Extracto
Antecedentes
ARNs no codificantes largo (lncRNAs) desempeñan papeles generalizados en la regulación de genes y los procesos celulares. Sin embargo, el papel funcional de lncRNAs en el cáncer colorrectal (CRC) Aún no se han dilucidado. El objetivo del presente estudio fue medir los niveles de expresión 91H lncRNA en el CCR y evaluar su importancia clínica y papeles biológicos en el desarrollo y progresión de la CRC.
Métodos
expresión 91H y copia la variación del número (CNV) se midieron en 72 tejidos tumorales de CRC y los tejidos normales adyacentes por PCR en tiempo real. Las funciones biológicas de 91H fueron evaluados por MTT, el ensayo cero herida, ensayos de migración y la invasión, y citometría de flujo.
Resultados
91H se sobreexpresa significativamente en el tejido canceroso y líneas celulares de CRC en comparación con los adyacentes tejido normal y una línea celular humana normal epitelial intestinal. Por otra parte, la sobreexpresión 91H estaba estrechamente asociado con metástasis a distancia y de mal pronóstico en pacientes con CCR, a excepción de la CNV de 91H. El análisis multivariado indicó que la expresión 91H era un indicador pronóstico independiente, así como metástasis a distancia. Nuestros datos in vitro indican que desmontables de 91H inhibe la proliferación, la migración y la invasión de las células CRC.
Conclusiones
91H jugó un papel importante en la etiología molecular de la CRC y podría considerarse como una novela indicador pronóstico en pacientes con CCR
Visto:. Deng Q, Él B, Gao T, Pan Y, Sun H, Xu Y, et al. (2014) sobre regulación de 91H Promueve la metástasis tumoral y predice mal pronóstico para los pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (7): e103022. doi: 10.1371 /journal.pone.0103022
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2014; Aceptado: June 23, 2014; Publicado: 24 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Deng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China, Nanjing de Ciencia y Tecnología (Proyecto Comité (sin 81172141, 81200401). no.201108025), Nanjing Proyecto Médico desarrollo de la tecnología (no. ZKX11025), Proyecto Talento Nanjing Salud joven, Talentos de Jiangsu clave Provincial médicos a SKW, Nanjing de Ciencia médica y Técnica de la Fundación de Desarrollo de YQP (Sin. QRX11255) y B.S.H. (Sin. QRX11254). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una causa común de muerte por cáncer en el mundo debido a la presentación del tumor tarde y progresión rápida, con cerca de 14,1 millones de nuevos casos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en todo el mundo en el año 2012 [1]. En los países en vías de desarrollo económico, el CRC es cada vez más frecuente, especialmente en China [2]. A pesar de importantes avances logrados en el diagnóstico y el tratamiento del CCR en los últimos años, la tasa de supervivencia global a 5 años sigue siendo insatisfactoria debido a la metástasis que conduce a resultados pobres [3]. . Por lo tanto, a buscar nuevos marcadores moleculares o factores es necesario y urgente para la detección temprana, antes de metástasis a distancia aparece y predecir el pronóstico en pacientes con CCR
Estudios recientes han revelado que lncRNAs, & gt; 200 nucleótidos de longitud, juego un papel crítico en el desarrollo y progresión del cáncer. A pesar de una menor comprensión así de lncRNAs en comparación con los microRNAs [3], [4], [5], las evidencias que se acumulan indican que la biología mediada por lncRNAs podría estar implicado en la regulación de diversos procesos celulares, tales como el crecimiento celular y la apoptosis, se derivan pluripotencia celular y el desarrollo, la entrada de la meiosis y la longitud de los telómeros [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Sin embargo, similar a los genes y micorRNAs codificantes de proteínas, lncRNAs puede funcionar como oncogenes o la supresión de tumores, y la expresión aberrante de ellos estaba asociado con la carcinogénesis. Alta expresión de PVT-1 de expresión en los tejidos cancerosos se consideró como un factor de riesgo independiente para la supervivencia global de los pacientes con CCR [12], y el aire caliente, que funciona como un oncogén o un supresor de tumores, fue implicado en la regulación epigenética de los cánceres [7], [13], que fue considerado como un fuerte fabricante de pronóstico que contribuyó a predecir la metástasis y la supervivencia de los pacientes en el cáncer de mama primario [7].
91H, H19 ARN antisentido, era una novela lncRNA que se encuentra en la posición del H19 /IGF2 locus (número de acceso NC_000011.9) con 119.329 kbs de longitud. La transcripción de 91H se sobreexpresa en el cáncer de mama humano que estuvo involucrado en la regulación de la expresión de IGF2 en trans [14]. Sin embargo, pocos estudios han investigado las funciones de 91H en otras formas de cáncer humano, incluyendo CRC. Para explorar las posibles funciones biológicas de 91H en el desarrollo y progresión del CRC, el presente estudio se llevó a cabo mediante el examen del patrón de expresión de 91H en los tejidos tumorales CRC y los tejidos normales adyacentes y la investigación de las funciones biológicas mediante la evaluación de la capacidad de invasión, la migración, y la apoptosis de las células CRC con caída 91H in vitro.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas y líneas celulares
72 tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes emparejados se obtuvieron de CRC inscrito los pacientes que se sometieron a cirugía en Nanjing primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing, entre 2011 y 2014. en particular, los tejidos normales adyacentes, se tomaron 5-10 cm de distancia de los tejidos tumorales. Todas las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ADN y ARN. Ningún paciente recibió quimioterapia o radioterapia en el pre-operación. La información clínica de estos pacientes se recogió incluyendo edad, sexo, localización del tumor, el estadio TNM, el grado del tumor y la inestabilidad microstellite (MSI) estatus como estudio previo [15] informó. Los períodos de seguimiento variaron de 2 meses a 3 años, con una media de 26,6 meses. Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes y se confirmaron histológicamente. El comité de ética médica de la Nanjing Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing aprobó el estudio.
Las líneas celulares HCT8, HT29, HCT116, SW620 (líneas celulares de cáncer de colon humano) y FHC (línea celular humana normal intestinal epitelial) se obtuvieron de Shanghai Recolección de células de la Academia china de Ciencias. Todos por encima de las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (Hyclone, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2
Extracción. del total de ARN y ADN genómico, la síntesis de ADNc, y QRT-PCR
ARN total y el ADN genómico (gDNA) se extrajo a partir de tejidos y líneas celulares utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA) y EZNA Kit de ADN de tejidos (Omega, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante por separado. cDNA fue sintetizado utilizando el kit de reactivos PrimeScript TA con gDNA Borrador (Takara, China) y se utilizó para el análisis de nivel de expresión 91H cuantitativa por PCR en tiempo real (QRT-PCR) con los siguientes cebadores: adelante, 5'-3 GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC; y revertir, 5-CATCCAGTTGACCGAGCTTG-3. β-actina se utilizó como control interno con las siguientes secuencias: hacia adelante, 5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3; Reverso: 5-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3. El método 2
-ΔΔCt se realizó para calcular la cantidad relativa de 91H en comparación con la expresión de β-actina. QRT-PCR se realizó utilizando el SYBR Premezcla Ex TAGTM II (Takara, China) y ABI 7500 System (Applied Biosystems, EE.UU.).
Copia de identificación de la variación del número de 91H
Análisis de la CNV para ADNg también se realizó mediante qRT-PCR que se ha descrito anteriormente método. RNasa P se utilizó como gen de referencia. El número de copias de 91H se contó después de la ecuación 2 × 2
-ΔΔCT.
Transfección de ARNsi
interferencia de ARN se realizó mediante el uso de los dúplex de siRNA sintéticos, como se describe por estudios anteriores [ ,,,0],16], [17]. Dos dúplex de siRNA sintéticos (si-91H: si91H1, 5'-GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 'y si91H2, 5'-UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT-3') correspondientes a las secuencias de ARN 91H y un control negativo (si-NC, 5'-CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT-3 ') se transfectaron en células HCT-116 con 400 pmol respectivamente usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) en la placa de 6 pocillos. Después de 48 horas, los niveles de expresión 91H se examinaron mediante qRT-PCR.
proliferación de las células de ensayo
después de la transfección durante 48 horas como se describió anteriormente, las células infectadas HCT-116 se recogieron posteriormente para ensayo de proliferación celular (ensayo MTT) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células infectadas (1 × 10
4) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano suplementadas con 100 DMEM l por pocillo. Después de incubación durante 6, 24, 48, 72 y 96 horas respectivamente, se añadieron 10 l de MTT a cada pocillo, a continuación, se retiró el medio después de 4 horas de cultivo y, posteriormente, suplementado con 150 DMSO l por pocillo. El análisis colorimétrico se realizó en un lector de microplacas a 490 nm de longitud de onda. Cada subgrupo se repitió durante cinco pozos.
migración y la invasión ensayos
Para el ensayo de migración, infectaron células HCT-116 (1 × 10
5 en 200 l de DMEM libre de suero) , tal como se ha descrito anteriormente, se sembraron en la cámara superior de placas Transwell en un formato de 24 pocillos con 8 mm de diámetro (Corning Costar, EE.UU.). se añadieron 600 l de DMEM que contenía FBS al 5% a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 24 horas de cultivo, las células se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta. Las células restantes fueron retirados de la parte superior de la membrana permeable con un bastoncillo de algodón. Luego, las células que migraron a través de la cámara superior se contaron en cinco campos aleatorios bajo un microscopio de luz, y se expresó el valor medio de cinco campos.
Para el ensayo de invasión, las cámaras superiores se recubrieron con la membrana basal Matrigel (40 mg /ml, Becton-Dickinson, EE.UU.) a 37 ° C durante 30 min. Las células infectadas (3 × 10
5) con DMEM libre de suero se añadieron a las cámaras superiores, las cámaras inferiores se rellenaron con DMEM que contiene 10% de FBS. Después de 24 horas de incubación, se fijaron las células que invadieron el reverso de las principales cámaras y tiñen y se calcularon usando un microscopio de luz. Cada ensayo de invasión se realizó en tres o más repeticiones.
arañazos herida ensayo
placas de seis pocillos se recubrieron con células infectadas HCT-116. Las heridas se crearon en las células confluentes con una punta de pipeta de 10 l a las 48 horas después de la transfección. Posteriormente las células flotantes y los desechos se retiraron usando PBS, y se añadió medio FBS-libre. A continuación, se observó la cicatrización de heridas en diferentes períodos de tiempo y fotografiamos líneas de raspado representativas utilizando el microscopio de luz. Cada experimento se repitió por triplicado.
análisis Apoptosis
apoptosis celular se determinó usando citometría de flujo después de la tinción con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI, BD Bioscience, CA). Las células HCT-116 se infectaron con si-si-91H o NC en placa de 6 pocillos. La apoptosis se analizó después de la infección 48 horas. Todos los ensayos de apoptosis se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
óptimos niveles de corte de 91H en canceroso /canceroso se calcularon aplicando el receptor análisis de curva ROC (ROC) [18], [19]. La comparación de los datos continuos se analizaron mediante una organización independiente
t-test
, y los datos categóricos se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. Mientras tanto, las tasas de supervivencia se calcularon mediante análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. Se realizaron un modelo de riesgos proporcionales de Cox análisis univariante y multivariante para determinar el impacto de expresión 91H y parámetros clínico sobre la supervivencia global (SG). Nomograma para el sistema operativo se estableció mediante la aplicación de software R. Se utilizó índice de concordancia de Harrell (índice C) para estimar la exactitud predictiva de la misma. Estadística con el
P-valor
& lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo. Todos estos cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software de IBM SPSS 20.0 (IBM, EE.UU.), R 3.0.3 del software (Instituto de Estadística y Matemática, Viena, Austria), Origin software 8.5.1 (OriginLab Corp., Northampton, EE.UU.) y GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, EE.UU.).
resultados
Correlación entre 91H expresión relativa y los factores clínico-patológicos en el CCR
El 91H niveles de expresión se determinaron mediante qRT-PCR para 72 cancerosa y tejidos no cancerosos adyacentes de pacientes con CRC. 91h niveles en los tejidos cancerosos eran obviamente superiores a los de los tejidos no cancerosos (
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1). análisis de la curva ROC reveló que los niveles óptimos de corte para la expresión 91H eran 2,86 veces para el sistema operativo en canceroso /no canceroso (Figura 2). A continuación, los 72 pacientes con CRC se dividieron en un grupo de la expresión de alto 91H (n = 42) que la relación de expresión 91H ≥2.86 y un grupo expresión bajo 91H (n = 30) que la relación de expresión 91H & lt; 2,86 (Figura 3), de acuerdo con El nivel límite. factores clinicopatológicos se compararon entre los dos grupos de expresión 91H (Tabla 1). 91H expresión se correlacionó significativamente con metástasis a distancia (
P = 0,027
). Sin embargo, la expresión 91H casi no se correlacionó con el sexo de los pacientes, edad, localización del tumor, el estadio TNM, N etapa o grado. Para estimar aún más la correlación entre la expresión 91H y el pronóstico de los pacientes con CCR, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y log-rank pruebas se realizaron con el tiempo de supervivencia postoperatoria de los pacientes. Los resultados indicaron que los pacientes con una expresión de alto 91H tenían un pronóstico más pobre que, obviamente, aquellos con baja expresión 91H (
P Hotel & lt; 0,001, Figura 4).
análisis univariados de análisis general reveló que la expresión relativa 91H, estadio TNM, metástasis a distancia o grado eran indicadores de pronóstico (tabla 2). Por otra parte, 91H expresión relativa y metástasis a distancia fueron los indicadores pronósticos independientes para la tasa de supervivencia global de los pacientes con CCR (HR: 3,66,
P = 0,001
; HR: 8,97,
P Hotel & lt; 0,001 ), respectivamente, por el análisis multivariante (tabla 2). Además, se estableció nomograma de pronóstico con factores clínico-patológicos y la expresión 91H para predecir la probabilidad de que los pacientes con CCR morirían dentro de los 3 años de su cirugía inicial, suponiendo que los pacientes no murieron por otras causas primero (Figura 5). Mientras tanto, la exactitud de predicción del nomograma se midió a través de un índice de concordancia (índice C). Por CRC, nomograma que contiene 91H tenía más exactitud predictiva que sin 91H (c-index: 0,90 frente a 0,85, respectivamente)
variación del número de copias de ADN (CNV) no estaba involucrado en arriba. regulación de la expresión 91H
Para determinar si el nivel de expresión 91H en el CCR se asoció con la CNV, el patrón de expresión de 91H se midió mediante QRT-PCR, y se estima además la concordancia entre el número de copias de ADN 91H y 91H nivel relativo de expresión . Sólo 2,8% (2/72) de los tejidos normales y tumorales emparejadas con CNV mostró la sobreexpresión de 91H. Sin embargo, se detectó la expresión aberrante de 91H en el 95,8% (69/72) de los tejidos normales y tumorales emparejadas sin alteración del número de copias (Figura 6).
A, la expresión relativa 91H en los tejidos cancerosos y no cancerosos emparejados se midió mediante qRT-PCR. β-actina se consideró como el control interno. B, La variación del número de copias de 91H en los tejidos cancerosos y no cancerosos También se midió mediante qRT-PCR. RNasa P se utilizó como gen de referencia.
proliferación 91H promovido, la invasión y la migración de las células in vitro CRC
Para evaluar las funciones biológicas de las 91H, se midieron los niveles de expresión en 91h una variedad de líneas celulares (FHC, HCT-8, HT-29, HCT-116, y SW-620) por qRT-PCR. Como se muestra en la Figura 7, la expresión se detectó 91H los niveles más altos en HCT-8, HT-29 y HCT-116 en comparación con FHC, a excepción de SW-620. Posteriormente, las células HCT-116 se transfectaron con si-si-91H o NC. Después de la transfección durante 48 horas, 91H fue silenciado efectivamente en células HCT-116 (Figura 8).
A continuación trató de determinar si 91H desmontables proliferación de las células afectadas por el ensayo MTT. Los datos, en comparación con las células HCT-116 infectadas con si-NC, mostraron que la proliferación de las células HCT-116 con si-91H fue habitada al 36,7% (
P Hotel & gt; 0,05), 45,4% (
P Hotel & lt; 0,05), 43,2% (
P Hotel & lt; 0,05), 65,6% (
P Hotel & lt; 0,01) y 65,3% (
P
& lt; 0,01) a las 6, 24, 48, 72 y 96 h, respectivamente (Figura 9). Además, la inducción de apoptosis después de 48 horas de tratamiento con si-91H o si-NC se midió usando citometría de flujo. Células HCT-116, con la eliminación 91H, obviamente, no se mostrará la apoptosis en comparación con los de control (Figura 10).
A continuación, acceder a los efectos de la supresión 91H en las células HCT-116 de la motilidad, un ensayo de cero herida se realizó para evaluar el efecto de la caída 91H en la motilidad celular. supresión 91H dio como resultado en la atenuación de la motilidad de las células HCT-116. En particular, en comparación con las células infectadas con Si-NC, la recuperación de la herida se retrasó significativamente en células siRNA infectados (Figura 11). Por otra parte, los ensayos de migración y la invasión se utilizaron para acceder aún más este efecto de la caída 91H sobre la migración y la invasividad de las células CRC. Los resultados revelaron que la migración y la invasión se inhibieron significativamente en las células infectadas con si-91H, en comparación con las células infectadas por si-NC (Figura 12). Por otra parte, HCT-116 la migración celular y la invasión se redujeron en 49,4% (P & lt; 0,05) y 43,9% (P & lt; 0,05), respectivamente, después de la supresión 91H (Figura 13). Estos resultados indican que la inhibición 91H podría estar estrechamente correlacionada con la proliferación, la migración y la invasión de líneas celulares de CRC.
El número de células invasoras o migrado para cada grupo experimental se contó como el promedio de 5 cinco campos de visión bajo el microscopio (*
P Hotel & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
Como una estrella molecular novedoso para lncRNA, los estudios que se acumulan tiene. centrado en el impacto de lncRNA en la patogénesis del cáncer, y podría proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología de estos tipos de cáncer [20], [21], [22]. A pesar del progreso sustancial de lncRNAs en la patogénesis del cáncer, funciones biológicas de lncRNAs no están claras en el CCR. Para explorar la biología de lncRNA en el CCR, este estudio se realizó para investigar en primer lugar, las funciones biológicas de 91H en la progresión del CRC y evaluar el efecto de las 91H de las características clínico-patológicos y pronóstico.
En este estudio, los datos revelaron que los niveles de expresión en el tejido 91H CRC fueron significativamente más altos que los de tejido no canceroso correspondiente. El resultado fue identificado in vitro con líneas celulares de CRC y la línea humana normal intestinal de células epiteliales (Figura 7). Por otra parte, la sobreexpresión de 91H se asoció con metástasis a distancia de los factores clinicopatológicos (
P
& lt; 0,05). 91H se detectó que la expresión estable en líneas celulares de cáncer de mama, y se observó que hasta reguladas en pacientes con cáncer de mama primario [14]. Más importante aún, en mioblastos de ratón, 91H estaba decidido a estar implicado en la co-regulación de los genes en el locus H19 /IGF2 contribuir a la carcinogénesis y la progresión del cáncer [16]. Sin embargo, la expresión 91H no se asoció con metástasis a distancia de los factores clinicopatológicos en el carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) [23]. Las conclusiones inconsistentes para vincular expresión 91H con factores clinicopatológicos puede ser debido a los diferentes tipos histopatológicos. Además, el uso de los datos in vitro, hemos demostrado que desmontables 91H inhibe la motilidad celular, la migración y la invasión de las células CRC. Estos resultados indicaron que 91H podría desempeñar un papel potencial en la promoción de la metástasis de CRC.
Además, describimos en primer lugar, la evidencia de que los niveles de expresión de alto 91H en el tejido tumoral estaban relacionados con un mal pronóstico, y 91H relativa niveles de expresión estaban íntimamente interrelacionado con los pobres resultados clínicos de los pacientes, lo que indica la expresión de 91H podría ser servido como una valiosa independiente biomarcador pronóstico independiente sobre las principales características clínico-patológicas, excepto por el estado de la metástasis. De hecho, estudios previos indicaron que lncRNAs también se consideraron como biomarcadores moleculares en cánceres. PVT-1, lo que genera la actividad antiapoptótica en el CCR, fue identificado como un indicador pronóstico novedoso para pacientes con CRC [12], [24]. Mientras tanto, HOTAIR estuvo implicado en la progresión tumoral y fue considerado como un nuevo biomarcador molecular epigenética en pacientes con CECA o CRC [18], [25], [26]. Por lo tanto, consideramos que 91H podría ser una novela indicador pronóstico potencial en pacientes con CCR.
En general, los nomogramas se han desarrollado en la mayoría de tipos de cáncer [27], [28], [29], que crear una representación gráfica simple de un modelo de predicción estadística que genera una probabilidad numérica de un evento clínico [30]. Por otra parte, la capacidad de los nomogramas para producir predicciones individualizadas permite su uso en la identificación y la estratificación de los pacientes para la participación en los ensayos clínicos [30]. En este estudio, basado en 91H expresión relativa en el tumor y los factores clínico-patológicos, un nomograma predictivo se realizó para predecir la probabilidad de que los pacientes postoperatorios morirían de CRC dentro de 3 años, a excepción de morir por otra causa primera. Mientras tanto, nomograma que contiene 91H tenía más exactitud predictiva que sin 91H (c-index: 0,90 frente a 0,85, respectivamente), lo que indica que la expresión 91H en el tumor, obviamente afectó la exactitud de predicción nomograma. Más importante, el nomograma podría ser utilizado por los médicos para identificar a los pacientes mediante el cálculo de la probabilidad de que los pacientes postoperatorios con CCR, y ofrecer el tratamiento adecuado y la estrategia óptima. Por lo tanto, los pacientes con sobreexpresión de 91H deben ser estrechamente monitorizados y recibieron terapias adyuvantes apropiados después de la resección CRC.
La sobreexpresión de 91H estuvo implicado en la progresión del cáncer [14], [23]. Sin embargo, por lo que se desregula 91H en el tumor sigue siendo desconocido. número de copias variación era una forma importante de alteración genómica estructura, lo que contribuye a ciertas enfermedades genéticas y de desarrollo, incluyendo el cáncer de ovario y cáncer de mama [31], [32]. H19 /IGF2 con variaciones del número de copias, que se encuentra en la región 11p15 impresa, se informó en de Beckwith-Wiedemann y síndromes de Silver-Russell [33], [34]. Mientras tanto, el gen 91H, H19 ARN antisentido, también se encuentra en el cromosoma 11p15.5 la [14]. Por lo tanto, se podría especular que la sobreexpresión de 91H en CRC puede estar asociada con CNV. En el presente estudio, la CNV de 91H se observó en dos pacientes con una expresión de alto 91H, y se produjo número de copias supresión de 91H en un paciente con CCR (Figura 2). Aunque el resultado no mostró estadísticamente significativa, proporcionó una nueva estrategia potencial en la investigación de la regulación génica mediada 91H sobre el cáncer. Debido al tamaño limitado de casos incluidos en este estudio, el estudio adicional se necesita en el futuro para ilustrar la relación potencial.
Algunas limitaciones de este estudio deben ser reconocidos. En primer lugar, el número de pacientes con CRC no era grande. Otros estudios deben llevarse a cabo para verificar la asociación entre la expresión 91H y el CRC, y para determinar si la expresión 91H se asoció con NVC en pacientes con CCR. En segundo lugar, los períodos de seguimiento no eran lo suficientemente largo (rango, 2-36 meses), que no pudieron predecir con precisión la supervivencia global de los pacientes con CCR. Se llevaron a cabo más investigaciones para validar este resultado mediante un seguimiento prolongado de la cohorte de pacientes u otra cohorte de pacientes con CCR. Finalmente, todos los ensayos in vitro para las funciones biológicas solamente se llevaron a cabo en una sola línea celular. A pesar de las limitaciones mostraron en este estudio, estos resultados confirman la importancia del papel de las 91H en diversas etapas de la progresión del cáncer promover la metástasis de CCR.
En resumen, la expresión 91H fue significativamente hasta reguladas en muestras de tejido y CRC líneas celulares. La elevada expresión de 91H se asocia con un mal pronóstico y la metástasis a distancia. Por otra parte, 91H CNV explicó sólo un pequeño porcentaje de la sobreexpresión observada. En conjunto, estos resultados indican que 91H jugó un papel vital en el desarrollo y progresión de la CRC. Al comprender el papel exacto de 91H en la patogénesis de la CRC, una novedosa y prometedora estrategia terapéutica podría ser desarrollado para el tratamiento adicional CRC, basado en la baja regulación de estos lncRNAs oncogénicos.
Apoyo a la Información
Figura S1 . .
La relación entre la variación del número de copias y la expresión 91H en los tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes
doi: 10.1371 /journal.pone.0103022.s001 gratis (TIF)
figura S2.
91H expresión relativa se cuantificó en cuatro líneas celulares de CRC y una línea intestinal humana normal de las células epiteliales de QRT-PCR (media ± SEM; **
P Hotel & lt; 0,01)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
HCT-116 células fueron transfectadas con si-si-NC y 91H. Después de 48 h, la expresión 91H se inhibió de manera efectiva mediante qRT-PCR en comparación con si-NC (media ± SEM; **
P Hotel & lt; 0,01)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022. s003 gratis (TIF)
figura S4.
91H promovió la proliferación de las células HCT-116 mediante el ensayo de MTT (media ± SEM;
P Hotel & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s004 gratis ( TIF)
Figura S5.
La apoptosis se investigó mediante análisis de citometría a las 48 h después de la infección con si-si-91H o NC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s005 gratis (TIF)
Figura S6. Francia El ensayo de cero herida se evaluó con la motilidad celular. La caída de 91H inhibe la motilidad celular HCT-116
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s006 gratis (TIF)
Figura S7.
91H promovió la invasión y migración de las células HCT-116 basado en transwell ensayo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s007 gratis (TIF)
Figura S8. Francia El número de células que invadieron o se migran a través de la cámara se evaluó en 5 campos de cada grupo experimental y un promedio. El número de células invasoras o migrado para cada grupo experimental se contó como el promedio de 5 cinco campos de visión bajo el microscopio (*
P Hotel & lt; 0,05)
doi: 10.1371 /journal.pone.. 0103022.s008 gratis (TIF)
Tabla S1.
la información de los pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s009 gratis (DOCX)
Tabla S2.
Los resultados de QRT-PCR para cada muestra
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s010 gratis (XLSX)