Extracto
La mayoría de los carcinomas de células renales (CCR) se caracterizan por pérdida de la función del gen supresor tumoral de von Hippel Lindau (VHL), que actúa como ubiquitina ligasa para el factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α). En ausencia de VHL, la proteína HIF-1α se estabiliza y contribuye a la tumorigénesis. Los datos recientes demuestran la eficacia antitumoral del promotor BVS en RCC células. Este estudio demuestra que la N-Myc genes aguas abajo regulados 2 (NDRG2) es un regulador potencial de VHL. NDRG2 está implicado en la proliferación y la invasión de células de cáncer, además, con frecuencia es el regulado en el carcinoma de células renales. En este documento se evaluó el efecto de la sobreexpresión NDRG2 sobre la proliferación y la invasión en las células de cáncer renal humano. La línea celular de cáncer de riñón humano 786-O y A498 fueron infectadas con Ad-NDRG2 o Ad-LacZ. La sobreexpresión de NDRG2 no sólo inhibió el crecimiento de las células, sino que también suprime la invasión. Estudios posteriores mostraron que el gen supresor de tumores VHL fueron hasta reguladas, mientras que el factor de transcripción HIF-1a y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se redujeron regulado en células 786-O infectadas por Ad-NDRG2. Por último, en un modelo de ratón desnudo, inyecciones intratumorales de Ad-NDRG2 cada 3 días para un total de siete veces, inhibió el crecimiento y la angiogénesis de tumores 786-S xenotransplantes. En conclusión, estos datos indican que NDRG2 puede estar implicada en la proliferación y la invasión por el impacto de la expresión de VHL y HIF-1α. NDRG2 puede ser una atractiva diana terapéutica para el carcinoma de células renales.
Visto: Gao L, Wu G-J, Liu B, Shen M-z, Pan T-J, Yu C-G, et al. (2013) sobre regulación de pVHL junto con la baja regulación de HIF-1α por la Expresión NDRG2 Atenúa proliferación y la invasión de células de cáncer renal. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10.1371 /journal.pone.0084127
Editor: Georgios Gakis, Universidad Eberhard-Karls, Alemania |
Recibido: July 9, 2013; Aceptado: 12 Noviembre 2013; Publicado: December 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Gao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (Nº 81230043 y Nº 81272812) y Nacional china clave de Investigación básica & amp; Programa de Desarrollo (2009CB521704). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células renales (CCR) es una de las 10 principales enfermedades malignas más comunes en los hombres y las mujeres [1]. RCC comprende un grupo diverso de histológicamente los tumores sólidos, que surgen de distintas partes de la [2] riñón. La gran mayoría de los CRC son carcinomas de células claras renal de células (CCRCCs), caracterizado por pérdida de la función del gen supresor tumoral de von Hippel Lindau (VHL). Los defectos en el gen VHL son la causa más común de CCRCC familiar, y más de 80% de los pacientes con CCRCC esporádica tener un gen VHL inactivo o pérdida de gen VHL [3].
BVS es un guardián clásica inhibir la iniciación del tumor renal [4-6]. La BVS proteína codificada por el gen VHL, es un componente de un complejo de ubiquitina ligasas E3 que incluye Elongin-B, Elongin-C, y cullin-2 [7,8]. Entre los sustratos bien documentados de la pVHL es el factor inducible por hipoxia (HIF-1α), que es un factor de transcripción que controla la expresión de factores de hipoxia inducida tales como la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK) -1, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y así sucesivamente [9,10]. Estos genes diana tienen influencia en el metabolismo energético, la proliferación celular y la metástasis de CCRCC [11]. Bajo normal de oxígeno, HIF-1α une pVHL a través de sus restos de prolina hidroxilados y se polyubiquitinated por pVHL, que en última instancia conduce a la degradación de HIF-1α a través de la proteasoma. Durante la hipoxia, HIF-1α no es hidroxilado y se escapa de la degradación mediada por pVHL. El lábil HIF-1α forma entonces factor de transcripción funcional mediante la asociación con el HIF-1β subunidad constitutivamente expresado [12]. Juntos, este complejo se une a motivos de ADN conocidas como elementos de respuesta a la hipoxia para regular la expresión de un número de genes implicados en la proliferación celular, la metástasis y la angiogénesis. Por lo tanto, mediante la promoción de la degradación de HIF-1α, pVHL puede suprimir HIF-1α estimuló la transcripción y funcionar como un supresor de tumores tecla [13]. pérdida pVHL es un evento común en CCRCC, lo que lleva a la estabilización de HIF-1α y la sobre regulación de sus genes diana. Se ha demostrado que la expresión de VEGF se eleva con frecuencia junto con la regulación positiva HIF-1α en muchos cánceres humanos [14]. Un estudio previo demostró que pVHL es capaz de mejorar la expresión y la actividad de otro supresor tumoral conocido, p53 [14]. Sin embargo, la forma en pVHL sí está regulada rara vez ha sido reportado. Los datos recientes han demostrado la eficacia antitumoral de un promotor pVHL en RCC [15].
N-myc Aguas abajo regulado Gen 2 (NDRG2), es un miembro de la familia NDRG, es un supresor de tumores recién identificado. Se ha informado de que la expresión NDRG2 es downregulated en una variedad de carcinomas, incluyendo cáncer de hígado, cáncer de páncreas, meningioma y cáncer de próstata. Estudios de nuestro laboratorio y otros han demostrado que NDRG2 es la regulación de la proliferación celular implicado, la apoptosis, la diferenciación y la respuesta al estrés [16-21]. Es de destacar que nuestro estudio anterior implicaba que NDRG2 regula positivamente la expresión de p53 y pVHL mientras que regula a la baja la expresión de VEGF y HIF-1α en líneas celulares de cáncer de mama [22]. Recientemente, se ha informado de que NDRG2 es downregulated en los tejidos CCRCC comparación con los tejidos no neoplásicas adyacentes [23]. Además, la expresión forzada de NDRG2 inhibe el crecimiento de células claras (RCC) CCRCC líneas celulares e induce la apoptosis de las células [24]. Estos hallazgos sugieren que NDRG2 juega un papel importante en la carcinogénesis de CCRCC. Sin embargo, la función exacta de NDRG2 en CCRCC no se entiende completamente.
En este estudio, se intentó explorar si existe una relación entre el regulador y NDRG2 pVHL. Primero examinamos la correlación entre la expresión y NDRG2 pVHL en los tejidos tumorales de pacientes CCRCC. A continuación, se realizó un
in vitro e
in vivo
experimentos para investigar el efecto de la sobreexpresión NDRG2 en el comportamiento celular, así como en la expresión de pVHL y sus efectores, HIF-1α y VEGF .
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Las muestras humanas se obtuvieron de todos los pacientes con el consentimiento informado por escrito. Tanto el consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Xijing, Cuarta Universidad Médica Militar. Los ratones usados en este estudio se obtuvieron de la Cuarta Universidad Médica Militar y se mantuvieron a condiciones libres de patógenos. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por la Junta del Hospital Xijing, Cuarta Universidad Médica Militar de Revisión Institucional y se ajustaban a las directrices del NIH sobre el uso ético de los animales.
Colección de tejidos e inmunohistoquímica
Un total de 130 muestras incluidas en parafina fijadas con formalina de carcinoma renal de células claras primaria y sus tejidos adyacentes normales del riñón se recogieron en el Departamento de Anatomía Patológica del hospital Xijing, Xian, china. Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que dieron su consentimiento informado para utilizar el exceso de muestras patológicas con fines de investigación. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. La utilización de tejidos humanos en este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y se llevó a cabo de conformidad con las directrices internacionales para el uso de tejidos humanos. Anti-NDRG2 (dilución 1: 500) anticuerpos fueron adquiridos de BD Corporation (BD, Nueva York, EE.UU.). Anti-HIF-1 (dilución 1: 500) y anti-VEGF: anticuerpos (1 dilución de 1000) eran de Santa Cruz Tecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). anticuerpo anti-BVS (dilución 1: 500) era de Neomarkers Corporation (Taipei, China). Anti-β-actina anticuerpo (dilución 1: 2.000) fue de Sigma (Sigma, EE.UU.). El kit de inmunohistoquímica fue adquirido de la Compañía Boster (Wuhan, CHN).
La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto la intensidad y el alcance de la tinción inmunológica se analizaron semi-cuantitativamente. Secciones con no etiquetado o con células marcadas menos de 5% se puntuaron como 0. Las secciones se puntuaron como un 1 si 5-25% de las células fueron etiquetados, como 2 si el 25-50% de las células se marcaron, y como 3 si se marcaron 50-75% de las células. Por último, el etiquetado de ≥75% de las células se marcó como 4. La intensidad de la tinción se obtuvo de manera similar, con 0 utilizado para la tinción negativa, 1 para débilmente positivo, 2 para moderadamente positiva y 3 para fuertemente positiva. Las calificaciones de el porcentaje de células positivas y para la intensidad de la tinción se multiplicaron para generar una puntuación inmunorreactivas para cada espécimen. El producto de las puntuaciones cantidad e intensidad se calcula de tal manera que un resultado final de 0 indica ninguna expresión, 1-4 indica la debilidad de expresión, 5-8 indicaron una expresión moderada y 9-12 indican una fuerte expresión. Las fotos fueron recolectados a través de microscopía de luz (Olympus, Japón).
Líneas celulares y reactivos
líneas celulares de cáncer de riñón humano 786-O y A498 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, ESTADOS UNIDOS). Las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. Para el tratamiento de la hipoxia, las células fueron cultivadas en condiciones hipóxicas (1% O
2, 5% de CO
2 y el 94% de N
2) y se recogieron a las 24 h después de la infección.
Cell el crecimiento ensayo
se sembraron las células (5 × 10
3 células por pocillo) por triplicado en placas de 96 pocillos. Después de retirar el medio, 40 MOI de adenovirus que expresa NDRG2 [24] o se añadió en RPMI libre de suero 1640 el LacZ negativo gen de control (Ad-LacZ), se incubaron durante 2 h, sustituido con fresco RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Las placas se incubaron a continuación durante 0, 24, 48, y 72 h. Se determinó el número de células viables usando el -2,5-difeniltetrazolio ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) (MTT) y la lectura de la absorbancia a 490 nm. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
migración y la invasión ensayos
La migración celular y la invasión ensayos habían sido hechas esencialmente como se describe anteriormente [15]. ensayo de invasión con un ensayo de membrana y la migración con recubrimiento de Matrigel con una membrana de Matrigel-sin recubrimiento se realizaron utilizando un sistema de cámara de 24 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se trataron con tripsina y se sembraron en la cámara superior a 2,5 × 10
5 células /pocillo en medio libre de suero. Se añadió el vector que porta LacZ o NDRG2, a una multiplicidad de infección (MOI) de 40, inmediatamente después de la siembra celular. Medio suplementado con FBS al 5% (utilizado como un quimioatrayente) se colocó en la parte inferior así. La incubación se llevó a cabo durante 24 horas a 37 ° C en aire humidificado con un 5% CO
2 atmósfera. Las células se dejaron migrar a través de una membrana porosa, Matrigel-revestida o no revestida (BD Biosciences). Después de la incubación, se retiraron las cámaras, y las células invasoras en el lado inferior de la membrana se fijaron con metanol y se tiñeron con Gimsa. El número de células invasoras o la migración de células se determinó contando cinco campos de alta potencia (x400) de cada membrana y se calcula como el número medio de células por campo. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Western Blot análisis
Se sembraron las células (5 × 10
5 células por pocillo) por triplicado en placas de 24 pocillos . Después de retirar el medio, 40 MOI Ad-NDRG2 o Ad-LacZ se añadió en RPMI libre de suero 1640, se incubaron durante 2 h, sustituido con fresco RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Después de cultivar durante 24 h, las células se lavaron con PBS frío, e inmediatamente se lisaron en un tampón de lisis [1% de Triton X-100 150 mmol /L de NaCl, 100 mmol /L de KCl, 20 mmol /L de HEPES, 10 mmol /L EDTA, 1 ortovanadato mmol /L de sodio, 10μg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, y 1 mol /L fluoruro de fenilmetilsulfonilo] en hielo. análisis de transferencia de Western se llevó a cabo de acuerdo con las membranas de nitrocelulosa utilizando protocolos estándar (Bio-Rad). Para la inmunotransferencia, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido por 2 h de incubación con una dilución 1: 2000 de peroxidasa de rábano (HRP) = Conectado anticuerpo secundario. Por último, las proteínas inmunorreactivas se detectaron por el sistema de detección de quimioluminiscencia.
inmunofluorescencia ensayo
p>
ELISA
Se sembraron las células (5 × 10
5 células por pocillo) por triplicado en placas de 24 pocillos. Después de retirar el medio, 40 MOI Ad-NDRG2 o Ad-LacZ se añadió en RPMI libre de suero 1640, se incubaron durante 2 h, sustituido con fresco RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Los medios condicionados de los cultivos de células 24h se analizaron para VEGF mediante el uso de kits de ELISA sándwich comerciales (Endogen, Woburn, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada muestra se ensayó por duplicado. Los datos se expresan en el VEGF (pg /ml).
ensayos de inhibición del crecimiento
in vivo
El Balb /c atímicos (nu /nu) de seis semanas de edad fueron proporcionados por el Centro de Experimentación Animal de la Cuarta Universidad médica Militar (Xi'an, china). Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales en la Cuarta Universidad Médica Militar y se llevaron a cabo de acuerdo con las normas de cuidado de animales establecidos por la universidad (Número de permiso: 10001). Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados y minimizar su sufrimiento. se recogieron las células 786-O y se resuspendieron en PBS estéril. células 786-O (5 × 10
6 células) se inyectaron en 0,2 ml por vía subcutánea en los flancos izquierdos de los 6 semanas de edad ratones desnudos. Cuando el tamaño medio de los tumores alcanzó los 200 mm
3, todos los ratones se dividieron en tres grupos al azar (Ad-NDRG2, Ad-LacZ y Control PBS grupos, n = 10 por grupo). inyecciones intratumorales de adenovirus (1 × 10
9 pfu en 100 ul de PBS) se hicieron cada 3 d para un total de siete veces. Los volúmenes tumorales se calculan en base a mediciones de la pinza de la longitud (a) y la anchura (b) de las lesiones utilizando la siguiente fórmula: V = ab
2/2. A continuación, la curva de crecimiento se deriva de estos datos. Las condiciones de los ratones se monitorizaron cada día, y supervivencias de ratón se registraron durante todo el período experimental. El ratón fue sacrificado por dislocación cervical, cuando apareció la caquexia, que se caracterizó como un estado general de mala salud, acompañado por una pérdida de la masa corporal magra y la masa grasa, debilidad, fatiga, lentitud, disminuyeron drásticamente la ingesta de alimentos, ascitis y anorexia [25]. Todos los sacrificios se realizaron bajo anestesia (130 mg de ketamina /xilazina 8,8 mg /kg de peso corporal). A continuación, las muestras de tumor se eliminaron para preparar secciones de parafina para la tinción histológica. Los niveles de expresión de NDRG2, pVHL, HIF-1α, la proteína VEGF en los tumores inoculados se detectaron usando histología e inmunohistoquímica como se describe anteriormente.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS versión 19.0. Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando un solo sentido el análisis de ANOVA y la prueba exacta de Fisher. Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank test fueron utilizados para el análisis de supervivencia.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Expresión de NDRG2, pVHL y HIF-1α en los tejidos normales y tejidos renales CCRCC
Para determinar si la regulación entre NDRG2 y pVHL existe en CCRCC, en primer lugar, que detectó la expresión de NDRG2 y los de pVHL y HIF-1α en 130 muestras CCRCC y los tejidos normales emparejados. Como se muestra en la Tabla 1 y la Figura 1, la tasa de expresión NDRG2 positivo en muestras de tejido CCRCC fue 30,0% (Figura 1A y 1B), que fue significativamente menor que en el tejido renal normal 60,0% (Figura 1G y 1H) (
P = 4,40
× 10
-9). Y la tasa de expresión pVHL positivo en muestras de tejido CCRCC (Figura 1C y 1D) también fue significativamente menor que en el tejido renal normal (Figura 1I y 1J) (26,9% frente a 66,2%,
P
= 3,02 × 10
-10). Por el contrario, la tasa de expresión positiva HIF-1α en muestras de tejido CCRCC (Figura 1E y 1F) fue significativamente mayor que en el tejido renal normal (Figura 1K y 1L) (55,4% frente a 33,7%,
P
= 0,006). Por otra parte, como se muestra en la Figura 1 M y 1 N, los niveles de expresión de NDRG2 se correlacionaron positivamente con los de pVHL en muestras de tejido CCRCC (
r = 0,749
,
P
= 3,25 × 10
-5), mientras que los niveles de expresión de NDRG2 se correlacionaron negativamente con las de HIF-1α en muestras de tejido CCRCC (
r = -0,331
,
P
= 1.85 × 10
-3).
Grupo Subgrupo
negativo (%)
positivo (%)
χ
2
P
valor
NDRG2 CCRCC tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23.64
P = 4,40
× 10
-9normal tissue52 renal (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21
P = 3,02
× 10
tissue44 renal -10normal (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18
P = 0,006
tissue81 renal normal (62,3) 49 (37,7) Tabla 1. Expresión de NDRG2, pVHL y HIF-1α en los tejidos normales y tejidos renales CCRCC.
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fotomicrografías representativas de tinción inmunohistoquímica para NDRG2, pVHL y HIF-1αin normales tejidos y tejidos CCRCC renal. (A y B) expresión en los tejidos NDRG2 CCRCC (200 aumentos). expresión (C y D) en los tejidos pVHL CCRCC (200 aumentos). (E y F) la expresión de HIF-1α en los tejidos CCRCC (200 aumentos). (G y H) NDRG2 expresión en los túbulos renales normales (200 aumentos). (I y J) pVHL expresión en los túbulos renales normales (200 aumentos). (K y L) HIF-1αexpression en los túbulos renales normales (200 aumentos). (H) Los niveles de expresión de NDRG2 se correlacionan positivamente con los de pVHL. (N) Los niveles de expresión de NDRG2 están correlacionados negativamente con los de HIF-1α. El número de espécimen se muestra como "escala". Disparidades entre grupos se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson y el gráfico se generó por el software SPSS19.0.
sobreexpresión NDRG2 inhibe la proliferación de células de cáncer renal humano
in vitro
para investigar los efectos de NDRG2 sobreexpresión en el crecimiento de células de cáncer renal humano, se utilizó Ad-LacZ o Ad-NDRG2 para infectar las células 786-o y células A498. Después de la infección durante 24 h, la fuerte expresión de la proteína NDRG2 en células 786-O (Figura 2A) y células A498 (Figura 2B) se confirmó por análisis de transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal contra NDRG2. La inhibición de la proliferación celular se midió con el ensayo de infección 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h después de MTT. Como se muestra en la Figura 2C y 2D, Ad-LacZ no tuvo efecto significativo sobre la proliferación celular, ya sea en las líneas celulares en comparación con el grupo control (
P
valor en 24, 36, 48, 60 y 72 h es 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 y 0,60, respectivamente, en células 786-S;
P
valor es 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 y 0,60, respectivamente, en las células A498). Sin embargo, la proliferación celular se inhibió significativamente en células 786-O Ad-NDRG2 infectadas (
P
valor a los 24, 36, 48, 60 y 72 h es 048, 1,54 × 10
-4, 2,01 × 10
-4, 2,15 × 10
-4 y 4,32 × 10
-6, respectivamente, en células 786-O) y células A498 infectadas con Ad-NDRG2 (
P
valor es 0,47, 0,43, 2,20 × 10
-4, 4,08 × 10
-4 y 1,70 × 10
-6, respectivamente, en las células A498), respectivamente, en comparación con el grupo Ad-LacZ.
(A y B) Los niveles de expresión de proteína NDRG2 en Ad-NDRG2-infectaron 786-O y las células A498 infectadas con Ad-NDRG2 se examinaron respectivamente por transferencia de Western. (C y D) El crecimiento de las células 786-O y A498 se inhibió por la sobreexpresión de NDRG2 después de 72 horas de incubación. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía. *** Indica
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con el grupo Ad-LacZ.
sobreexpresión NDRG2 inhibe la invasión y la migración de las células de cáncer renal humano
in vitro
A fin de evaluar el efecto de la sobreexpresión NDRG2 sobre la actividad metastásica, se realizó
in vitro
Matrigel recubierto de ensayos de invasión Transwell, así como los ensayos de migración con dos líneas diferentes de células renales humanos cáncer, 786-O y A498. Micrografías representativas fueron tomadas de la superficie inferior del filtro transwell, y las células que invadieron o migraron fueron teñidas con Gimsa. Como se muestra en la Figura 3A y 3B, el potencial invasivo, que se determina por la capacidad de las células para invadir una barrera Matrigel, se suprimió significativamente por la infección por Ad-NDRG2 en células 786-O (
P
= 1,46 × 10
-5
vs
grupo Ad-LacZ) y A498 células (
P
= 2.23 × 10
-5
vs
Ad- grupo LacZ) . Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre el grupo Ad- LacZ y el grupo control tanto en células 786-O (
P
= 0,79) y células A498 (
P
= 0,58). Además, la sobreexpresión de NDRG2 en estas líneas celulares suprimió significativamente su migración a través de la transwell cuando se compara con la infección por Ad-LacZ (
P
= 1,19 × 10
-5 para las células 786-O y
P
= 1,09 × 10
-3 para las células A498, respectivamente) (Figura 3C y 3D). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre Ad-lacZ y grupos de control en ambas líneas celulares (
P = 0,73
de células 786-S y
P = 0,94 para
células A498)
(A y B) La capacidad de invasión se estima a través Transwell recubierta con Matrigel. La cantidad de células invadidas se calculó en cinco campos de alta potencia al azar (400 aumentos). El histograma representa la cuantificación de células que invadieron. (C y D) La capacidad de migración se estimó mediante Transwell no recubierto con Matrigel. La cantidad de células migradas se calculó en cinco campos de alta potencia al azar (400 aumentos). El histograma representa la cuantificación de células que migraron. Los datos son la media ± desviación estándar (SD) para tres experimentos independientes. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía. ** O *** indica
P Hotel & lt; 0,01 o
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente, en comparación con el grupo Ad-LacZ.
Regulación de la expresión de pVHL, HIF-1α y VEGF por la sobre regulación de NDRG2 en células 786-O
Para entender el mecanismo molecular mediante el cual NDRG2 inhibe la proliferación de células 786-O y la invasión, se analizó el efecto de NDRG2 en la expresión de pVHL, HIF-1α y su VEGF objetivo, que juegan un papel importante en la proliferación celular y la invasión en el cáncer renal . Estamos infectados las células 786-S con Ad-NDGR2 y examinamos pVHL, HIF-1α y la expresión de VEGF por Western blot. Como resultado, hemos divulgado el aumento de la expresión pVHL y redujimos HIF-1α y VEGF en comparación con la del grupo de control y grupo de células 786-O Ad-LacZ (Figura 4A). Mientras tanto, se utilizó el ensayo de inmunofluorescencia para afirmar una mayor regulación de la expresión de pVHL, HIF-1α y VEGF por la sobreexpresión de NDRG2. etiquetado inmunofluorescencia indirecta mostró señales débiles de NDRG2 y pVHL en el grupo control y el grupo de células Ad-LacZ 786-S, mientras que no hubo más fuerte tinción de NDRG2 y pVHL en células 786-O-infectadas con Ad NDRG2. Por otra parte, las señales de HIF-1α y VEGF en el control y el grupo Ad-lacZ fueron más fuertes que los del grupo Ad-NDRG2 (Figura 4B).
células
(A) 786-O, Ad-lacZ-786-S y Ad-NDRG2-786-O se incubaron bajo normoxia e hipoxia durante 24 h. Después de la incubación, las células se analizaron mediante el ensayo de transferencia de Western. los niveles de beta-actina de proteínas se utilizaron como control de carga. (B) Después de la infección de células 786-O con 40 MOI Ad-NDRG2 bajo normoxia durante 24 h, los niveles de proteína de NDRG2, pVHL, HIF-1α y VEGF en las células se midió utilizando el ensayo de inmunofluorescencia (400 aumentos).
producción de VEGF es inhibida por la sobreexpresión NDRG2
para probar si la expresión NDRG2 afecta a la producción de VEGF en las células de cáncer renal, se utilizó Ad-NDRG2 para infectar células 786-S y A498 y se midió la los niveles de VEGF en medio de cultivo celular en condiciones de normoxia o hipoxia. Los resultados del ensayo ELISA mostraron que el grupo Ad-NDRG2 de células 786-S, en comparación con Ad-LacZ exhibió significativamente disminución de la secreción de VEGF bajo cualquiera de normoxia (Figura 5A) (
P
= 7.32 × 10
-8) o condiciones de hipoxia (Figura 5B) (
P
= 9.95 × 10
-8). Mientras tanto, la secreción de VEGF de las células A498 también se redujo significativamente en condiciones sobreexpresión NDRG2 independientemente de normoxia (Figura 5C) (
P
= 6.12 × 10
-7) y la hipoxia (Figura 5D) (
P
= 0,005). Pero la infección con Ad-LacZ no tiene ningún efecto sobre la producción de VEGF en comparación con el grupo de control ya sea en normoxia (
P
= 0,55 para 786 O células;
P
= 0,91 para las células A498) o en hipoxia (
P = 0,94 para
786 O células;
P = 0,90 para
células A498)
(a y B) 786-O, Ad-lacZ-786-S. y las células Ad-NDRG2-786-O se incubaron bajo normoxia e hipoxia durante 24 h. Después de la incubación, se analizaron los medios de comunicación para los niveles de VEGF por un ensayo ELISA. (C y D) A498, las células A498 Ad-LacZ- A498 y Ad-NDRG2- se incubaron bajo normoxia e hipoxia durante 24 h. Después de la incubación, se analizaron los medios de comunicación para los niveles de VEGF por un ensayo ELISA. Los datos fueron la media ± desviación estándar (SD) para tres experimentos independientes. La significación estadística se evaluó con ANOVA de una vía. ** O *** indica
P Hotel & lt; 0,01 o
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente, en comparación con el grupo Ad-LacZ.
La supresión del crecimiento tumoral en un modelo de ratón desnudo mediante inyección intratumoral de Ad-NDRG2
Para investigar los efectos de anuncio -NDRG2 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, se inyectó el adenovirus (1 x 10
9 pfu en 100 ul de PBS) Ad-NDRG2, Ad-LacZ o PBS cada 3 días en preestablecida humana 786- O los tumores de cáncer renal (aproximadamente 200 mm
3) desarrollado en ratones desnudos. Como se muestra en la Figura 6A, el grupo Ad-NDRG2 logra una inhibición sostenida y significativa del crecimiento tumoral en comparación con el grupo Ad-lacZ (
P
valor es 0,002, 1,54 × 10
-6, 1,77 × 10
-6, 9,7 × 10
-11, 8,69 × 10
-12 y 1,35 × 10
-9 en el Día 6, 9, 12, 15, 18 y 21, respectivamente, del día). El análisis de supervivencia de Kaplan-Merier mostró que la inyección intratumoral de Ad-NDRG2 prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de ratones (
χ
2 = 11.75,
P
= 0,003) (Figura 6B). No se observaron diferencias significativas entre el grupo control y el grupo Ad-lacZ (
χ
2 = 4,67,
P = 0,122
), y los resultados fueron consistentes con los de la
in vitro
ensayos. Después se sacrificaron los ratones, los tumores se extrajeron para el análisis de la expresión de NDRG2, pVHL, HIF-1α y VEGF. Immunolabeling para VEGF y HIF-1a fueron menores en los tumores extirpados de los ratones del grupo Ad-NDRG2. Por otra parte, los NDRG2 y pVHL niveles de expresión en el grupo Ad-NDRG2 se incrementaron drásticamente, mientras que los niveles de HIF-1 y VEGF disminuyeron en comparación con el grupo Ad-lacZ (NDRG2,
P
= 6.47 × 10
-8 ; pVHL,
P
= 1,55 × 10
-8; HIF-1α,
P = 0,0001
; VEGF,
P
= 6.07 × 10
-7). No hubo diferencia significativa entre los grupos de control y Ad-LacZ (NDRG2,
P
= 0,98; pVHL,
P
= 0,94; HIF-1α,
P =
0,78; VEGF,
P
= 0,69) (Figura 7A y 7B).
(A) Curva de crecimiento del tumor. El crecimiento del tumor se evaluó cada 3 días hasta el día 21 del tratamiento mediante la medición de dos diámetros perpendiculares y calcular el volumen en mm
3. El análisis estadístico se evaluó con ANOVA de una vía. ** O *** indica P & lt; 0,01 o P & lt; 0,001 en comparación con el grupo Ad-LacZ. curva (B) de Kaplan-Meier se muestra en el control, Ad-lacZ y grupos Ad-NDRG2, con cada grupo que consta de diez ratones. Hubo una diferencia significativa entre Ad-NDRG2 y tratamientos de Ad-lacZ. La significación estadística se evaluó mediante pruebas de log-rank. ** Indica
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el grupo Ad-LacZ.
(A) las expresiones intratumoral de NDRG2, pVHL, HIF-1a y VEGF fueron evaluados por inmunohistoquímica (200 aumentos) de embebido en parafina 786-O secciones de tumor celular. se muestran imágenes representativas. Se evaluaron los valores de densidad óptica (B) integrada (IOD) de NDRG2, pVHL, HIF-1α y expresión de la proteína VEGF de los tumores. software ImagePro Plus se utilizó para analizar los valores IOD de las áreas positivas de tinción inmunohistoquímica, y se muestran los histogramas resultantes. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar. *** P & lt; 0.001.
Discusión
A pesar de la resección quirúrgica y la terapia adyuvante se usan comúnmente para tratar a los pacientes con cáncer renal, la tasa global de supervivencia para el cáncer renal requiere mejora. Se sabe que RCC es resistente a la radio-, hormono-, y la quimioterapia [26]. Por lo tanto, se necesita con urgencia el desarrollo de terapias biológicas para el cáncer renal. La aparición y el desarrollo de cáncer renal depende de la expresión de varios genes relacionados, tales como HIF-1α, PDK1, VEGF y así sucesivamente [27].
Múltiples estudios han demostrado ahora que HIF-1α hasta regula la expresión de PDK1 y VEGF [28]. Por otra parte, PDK1 y la expresión del VEGF se incrementan en RCC [29,30]. PDK1 es conocida para fosforilar y activar algunas proteínas quinasas que pertenecen a la familia de AGC de proteína quinasas. Una de las quinasas de proteínas es la proteína quinasa B (PKB, también conocido como Akt). PDK1 activa Akt por fosforilación de un residuo de Ser /Thr en el bucle de activación. Akt se activa de forma aberrante en CCRCC y participa en la proliferación y la metástasis [31]. Y VEGF es el pilar en medio de todos los factores angiogénicos y promueve tanto la tumorigénesis y la invasión de RCC [32]. HIF-1α también se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer renal, que se correlaciona con mal pronóstico clínico [33]. Dado que la expresión elevada HIF-1α hasta regula la expresión de PDK1 y VEGF, que promueve la progresión tumoral.