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PLOS ONE: regulación de microARN-145 Asociados con metástasis ganglionares en Colorrectal Cancer


Extracto

La metástasis es la causa principal de mortalidad en pacientes con tumores sólidos. La identificación de las moléculas exactas asociadas con el CRC metástasis puede ser crucial para entender el proceso, lo que podría traducirse así para el diagnóstico y tratamiento de la CRC. En este estudio, investigamos la asociación de los patrones de expresión de microARN con la metástasis de los ganglios linfáticos del cáncer colorrectal. Entre estos miRNAs candidatos, la expresión de los genes miARN-145 fue significativamente relacionados con metástasis en los ganglios linfáticos de la CRC. Tanto
in vitro
y
in vivo
estudio demostró que la regulación de miR-145 podría mejorar la capacidad de la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal, mientras que no se observó ningún efecto sobre la proliferación. El mecanismo de esta promoción está asociada con la estabilización de Hsp-27, una proteína que desempeña un papel importante en la promoción de la metástasis. Estos resultados pueden ser cruciales para la comprensión de CRC metástasis y pueden ser traducidos al diagnóstico y tratamiento de la CRC

Visto:. Yuan W, Sui C, Liu Q, W Tang, un H, J Ma (2014) Hasta -Reglamento de microARN-145 Asociados con metástasis ganglionar en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10.1371 /journal.pone.0102017

Editor: Rolf Müller, Universidad Philipps, Alemania |
Recibido: Abril 10, 2013; Aceptado: June 14, 2014; Publicado: 14 Julio 2014

Derechos de Autor © 2014 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (concesión no. 2011CB911004), el proyecto de formación de Beijing por los talentos de ataque (Z131107000513001), Programa Nova Pekín (Z131107000413066) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (concesión no. 7122150). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer colorrectal (CCR) ocupa el tercer tumor más común y la cuarta causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1]. Aunque muchos se han logrado avances en el tratamiento del CCR en las últimas décadas, la tasa de supervivencia global de los pacientes con CCR ha cambiado ligeramente. Mal pronóstico y la tasa de supervivencia se deben principalmente a la metástasis, por tanto, más de un tercio de los pacientes con CRC en última instancia, el desarrollo de enfermedades metastásicas [2]. Por lo tanto, la identificación de las moléculas exactas asociadas con el CRC metástasis puede ser crucial para entender el proceso, lo que podría traducirse así para el diagnóstico y el tratamiento del CCR
.
Los microARN (miRNA) son de 21 a 25 de un solo nucleótido trenzados no codificantes moléculas de ARN, que ejercen sus funciones mediante la unión a las regiones 3 'no traducidas de sus objetivos de mRNA correspondientes [3]. Se ha estimado que un tercio de los genes humanos totales puede ser regulada por miRNAs, lo que indica que miRNAs tienen un papel fundamental en los procesos fisiológicos y patológicos [4] - [5]. Un gran número de hallazgos muestran que los miRNAs están implicados en los cánceres humanos. La expresión inapropiada de miRNAs puede conducir a la expresión aberrante de los productos de genes que pueden contribuir a la adquisición de las características del cáncer. Estas observaciones sugieren la función de miRNAs como supresores de tumores u oncogenes [6] - [8].

Recientemente, la evidencia convincente demostró que una serie de miRNAs juegan papeles cruciales en el documento CRC metástasis. Por ejemplo, Asangani et al. identificado MIR-21 como promotor de la metástasis en el CCR [9]. Liu et al informaron de que miR-499-5p mejorado la invasión celular y la metástasis tumoral en CRC por la orientación foxo4 y PDCD4 [10]. Okamoto K, demostró que la regulación de miR-493 durante la carcinogénesis podría prevenir la metástasis de hígado en el CCR [11]. Sin embargo, la metástasis resultado de una compleja cascada de procesos biológicos y los mecanismos moleculares exactos que subyacen CRC metástasis están lejos de ser completamente entendido.

En este estudio, los perfiles de expresión de genes miARN en la lesión CRC primaria con o sin metástasis en los ganglios linfáticos se analizaron mediante el uso de una micromatriz de miARN y la cadena de transcripción inversa de la polimerasa cuantitativa (QRT-PCR). En este sentido, el miR-145 fue seleccionado como se muestra dramática sobre regulación en el CCR con metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con los que sin metástasis en los ganglios linfáticos. Tanto
in vitro
y
in vivo
estudio demostró que la regulación de miR-145 podría mejorar la capacidad de la migración y la invasión de las células del cáncer colorrectal. Además, se emplearon iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) el etiquetado y 2DLC-ESI-MS /MS (cromatografía líquida tándem MS) para identificar proteínas celulares que fueron directa o indirectamente regulados por miR-145. Estos resultados sugieren que el miR-145 podría desempeñar un papel importante en la metástasis de CCR en la estabilización de HSP-27.

Resultados

1. Diferentes perfiles de expresión de los genes miARN de CRC con o sin metástasis ganglionar

Para investigar la asociación de los patrones de expresión de microARN con la metástasis de los ganglios linfáticos del cáncer colorrectal, cáncer colorrectal ocho tejidos primarios derivados de pacientes con cáncer colorrectal etapa II-III con (n = 4) o sin (n = 4) se recogieron metástasis en los ganglios linfáticos y los perfiles de expresión de genes miARN de ellas se determinaron utilizando Agilent miARN microarrays. Entre la sonda miARN humano único 851, 32 miRNAs fueron identificados expresados ​​diferencialmente en los tejidos de CRC entre el grupo positivo y negativo de la metástasis de los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,05). Veinte uno de ellos se observó un aumento considerable de expresión en el CCR con metástasis en los ganglios linfáticos. Por otra parte, 11 de ellos fueron infraexpresados ​​significativamente en metástasis de ganglios linfáticos positivos tejidos CRC. análisis de agrupamiento no supervisado con estos 32 miRNAs disregulados significativamente (21 miRNAs con sobreexpresión significativa y 11 miRNAs con una importante baja regulación) fue capaz de distinguir los CRC con o sin metástasis a los ganglios linfáticos (fig. 1A).

A. El resultado certificado de análisis de microarrays. La agrupación jerárquica de 32 dysregulated significativamente miRNAs perfiles de expresión en tejidos de cáncer colorrectal primario humanos derivados de pacientes con cáncer colorrectal con (MNV-P, n = 4) o sin (LNM-N, n = 4) de los ganglios linfáticos de metástasis. B.Validation de miRNAs seleccionados prevé que se dysregulated en CRC con o sin metástasis en los ganglios linfáticos mediante qRT-PCR en los mismos tejidos utilizados para el análisis de microarrays. Los datos mostrados en B es representativo de tres experimentos independientes, y se presentan como la expresión pliegue normalizado a U6 ± SD .C (desviación estándar). análisis de QRT-PCR de la expresión relativa de miR-145 en adicional 202 (LNM-N = 99; LNM-P = 103) casos de tejidos de CRC humanos, incluyendo muestra de tumor (T) y búsqueda de muestra de tejido no tumoral (NT) del mismo paciente. Cada muestra se analizó por triplicado y se normalizaron a U6. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01

2. Verificación de la expresión de los genes miARN-PCR en tiempo real análisis

Para validar los datos de microarrays miARN, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para analizar el nivel de expresión de miRNAs 11, que fueron los miRNAs significativamente más desregulado o que no fueron reportados su asociación con metástasis, incluyendo el miR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5p, -145, -376c, -29b, -95 y -1274a. Se examinó la expresión de miRNAs en los mismos tejidos utilizados para el análisis de microarrays. Después de la normalización con el U6 control endógeno, QRT-PCR datos confirmaron que la expresión de 8 miRNAs mostró ser consistente con el resultado de microarrays. Entre ellos, la expresión de los genes miARN-145 muestra la diferencia más significativa entre los tejidos de cáncer de los dos grupos (fig. 1B).

Para confirmar aún más el perfil de expresión de miR-145, análisis de QRT-PCR se realizó en 202 muestras adicionales de CRC (CRC 99 pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos y 103 pacientes con CCR sin metástasis en los ganglios linfáticos) (ver Tabla 1 y Tabla S1). Como se muestra en la Fig. 1C, miR-145 se underexpressed en especímenes de cáncer colorrectal con o sin metástasis en comparación con los tejidos normales adyacentes, respectivamente, que es coherente con los informes anteriores de otros [14]. Sin embargo, la expresión de miR-145 fue significativamente hasta reguladas en el CCR con metástasis en los ganglios linfáticos que sin metástasis en los ganglios linfáticos. Este cambio sugiere que el miR-145 puede desempeñar un papel importante en la CRC metástasis en ganglios linfáticos.

3. La sobreexpresión de miR-145 no tiene ningún efecto sobre la proliferación de las células HCT-8

Para determinar si la expresión de miR-145 afectan a la función biológica de las células de CRC, el modelo sobreexpresada miR-145 fue creado en HCT-8 células por medio de un sistema de lentivirus, que se conoce como células HCT-8-miR-145 en este documento. Los niveles de miR-145 de HCT-8-miR-145 células y células de control falsos (HCT-8-NC) se determinaron mediante QRT-PCR (Fig. 2A). Una regulación significativa de miR-145 en las células HCT-8-miR-145 se observó en comparación con la de las células HCT-8-NC. Para observar el efecto de miR-145 en las células HCT-8, la tasa de crecimiento celular o del ciclo celular se evaluó por CCK-8 o el ensayo FACS, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 2B y 2C, el ciclo de la tasa de proliferación de las células o células HCT-8-miR-145 no cambiaron en comparación con HCT-8-NC. Este resultado sugiere que la sobreexpresión de miR-145 no influyó significativamente en el ciclo de proliferación o celular de las células HCT-8
.
(A) QRT-PCR análisis de miR-145 en células HCT expresión-8 transfectadas con el vector de expresión Lenti-miR-145 o el vector control negativo miARN utilizando un sistema de lentivirus. (B) las tasas de proliferación de HCT-8-miR-145 o HCT-8-NC células detectadas por CCK-8 ensayo. (C) Análisis del ciclo celular de HCT-8-miR-145 o células mediante citometría de flujo-NC HCT-8. Los datos representan la media + SD de tres experimentos independientes.

4. miR-145 promueve la migración y la invasión CRC
in vitro
y
in vivo

Analizamos a continuación si el miR-145 contribuyó a cambiar la movilidad migratoria de las células CRC. En comparación con el grupo de simulacro, la migración celular se incrementó significativamente en HCT-8-miR-145 células en un ensayo de migración celular Transwell (Fig. 3A). Un resultado similar se observó también en un ensayo de invasión de células (Fig. 3B). También se determinó la capacidad de miR-145 para promover la migración en otras líneas celulares de CRC (SW480 y SW620). Como se muestra en la Fig. S1 en File S1, la sobreexpresión de miR-145 aumentó significativamente la capacidad migratoria de las células SW620, mientras que ningún cambio aparente en las células SW480 (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la sobre regulación de miR-145 podría promover la migración celular y la invasión
in vitro
. Debido a que la expresión de miR-145 en células HCT-8 mostraba la expresión más baja en comparación con la de otras células CRC, el resto del trabajo se ha centrado en esta línea celular CRC para ilustrar la validación típica.

(A) migración y la invasión (B) ensayo de HCT-8-miR-145 o HCT-8-NC células. Las imágenes eran representantes de al menos tres experimentos independientes. Número medio del número de células por campo de la migración a partir de al menos tres experimentos independientes ± SD se muestra por la figura columna. **
P Hotel & lt; 0,01. imágenes (C) Foto de mesentérica metástasis en ganglios linfáticos de ratones desnudos que se inyectan en el hígado con células HCT-NC-8 HCT-8-miR-145 o seguido de sutura quirúrgica. Los animales se sacrificaron 2 semanas después de la inoculación de células intra-hepática. (D) La incidencia de metástasis en ganglios linfáticos mesentéricos de ratones (tabla) y el número medio de nódulos metastásicos visibles en el mesenterio (figura columna). **
P
. & Lt; 0,01

Para confirmar aún más esta idea, se estableció un modelo de ratón desnudo trasplante ortotópico de estudiar si la sobreexpresión de miR-145 podría promover la metástasis tumoral
in vivo
. No se encontraron diferencias significativas del peso o volumen de los tumores primarios en el hígado trasplantado tanto por las células HCT-8-miR-145 y las células HCT-8-NC. También se encontró que el 100% de los ratones en el grupo-miR-145 HCT-8 tenía la mesentérica metástasis en los ganglios linfáticos y el número medio de nódulos metastásicos alcanzó 149 ± 15. Sin embargo, no había ninguno de los ratones en el grupo control HCT-8-NC se presentan mesentérica metástasis en los ganglios linfáticos (Fig. 3C, 3D). Tomados en conjunto, estos resultados confirmaron que alto nivel de miR-145 podría promover la migración y la invasión CRC
in vitro
y
in vivo.

5. Análisis de proteínas expresadas diferencialmente

Los resultados anteriores indican que el miR-145 actúa como un miARN prometastatic en el CCR. Para tratar de obtener una mejor comprensión de las proteínas afectadas directa o indirectamente por el miR-145 sobreexpresión, HCT-8-miR-145 y las células HCT-8-NC se lisaron, y se sometió a etiquetado iTRAQ, 2DLC-ESI-MS /MS análisis. Se identificaron un total de 1117 proteínas distintas y cuantificado, los cuales se filtraron posteriormente con los parámetros de exclusión de filtro seleccionados de forma manual. Tomamos un 1,3 veces el cambio de corte para la relación iTRAQ para clasificar las proteínas como la regulación hacia arriba o abajo. Este punto de corte se aplicó debido a que varios estudios iTRAQ anteriores realizados en nuestro laboratorio demostraron que la variación técnica fue consistentemente por debajo del 30%, el criterio de corte también fue aceptada por investigaciones anteriores [12]. Las proteínas fueron considerados arriba o hacia abajo reguladas sólo cuando sus coeficientes de la expresión (HCT-8-miR-145 células vs. 8 HCT-NC células) fueron & gt; 1,3 (1 × 1,3) o & lt; 0,77 (1 × 1,3) y mostró significación estadística.

por lo tanto 13 proteínas fueron descartadas como proteínas expresados ​​diferencialmente, 7 de proteínas significativamente hasta reguladas y 6 proteínas notablemente las reguladas (Tabla S2, S3). Entre 13 proteínas expresadas diferencialmente, la sobre regulación de la proteína de choque térmico 27 ​​(HSP-27) se validó utilizando el Western Blot (Fig. 4A). Por lo tanto, elegimos HSP-27 para una mayor investigación.

(A) Los niveles de expresión de HSP-27 fueron examinados en HCT-8-miR-145 o células HCT-8-NC mediante análisis de Western Blot. (B) La expresión de la proteína Hsp-27 se detectó en CRC y los tejidos normales adyacentes mediante ensayo de transferencia de Western. Las relaciones /actina relativos Hsp27 de las bandas individuales se muestran como la media + SD de valores derivados de todas las muestras de pacientes (tejido no tumoral, n = 47; tejido tumoral LNM-P, n = 41; tejido tumoral LNM-N, n = 43). (C-D) miR-145 mejorado HSP-27 Estabilidad en el CCR Cells.HCT-8-miR-145 o células HCT-8-NC fueron incubadas con el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (CHX, 0,5 g /l) (C) o el inhibidor de proteasoma MG-132 (5 M) (D) durante 24 horas. El nivel del total de HSP-27 se detectó por análisis de Western Blot. Las relaciones /actina relativos Hsp27 de bandas individuales se muestran como la media ± desviación estándar de los valores normalizados a la beta-actina.

A fin de validar la asociación entre la proteína HSP-27 y miR-145 expresión en CRC , analizamos su perfil de expresión en muestras de tejido humanas primarias (incluyendo 41 CRC con MNV, 43 CRC sin LNM, 47 tejido no tumoral adyacente) utilizando el Western Blot o QRT-PCR respectivamente. Entre las 131 muestras de tejido humano, la expresión de HSP-27 fue significativamente hasta reguladas en el CCR con metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con los que sin metástasis en los ganglios linfáticos. Esta tendencia es consistente con el perfil de expresión de miR-145. Hubo una fuerte correlación positiva (Spearman) entre la proteína HSP-27 y miR-145 expresión (
r = 0,402
;
P Hotel & lt; 0,0001). (Figura 4B, la figura S2 y S3 en File S1). Estos resultados indicaron que el miR-145 está implicado, al menos parcialmente, en un máximo de regulación de HSP-27 expresión de la proteína.

6. Mejora de HSP-27 por la estabilidad de miR-145 en células CRC

No hubo ningún cambio detectable de HSP-27 de nivel transcripcional después de miR-145 sobre regulación (datos no mostrados). Sólo proteínas, pero no ARNm de HSP-27 fue modulada por el miR-145, lo que sugiere esta regulación es post-transcripcional. Para explorar más a fondo la proteína de regulación de HSP-27 afectados por el miR-145, que detecta si el miR-145 mejora la estabilidad de la proteína HSP-27. HCT-8-miR-145 células y células HCT-8-NC fueron tratados ya sea con el inhibidor de la síntesis de proteínas, cicloheximida (CHX), o inhibidor del proteasoma, MG-132, respectivamente. Como se ilustra en figura 4c y 4D, la mayor expresión de Hsp-27 en miR-145 células sobreexpresados ​​se suprimió cuando se incubaron con MG132. Tal fenómeno no se encontró cuando se incubaron con CHX. Estos resultados indicaron que el miR-145 no pudo influir en la síntesis de proteínas de HSP-27, pero podría reducir la tasa de HSP-27 de la degradación, lo que mejora su estabilidad.

7. El descenso de regulación de HSP-27 atenuado el efecto oncogénico de miR-145

Para verificar si la sobre regulación de HSP-27 contribuye a la movilidad inducida por el miR-145 en células CRC, una serie de ensayos se llevado a cabo
in vitro
. HSP-27 siRNA o controlar siRNA se transfectadas inicialmente en células HCT-8-miR-145. La reducción de la expresión de la proteína de Hsp-27 se confirmó mediante transferencia de western (Fig. 5A). La migración celular fue entonces observó usando un ensayo de cicatrización de la herida (Fig. 5B). Estos resultados mostraron que la movilidad de HCT-8-miR-145 células transfectadas con Hsp-27 siRNA fue notablemente más lenta que la de las células transfectadas con ARNsi de control. Un resultado similar se obtuvo también en un ensayo de invasión de células. Transwell Matrigel-experimentos de ensayo de penetración se realizaron con células transfectadas con HSP-27 siRNA o el control de siRNA-miR-145 HCT-8. En comparación con el control, tumbar de HSP-27 inhibe la capacidad de invasión de HCT-8-miR-145 células (Fig. 5C). Los otros tres diferentes siRNA oligos de HSP-27 fueron capaces de recapitular fenotipos similares (Fig. S4 en Archivo S1). Estos resultados manifiestan que HSP-27 fue un importante mediador aguas abajo durante el prometastasis relacionada con el miR-145.

(A) HCT-8-mir-145 (miR-145) o HCT-8-NC (NC células) se transfectaron con HSP-27 siRNA (MIR-145 + SI-Hsp27) o un control negativo siRNA (MIR-145 + maqueta). La expresión de la proteína Hsp-27 se detectó mediante el ensayo de transferencia de Western. (B) de curación de heridas de ensayo para evaluar el efecto de Hsp-27 siRNA en células-miR-145 HCT-8. (C) Derribo de HSP-27 de siRNA en las células HCT-8-miR-145 la invasión de células inhibió significativamente. Las imágenes eran representantes de al menos tres experimentos independientes. Número medio de número de células invasión por campo de al menos tres experimentos independientes ± SD se muestra por la figura columna. **
P
. & Lt; 0,01

Discusión

La metástasis es el sello distintivo clave de la malignidad. Aunque hay muchos informes de la expresión de miR-145 en el cáncer, el informe de la función de miR-145 en el desarrollo de metástasis de CCR es raramente pocos. En el estudio actual, se determinó la expresión de miR-145 en el tejido de cáncer primario de pacientes con CRC, con o sin metástasis en los ganglios linfáticos. El miR-145 fue identificado para ser underexpressed en muestras de CRC con o sin metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con los tejidos normales adyacentes, respectivamente, lo cual es consistente con los informes anteriores por otros [14] - [16]. Sin embargo, la expresión de miR-145 mostró una regulación dramática en el CCR con metástasis en los ganglios linfáticos, que estaba fuera de nuestras expectativas. Debido a nuestro conocimiento, la tendencia expresión de genes asociados a tumores por lo general se mueve hacia una dirección a lo largo del desarrollo de tumor. Para confirmar el resultado de nuestra observación preliminar, la expresión precisa de miR-145 en el primario del tejido CRC de 103 pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos y 99 pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos se determinó usando QRT-PCR. Cada muestra se analizó por triplicado y se normalizó contra un control endógeno U6. Los estrictos estándares de calibración y gran cantidad de especímenes tumorales utilizadas en este estudio garantizarse la credibilidad de los resultados. No se encontraron diferencias significativas en la comparación del nivel de expresión de miR-145 en los tejidos normales adyacentes entre CRC con o sin metástasis en los ganglios linfáticos. Sin embargo, se observó una clara asociación entre la expresión de miR-145 y la metástasis linfática. En estas muestras de pacientes de CRC, el miR-145 mostró significativa la expresión más alta en el cáncer con metástasis en los ganglios linfáticos que aquellos sin metástasis en los ganglios linfáticos, lo que confirma aún más nuestro resultado matriz. Además, como se analizaron los datos de varios otros miRNAs, también se observó perfil de expresión similar de disminución, restauración, pero no más baja regulación, junto con el desarrollo de CRC (datos no publicados). Estas observaciones de otros miRNAs relacionados CRC confirmaron la exactitud de los resultados, lo que sugiere que tal vez uno de los genes miARN mostrar diferentes perfiles de expresión en diferentes etapas del cáncer. Además de diferencia etapa, la expresión de miR-145 parece ser dependiente del tipo de tejido. Por ejemplo, Sachdeva et al encontró que la baja regulación de miR-145 fue más prominente en el CCR que en el cáncer de mama [17]. Todas estas observaciones indican que algunos miRNAs pueden ser multitarea mediante la interacción con diferentes genes diana en varias células y tejidos [18].

Para investigar la relación de regulación de miR-145 con metástasis de cáncer colorrectal, se llevaron a cabo estudios de miR-145 con ganancia de función en las células humanas CRC utilizando el sistema de lentivirus. Nuestros resultados mostraron que la sobre regulación de miR-145 podría promover la migración y la invasión CRC
in vitro
y
in vivo, España, mientras que no se observó ningún efecto sobre el crecimiento celular. Estos datos eran incompatibles con algunos otros informes que mostraron función anti-oncogénico de miR-145 en la metástasis. Sin embargo, los datos derivados de estas observaciones eran o bien a partir de tejidos que no sean de colon [17], [19] - [20]. Arndt et al informaron de un papel oncogénico de miR-145 en el CCR, que está en buen acuerdo con nuestros resultados [21]. Estos descubrimientos confirman además que la función de miR-145 en relación con el desarrollo del cáncer es del tipo de tejido específico.

Este estudio proporciona la primera evidencia de que el miR-145 funciona principalmente como un miARN prometastatic en CCR avanzado. Es en general de que solo miARN específicos pueden regular múltiples genes diana, lo que sugiere que solo miARN podría llevar a cabo una variedad de funciones por la orientación diferentes genes en diferentes contextos celulares [22]. En la etapa temprana de CRC, el miR-145 es el regulado, lo que indica su objetivo relacionado con la proliferación celular. En la etapa avanzada, la alta expresión de miR-145 podría estar relacionado con los objetivos contra la metástasis. MIR-17-5p, un miARN bien investigado, podría tener como objetivo los genes pro-y anti-proliferativos y actuar como un oncogén y un supresor de tumores en diferentes tipos de cáncer [13], [23] - [24]. MiR-143, otro cáncer asociado miARN, su expresión es siempre coherente con el miR-145 (que no lo hicimos examen de su co-expresión con miR-145 en nuestro estudio), mostró multifunción en la metástasis del cáncer [25]. Tomados en conjunto, estos hallazgos apoyan la hipótesis de que el miR-145 puede desempeñar una función compleja en el desarrollo de CCR.

Con el fin de revelar posibles genes efectores que participan en esta función, se identificaron las proteínas celulares que estaban directa o indirectamente regulado por el miR-145 mediante el etiquetado y iTRAQ 2DLC-ESI-MS /MS. Nuestro análisis mostró que HSP-27 fue hasta reguladas en el miR-145 sobreexpresa células CRC. Proteína de choque térmico 27 ​​(HSP-27), un miembro importante de la pequeña familia Hsp, se expresa de forma ubicua en diferentes tipos de células y participa en respuestas celulares para una variedad de tensiones tales como choque térmico, estrés hipertónica, el estrés oxidativo [26] - [27]. Se han encontrado niveles elevados de Hsp-27 para ser asociado con la metástasis de varios tipos de tumores, incluyendo CRC, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer hepatocelular, cabeza y cuello escamosas de cáncer de células [28] - [30]. En particular, se ha demostrado que el aumento del nivel de expresión de HSP-27 en el CRC estaba relacionado con la metástasis en los ganglios linfáticos [31] - [32]. Nuestros resultados mostraron que había una correlación fuerte y positiva entre la proteína Hsp-27 y la expresión de miR-145 en muestras de tejidos humanos primarios, lo que indica que el miR-145 estaba involucrado, al menos parcialmente, en un máximo de regulación de Hsp-27 expresión de la proteína .

se encontró Desmontables de HSP-27 de la expresión de genes de siRNA para revertir la inducción mediada por el miR-145 de la migración celular CRC en nuestro estudio. El papel de miR-145 en el mantenimiento de un alto nivel de HSP-27 no fue a través de la orientación directa de genes pero la estabilización de HSP-27. Aunque el papel y el resultado clínico de HSP-27 en tumores primarios ha sido bien estudiado y documentado [33], su función en la invasión de metástasis todavía no está claro. Otras investigaciones para identificar el mecanismo de HSP-27 que participan en la metástasis CRC enriquecerá aún más nuestro entendimiento sobre la sobre regulación de miR-145 en el CCR.

En resumen, este estudio demostró que la regulación de los MIR -145 contribuyeron a la metástasis de los ganglios linfáticos de la CRC. El mecanismo de esta contribución asociada con la estabilización de Hsp-27, una proteína que desempeña un papel importante en la promoción de la metástasis. dirección futura de la evaluación de miR-145 debe centrarse en el estudio de mecanismo que podría conducir a su aplicación en el diagnóstico y el tratamiento de metástasis de CCR.

Materiales y Métodos

Las muestras clínicas

Las muestras de tejidos analizados en este estudio fueron obtenidos de 202 pacientes (117 varones y 85 mujeres) sometidos a resección quirúrgica de CRC en el hospital del cáncer, Academia china de Ciencias médicas, Beijing, china. Las muestras se utilizaron con el consentimiento informado por escrito de los pacientes y con la aprobación de la Academia China de Ciencias Médica Hospital del Cáncer. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la resección quirúrgica. enteros Las muestras reflejan la distribución natural de las características clinicopatológicas de pacientes con CRC. especímenes resecados se examinaron histológicamente por hematoxilina y eosina. tejidos tumorales primarios y los correspondientes tejidos no tumorales adyacentes se recogieron inmediatamente después de la extirpación quirúrgica y se congeló en nitrógeno líquido para su uso posterior. Dividimos esta cohorte de pacientes en dos grupos. Aquellos con MNV confirmados fueron llamados como grupo de ganglios linfáticos positivos (LNP) y los que no MNV detectable fueron llamados el grupo de ganglios linfáticos negativos (LNN). Todos los casos fueron revisados ​​y confirmados por dos patólogos experimentados. Las características clínicas de estos especímenes se muestran en la Tabla 1.

Cultivo de células

La línea celular humana CRC HCT-8 fue comprado por el Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas de cultivo celular ' centro (Pekín, china). Las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, CA), 100 U /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina. Las células fueron incubadas a 37 ° C y complementado con un 5% de CO
2 en una cámara húmeda.

Microarray análisis

Ocho primarias cáncer colorrectal tejidos derivados de pacientes con cáncer colorrectal en estadio II-III con (n = 4) o sin (n = 4) se recogieron metástasis en los ganglios linfáticos y los perfiles de expresión de los genes miARN se determinaron utilizando Agilent miARN microarrays. Brevemente, el ARN total fue extraído de muestras tumorales utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion Inc, TX, EE.UU.). La calidad y cantidad de las muestras de ARN fueron evaluados por un 2100 Bioanalyzer utilizando el kit Pico LabChip RNA 6000 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El microarray contiene sondas para 851 miRNAs humanos a partir de la base de datos de Sanger v.12.0. Los experimentos de microarrays se realizaron a ShanghaiBio Corporación usando el reactivo de Agilent miARN etiquetado y la hibridación Kits, Agilent matriz miARN humana (V2) y el escáner de microarrays de Agilent. Todos los datos de microarrays original está depositado en la base de datos NCBI GEO [GSE48074].

extracción de RNA y en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa

El miARN se purificó a partir de células cultivadas o tejidos que utilizan el Kit de Qiagen miRNeasy Mini. Con transcripción inversa se realizaron utilizando reacciones de transcripción inversa MiScript Kit (Qiagen, Alemania.). Kit MiScript SYBR Green PCR en combinación con miARN-primers específicos (mir-29b-1 * art MS00009289, MIR-95 art MS00010906, MIR-100 art MS00003388, nº de cat mir-125 ter MS00006629, MIR-152 art MS00003591, MIR-376C art MS00004046, nº de cat MIR-199b MS00003731, MIR-145 art MS00003528, miR-99a art MS00003374, MIR-1274a art MS00014420, mir-99b art MS00032165, Qiagen, Alemania.) se utilizaron para detectar miRNAs maduros en LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). La expresión relativa de los genes miARN en comparación con U6 (cat. No. MS00033740, Qiagen, Alemania.) Se calculó utilizando el método -ΔCt. Todas las reacciones de QRT-PCR se realizaron por triplicado.

Generación de lentivirus para lograr la ganancia de miR-145
función
Lentiviral pGCsil-GFP vector se utilizó para la realización humana pre-miR-145 (MIR -145) o el control no funcional (NC). construcción de vector lentiviral y producción de partículas de lentivirus de alto título fueron hechas por la empresa de biología Genechem. Los lentivirus generados fueron utilizados para infectar HCT-8 durante 24-48 horas a 1-5 MOI, y se determinaron mediante ensayos de QRT-PCR los niveles de expresión de miR-145. las poblaciones infectadas que presentan entre las células fluorescentes verdes 70 a 90% se utilizaron para la experimentación posterior.

Ensayo de proliferación

Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 que contenía suero fetal al 10%. 1 × 10
3 Las células se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO2. La viabilidad celular se midió utilizando Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) en el día 1, y Day3 day5. Para el análisis del ciclo celular, las células se lavaron y se fijaron con helado de 75% (v /v) de etanol a -20 ° C durante 2 h, después se tiñeron con PI a una concentración de 50 mg /ml en presencia de RNasa A ( 100 mg /ml). El contenido de ADN se analizó mediante citometría de flujo (Beckman Coulter, EE.UU.)
ensayos
migración celular /invasión

motilidad celular y la invasión se determinaron mediante un tamaño de poro de 24 pocillos Transwell placa (8 M.; Costar), como se describió anteriormente.
10 en resumen, para los ensayos de migración transwell, 1 × 10
se colocaron 4 células en la cámara superior alineado con la membrana no revestido. Para los ensayos de invasión, 3 × 10
4 se colocaron las células en la cámara superior de cada inserción recubiertos con 200 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences, CA, EE.UU.).


In vivo
ensayos de metástasis

en
in vivo
ensayos de metástasis, 5 × 10
4 HCT-8-miR-145 células o células HCT-8-NC se inyectaron en el hígado de ratones desnudos seguido de sutura quirúrgica (tres en cada grupo, nu hembra /nu). Después de 2 semanas, los ratones fueron sacrificados, sus hígados fueron disecados, y se contaron las metástasis en los ganglios linfáticos mesentéricos. Los ratones desnudos fueron adquiridos de Vital Río (Pekín, China) y se criaron en un patógeno específico (SPF) de laboratorio libre de animales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Academia China de Ciencias Médicas y Peking Union Medical College Comité Ético y realizaron de acuerdo con los requisitos legales.

iTRAQ etiquetado y análisis LC-ESI-MS /MS

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