (Figura 3). Por el contrario, la expresión media del candidato oncogénico miR-17 entre las muestras clínicas fue incluso mayor que en las células HAG (Figura 3). Los patrones de expresión de genes miARN en muestras clínicas muestran que la mayor parte directamente candidato supresor miRNAs, a excepción de miR-31, se expresan en niveles significativamente más bajos que el candidato Oncogénicos miR-17 (Figura 3). Estos resultados concuerdan con nuestra hipótesis y sugieren que el enfoque utilizado para identificar supresiva funcional y Oncogénicos miRNAs tiene motivos fisiológicamente relevantes.

La expresión del candidato o de supresión (barras rayadas) Oncogénicos miRNAs, como se ha indicado, en la AST, PAG (barras grises) y 15 cultivos primarios de bajo paso del melanoma metastásico (barras negras). La línea horizontal representa la expresión media. Eje Y indica la expresión absoluta de cada miARN después de la normalización para el control endógeno U6 en cada muestra, y se presenta como 1 /? Ct.

Reglamento del fenotipo agresivo de células de melanoma por el candidato supresor miRNAs

Determinación de miRNAs que inhiben el fenotipo agresivo del melanoma podría convertirse en una base para el desarrollo de nuevas plataformas para la terapia del cáncer. Con el fin de evaluar el efecto funcional del candidato supresiva miRNAs en las características agresivas de melanoma, hemos clonado y de forma estable los sobre-expresan en células HAG para evaluar su efecto in vitro e in vivo. Un vector vacío sirvió como control. Un exceso de expresión de al menos 50 veces fue confirmada por PCR en tiempo real (Figura 4A). El fenotipo de las células transducidas fue probado
in vitro Opiniones de actividades de proliferación, la invasión y la formación del tubo. Sorprendentemente, una inhibición sustancial y consistente en la proliferación neta fue conferido por el miR-31, miR-34a, miR-184 y miR-185 en comparación con la célula control (Figura 4B). miR-204 no inhibió la proliferación de células HAG (Figura 4B). Por el contrario, el miR-204 marcadamente inhibida la actividad invasión de las células HAG (Figura 4C). Invasion se inhibió de manera similar por miR-184, pero no por el otro supresiva miRNAs (Figura 4C).

(A) Verificación de la sobre expresión de miRNAs en transductantes HAG, en comparación con las células transducidas de forma simulada. Eje Y indica el cambio veces por encima de modelo de las células transducidas. (B) la proliferación neta de los transductores se cuantificó con XTT prueba estandarizada. Se determinó el número de células 48 h después de la siembra. Se determinó el número de bocetos transductantes como 100%. La Figura muestra un experimento representativo de tres realizados. (C) la actividad Invasión de transductores se cuantificó con ensayo de invasión de 20 h-matrigel, con corrección para la proliferación. La tasa de invasión de las células transducidas de forma simulada se determinó como 100%. La figura muestra un experimento representativo de 3 realizado. * Indica P & lt; 0,05, ** indica P & lt; 0,01 (de 2 colas

t-test)

actividad de formación del tubo fue inhibida sustancialmente por el miR-34a y miR-185. y más ligeramente por miR-31 y miR-184, pero no por miR-204, en comparación con el control (Figura 5, a-F). La cuantificación de la longitud total del tubo se ha realizado mediante ImageJ. Es importante destacar que la evaluación cualitativa de las capturas micrográficos (Figura 5, A-F) se mostró de acuerdo con el análisis cuantitativo de longitud total (Figura 5G). Los efectos diferenciales de la miRNAs no podían atribuirse simplemente a sus diferenciales sobre-expresión intensidades (Figura 4A). Casi todas las células eran viables cuando se ensayó, como es evidente por & lt; 5% de tripano positivo tinción azul (datos no mostrados)

Tubo capacidad formación de transductantes se puso a prueba en cultivo 3D, 24 h después de la siembra.. Cada experimento se realizó en pocillos por triplicado. (A) Una microfotografía representativa de una cultura 3D de las células transducidas HAG-Mock; (B-F) microfotografías representativas de células transducidas HAG-miARN, como se indica en cada imagen. Todas las imágenes fueron capturadas bajo magnificación × 40. Todas las imágenes (A-F) se derivaron de la misma experimento representativo se muestra, de tres realizados. (G) la formación del tubo se cuantificó usando el plugin de ImageJ analizar esqueleto. La figura muestra la duración media calculada para cada transductante de todas las microfotografías capturados en los tres experimentos realizados. * Indica P & lt; 0,05, ** indica P & lt; 0,01 (de 2 colas
t-test
) guía empresas
En su conjunto, los cinco candidatos miRNAs supresiva de hecho ejercidas efectos inhibidores significativos sobre. diversas características agresivas de las células de melanoma. Esto coincide con su regulación por disminución sustancial en las células HAG (Figura 2) y su baja expresión general en muestras clínicas (Figura 3). Esto también fortalece nuestra proyección miARN de alto rendimiento y destaca su fiabilidad.

Facilitación del fenotipo agresivo de células de melanoma por el candidato Oncogénicos miARN

Desde el papel funcional de los genes miARN 17-92 clusters en el cáncer es bien establecido, sin embargo, nunca se ha puesto a prueba en el melanoma cutáneo, se evaluó el miR-17 por su efecto sobre la agresividad de las células PAG. miR-17 fue clonado y de forma estable sobre-expresado en las células PAG. Un vector vacío sirvió como control. A 25 veces la sobre expresión de miR-17 se verificó mediante PCR en tiempo real (Figura 6A). Es importante destacar que, las células transducidas PAG-miR-17 muestran una actividad proliferativa significativamente mayor (Figura 6B), pero no la capacidad invasiva (Figura 6C) o actividad de formación de tubo (datos no mostrados). Estos resultados apoyan los efectos potencialmente oncogénicas de miR-17 en el melanoma.

(A) Verificación de miR-17-5p sobre-expresión en transductores de PAG, en comparación con el modelo de las células transducidas. Eje Y indica el cambio veces por encima de modelo de las células transducidas. (B) la proliferación neta de los transductores PAG se cuantificó con XTT prueba estandarizada. Se determinó el número de células 48 h después de la siembra. Se determinó el número de bocetos transductantes como 100%. La figura muestra un experimento representativo de 3 realizado. (C) La invasión de la actividad transductores PAG se cuantificó con ensayo de invasión de 20 h-matrigel, con corrección para la proliferación. El eje Y indica el porcentaje de células invadidas. La Figura muestra un experimento representativo de tres realizados. ** Indica P & lt;. 0.01 (de 2 colas
t-test
) guía empresas
regulación miARN mediada por las características del melanoma agresivo
in vivo

en la biología del cáncer,
in vitro
resultados a menudo no reflejan necesariamente
in vivo
comportamiento. Con este fin, se evaluaron adicionalmente los efectos de miRNAs supresores seleccionados
in vivo en modelos
melanoma xenoinjertos. El efecto supresor de la miRNAs, miR-34a y miR-185 en el crecimiento del tumor se midió después de la inyección subcutánea de 3 × 10
5 transductores HAG. Las masas tumorales fueron controlados durante 28 días después de la inyección. La sobreexpresión de la miRNAs específicos se confirmó pre-inyección (datos no mostrados). Es importante destacar que se observó una inhibición estadísticamente significativa en el crecimiento del tumor tanto en miR-34a y miR-185 transducatnts, en comparación con el control de los tumores (Figura 7A). Coincidiendo con estos resultados,
ex-vivo
pesaje de explantes tumorales después de la terminación de los experimentos confirmaron que la masa tumoral promedio de ambos miR-34a y miR-185 transducatnts fue menor que los tumores modelo de transduced (Figura 7B) . El
in vivo
se confirmó en los explantes tumorales (Figura 7C) sobre-expresión de los miRNAs transducidas. Estos resultados corroboran con los resultados de la expresión y efectos supresores funcionales demostraron
in vitro gratis (Figura 4-5).

(A) Vigilancia del crecimiento tumoral en ratones SCID-NOD. Cada grupo estaba compuesto por siete ratones. Se muestra un experimento representativo de cuatro realizados. La significación estadística se probó con emparejado-2-cola
t-test
; (B) El peso medio de los tumores explantados a la terminación del experimento. La significación estadística se probó con
t-test página 2 de cola; (C) El exceso de expresión de miRNAs transducidas se confirmó después de la terminación del experimento en todos los tumores con qPCR. * Indica P & lt;. 0,05

Discusión

Hasta la fecha, la mayoría de los intentos para caracterizar el papel de los miRNAs en el cáncer en general o el melanoma, en particular, se han centrado en el perfil diferencial de la normalidad las células en comparación con sus células malignas de contrapartida [19], [20]. Este enfoque permitió la identificación de miRNAs que participan en el proceso de transformación maligna. Aquí nos hemos centrado en la identificación de miRNAs que regulan directamente las características agresivas de cáncer de las células del melanoma. El objetivo de este enfoque fue mapear los miRNAs que podrían estar involucrados de manera mecánica en diferentes fenotipos de la enfermedad y, finalmente delinear su papel regulador de características agresivos contra el cáncer. Se utilizaron dos líneas celulares de melanoma emparejados isogénicas que se derivaron de dos metástasis diferentes del mismo paciente. Estas líneas celulares difieren significativamente en sus propiedades invasivas, proliferativas y tumorigénicas (Figura 1). Debido a los antecedentes genéticos de las células compartida, nuestra razón fue que la expresión diferencial de miRNAs se correlaciona bien con su diferencial fenotipo agresivo.

La selección de alto rendimiento reveló una gran cohorte de miRNAs expresados ​​diferencialmente entre altamente (HAG ) y mal (PAG) pasivo-agresiva de melanoma líneas celulares (Figura 2). La hipótesis de que HAG
miRNAs son bajos y que supresora de AST
altos miRNAs son oncogénicos. De hecho, proporcionamos pruebas que apoyan nuestra hipótesis, por la expresión ectópica de cinco seleccionados HAG
miRNAs bajos en las células HAG (Figuras 4, 5, 7) y uno de AST
alta miARN en células PAG, como representante de esta grupo (Figura 6). Este es el primer informe para demostrar con éxito un enfoque sistemático para la identificación metodológica de miRNAs que regulan directamente las características agresivos contra el cáncer. La riqueza de miRNAs identificados que regulan las características de agresividad de células de melanoma es compatible con el uso de líneas celulares isogénicas con fenotipo diferenciado como una plataforma de cribado.

La expresión de estos miRNAs se validó en cultivos primarios de baja 15 de paso, con el nivel de miR-17 es más alta que la de la supresiva miRs, confirmando así la importancia fisiológica (Figura 3) significa. La expresión de estos miRNAs se debe estudiar más en el futuro en microarrays de tejidos progresión y su valor pronóstico a prueba en consecuencia.

En el presente trabajo nos hemos centrado en un grupo de cualquiera de miRNAs bien caracterizados se sabe que tienen un papel en la otros tumores malignos (miR-17, miR-31 y miR-34a), y en un segundo grupo de miRNAs relativamente no estudiadas con respecto a su papel en los procesos malignos (miR-184, miR-185, miR-204). Digno de mención, los papeles de todos estos miRNAs nunca han sido descritas en el melanoma cutáneo.

miR-31 se informó que ejercen efectos inhibidores sobre la metástasis en el cáncer de mama [33], [34] y en el mesotelioma [17] , mientras que tiene un papel oncogénico potencial en como carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas y el cáncer de pulmón [35], [36]. miR-34a se informó de forma consistente como un supresor miARN en muchos tumores malignos [37]. Nuestros resultados concuerdan con el papel inhibitorio sugerido para miR-34a y miR-31. Por otra parte, miR-34a se ha informado anteriormente para apuntar c-Met [16]. Desde c-Met se ha informado para participar en los procesos de tubulogénesis través del sistema de c-Met /HGF [38], es tentador especular que el mecanismo por el que miR-34a inhibe la formación de tubo es a través de este gen. Las propiedades oncogénicas de miR-17-5p se discutieron en las publicaciones anteriores en otros tumores malignos [13]. De acuerdo con estos informes, la expresión ectópica de miR-17-5p células en el PAG mayor tasa de proliferación (Figura 6B).

Por el contrario, se sabe muy poco acerca de miR-184, miR-185 y miR 204 en el cáncer. La mayoría de los estudios actuales sobre el miR-184 y miR-204 se centran en sus funciones en el desarrollo y la morfogénesis, el que podría predecirse computacionalmente (cuadro complementario S1). Las pocas publicaciones sobre el miR-184 en el cáncer mostraron efectos contradictorios, ya sea de supresión [39] o oncogénico [40]. Un solo informe mostró que el miR-204 inhibe la metástasis en cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [41]. Otro informe describió regulación a la baja de miR-204 en el melanoma sublínea altamente invasiva en comparación con sus contrapartes isogénicas no invasivo [19], el apoyo a nuestras conclusiones con respecto a la actividad de la invasión de inhibición de miR-204 (Fig. 4C). miR-185 sigue siendo sobre todo sin estudiar, pero recientemente se ha demostrado que ejercen efectos supresores en varios tumores malignos a través de la orientación Six1 oncogén [42], [43]. El reto futuro sería para delinear las redes de genes diana de estos miRNAs y entender las bases moleculares de su función supresora de tumores.

Los efectos de cada miARN individuales pueden no parecer ser idénticos entre
in vitro Opiniones y
in vivo
configuraciones. Por ejemplo, mientras que los miRNAs-34a y -185 exhiben fuertes efectos anti-proliferativos
in vitro gratis (Figura 4B), afectaban mucho más moderada tasa de crecimiento del tumor
in vivo gratis (Figura 7A ). Esto podría atribuirse a una gran diferencia en la intensidad de la expresión entre
in vitro
y
in vivo
configuración (Figura 4A y 7C). Sin embargo, el
in vivo
experimentos sugieren que incluso cuando el nivel de expresión es relativamente débil (Figura 7C), un resultado experimental que tiene en cuenta varios procesos biológicos, como el crecimiento del tumor, puede todavía reflejan la efecto supresor de la sobre-expresado miARN (Figura 7). Por otra parte, estos experimentos simplifican la posibilidad de efectos reguladores combinatorias de diferentes miRNAs, que pueden trabajar ya sea en concierto o interferencia [44]. Por lo tanto, una regulación a la baja coordinada y regulación al alza de miRNAs pueden dan forma a un determinado fenotipo, incluso cuando las alteraciones en cada nivel de expresión de los genes miARN no son extremas. De hecho, hemos observado varias correlaciones estadísticas directas e inversas entre la prueba de supresión miRNAs en las muestras de melanoma clínicos, lo que podría sugerir efectos sinérgicos o antagonistas entre ellos (datos no mostrados). El resultado de las interacciones entre los diferentes miRNAs supresores debe investigarse más a profundizar nuestra comprensión de conformación fenotipo por los patrones miARN combinatorias, y puesto que las combinaciones de inhibidores sinérgicos podrían proporcionar una sólida ventaja para la terapia innovadora.

En conclusión, este es el primer informe que demostró con éxito un enfoque sistemático para la identificación de miRNAs que regulan directamente las características agresivos contra el cáncer. Describimos seis miRNAs que contribuyen al fenotipo agresivo del melanoma cutáneo, tanto
in vitro
y
in vivo
, y vinculado a estas observaciones muestras clínicas. La identificación de miRNAs que dan forma al fenotipo agresivo de la enfermedad puede conducir al desarrollo de la terapia innovadora futuro y sistemas de estadificación molecular. Publicaciones recientes mostraron la posibilidad de apuntar a metástasis de melanoma experimentales usando nanopartículas que transportan el miR-34a [45] o un agonista sintético miARN [46].

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Todo el trabajo con animales en ratones se llevó a cabo tras la aprobación de una Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Sheba (562/2010). Se obtuvieron todas las muestras clínicas procedentes de pacientes, de los cuales las culturas de melanoma eran establecer, tras la aprobación del comité de ética del Ministerio de Salud de Israel (aprobación Imoh Nº 3518/2004). Todos los pacientes han firmado voluntariamente en un formulario de consentimiento informado

Las células

Las dos líneas isogénicas humanos melanoma cutáneo de células C8161 células. (Altamente agresiva - HAG) y el C81-61 poco agresiva (mal agresivo - PAG) [29] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Maria Hendrix (Centro de Investigación Infantil Memorial, Chicago, EE.UU.). Estas líneas celulares se derivan de dos diferentes metástasis del mismo paciente. cultivos primarios de melanoma se desarrollaron a partir de lesiones metastásicas de melanoma extirpados quirúrgicamente (aprobación Imoh Nº 3518/2004) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [47]. las células se cultivaron en PAG suplemento de medio F10 de Ham con 15% de FBS, Pen /Strep y 1 × MITO + (BD Biosciences). Humana normal epidérmico Los melanocitos se mantuvieron en un medio único libre de suero (PromoCell). células 293T (ATCC) se mantuvieron en DMEM (Gibco /Invitrogen) que contiene 10% de FBS (DMEM /FBS).

miARN análisis de la expresión

El ARN total se aisló usando el kit de aislamiento mirVana miRNA ( Ambion). La selección de alto rendimiento de los genes miARN se realizó mediante PCR en tiempo real utilizando el formato TLDA kits TaqMan microARN (Applied Biosystems). Expresión de miRNAs específicos y U6 RNA (como control endógeno) se realizó después de la transcripción inversa a partir de & lt; 200 fracciones de ARN nt, utilizando los kits TaqMan microARN (Applied Biosystems). niveles de corte de significación se determinaron como relación de al menos 4 veces entre las muestras analizadas y el ciclo 36 como el límite para el rango de expresión, sobre la base de nuestra evaluación anterior de esta tecnología.

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