Extracto
El efecto de la quimioterapia del cáncer gástrico (CG) sigue siendo muy pobre debido a la resistencia a múltiples fármacos (MDR). Sin embargo, los mecanismos subyacentes MDR de GC está lejos de ser completamente entendido. El objetivo de este estudio es ilustrar los mecanismos potenciales de la MDR de GC en todo el nivel a largo ARN no codificante (lncRNA). En este estudio, la línea celular GC, sublíneas SGC7901, y dos resistentes a múltiples fármacos, SGC7901 /VCR y SGC7901 /ADR fueron sometidos a un análisis de microarrays lncRNA. Se llevaron a cabo experimentos de la bioinformática y la verificación para investigar los lncRNAs potenciales involucrados en el desarrollo de la MDR. Pathway análisis indicó que 15 correspondían a vías transcripciones regulados hacia abajo y que 20 correspondían a vías hasta reguladas transcripciones (p-valor de corte es de 0,05). GO análisis mostró que el SMO más alto enriquecidos dirigidos por transcripciones fueron hasta reguladas "el desarrollo del sistema" y los más altos Gos esenriched objeto de las transcripciones fueron reguladas por "proceso de biosíntesis de esteroles". Nuestro estudio es el primero en interrogar a lncRNAs expresados diferencialmente en la línea celular humana y GC MDR sublíneas e indica que lncRNAs valen la pena para un estudio más a ser los nuevos biomarcadores candidatos para el diagnóstico clínico de MDR y potenciales objetivos para su posterior tratamiento.
Visto: Wang Y, Wu K, Z Yang, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) resistencia a múltiples fármacos a largo relacionada ARN no codificador perfil de expresión Análisis de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10.1371 /journal.pone.0135461
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: December 24, 2014; Aceptado: July 22, 2015; Publicado: 20 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Toda la materia prima los datos normalizados de datos y se muestran en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por National programa clave de proyecto de Investigación básica (programa de "973", Nº 2010CB529302, Nº 2010CB529305, Nº 2010CB529306); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.301.763); Henan proyectos provinciales claves científicas y tecnológicas (No. 142102310473); Key Program, Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81030044)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La multirresistencia ( MDR) sigue siendo un obstáculo importante para el fracaso de la quimioterapia en el tratamiento del cáncer gástrico, que es una causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos múltiples (PLM) [1] o miRNAs [2] que median MDR a través de diferentes mecanismos se han identificado previamente. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de la MDR GC está lejos de ser totalmente clara.
genomas secuenciación indicó que los genomas eucariotas codificar un número sorprendentemente grande de las transcripciones no codificantes en comparación con los genomas procariotas. Entre estas transcripciones no codificantes, muchos son los ARN no codificantes largos (lncRNAs) que juegan papeles importantes en la regulación de la transcripción del ARNm o la traducción a niveles transcripcionales o post-transcripcional. lncRNAs son ARNs que carecen de potencial de codificación, que son & gt; 200 pb y representan al menos el 80% de las transcripciones de todo el genoma [3]. Los datos acumulados indican que lncRNA juega un papel importante en la regulación del ARNm [4], la biogénesis de orgánulos [5], el tráfico subcelular de las moléculas [6], y el desarrollo de las células [7] [8].
lncRNA desregulación estuvo involucrado en varios tipos de enfermedades, incluyendo el cáncer
[
4
,
9
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10
]. A saber, lncRNAs puede jugar un papel importante en la carcinogénesis, metástasis y la invasión de múltiples tumores malignos a través de afectar la expresión del oncogén. Por ejemplo, la COX-2-lncRNA, PACER, puede actuar como un nuevo objetivo potencial para la COX-2-modulación en la inflamación y el cáncer [11]; RNAi mediada por derribo de LINC01081 en fibroblastos de pulmón fetal normales demostró que este lncRNA regula positivamente la transcripción nivel FOXF1, indicando además que disminución de la expresión LINC01081 puede contribuir al desarrollo de la displasia capilar alveolar con la desalineación de las venas pulmonares [12]; lncRNA HOTAIR también puede ser un predictor valiosa para la gestión del cáncer de colon [13] y MALAT1 que podría considerarse como un indicador de pronóstico potencial y puede ser una diana para el diagnóstico y la terapia génica para el adenocarcinoma del conducto pancreático [14]; la sobreexpresión de lncRNA H19 aumenta la carcinogénesis y la metástasis de cáncer gástrico y el efecto de H19 en GC está mediado por la regulación al alza directa de ISM1 y la supresión de la expresión indirecta CALN1 través de miR-675 [15]. Por lo tanto, para obtener una visión preliminar de los mecanismos moleculares de la MDR de GC, se estudió el perfil de expresión de lncRNA sublíneas GC MDR.
A continuación, se estudiaron los perfiles de expresión de lncRNAs diferencialmente y mRNAs entre SGC7901 GC cellline y MDR sublíneas SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR utilizando el análisis de microarrays lncRNA. La comparación de los transcritos expresados diferencialmente entre las sublíneas y cellline padres reveló 15 vías que se correspondían con las transcripciones reguladas por las vías y 20 que corresponden a las transcripciones hasta reguladas (p-valor de corte fue de 0,05). la ontología de genes (GO) el análisis mostró que el GO términos más altamente enriquecido para los transcritos regulados hasta eran "el desarrollo del sistema", "nucleosoma", y "vinculantes" y el GO términos más altamente enriquecido para las transcripciones reguladas por eran "esterol proceso biosintético "," periferia de la célula ", y" actividad deshidrogenasa de esteroides ". Nuestros resultados muestran que los perfiles de expresión de ARNm y lncRNA diferían significativamente entre sublíneas resistentes a múltiples fármacos y CELLINE parental. Este hallazgo sugiere que los niveles de expresión de aberrantes lncRNAs podrían contribuir al desarrollo de la MDR de GC. Continuando el estudio de las diferencias en los perfiles de expresión lncRNA puede proporcionar nuevos métodos potenciales para revertir la MDR fenotipo de GC.
Resultados
diferencialmente expresado lncRNAs
Los datos de microarrays highthroghput lncRNA mostró una total de 27,883 lncRNAs expresadas en cellline cáncer gástrico, SGC7901 y dos sublíneas de resistencia a múltiples fármacos, SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR (S1 Tabla). Para inferir las relaciones entre las muestras, se utilizó el análisis de agrupamiento jerárquico para organizar celllines en grupos según sus niveles de expresión, indicando las relaciones de los modos de expresión lncRNA entre celllines (Figura 1A y 1B). El estudio adicional de estos datos mostró un promedio de 1,637 expresa de forma diferente lncRNA. Entre ellos, 638 eran consistentemente hasta regulada y 999 fueron consistentemente las reguladas (change≥2.0 veces) (Tabla S2). ASHG19A3A028863 (doble cambio: 146,0139) fue el más (modificar doblar: 58.7105) hasta reguladas lncRNA, y ASHG19A3A007184 fue el lncRNA más abajo reguladas. Por otra parte, lncRNAs reguladas por eran más comunes que lncRNAs hasta reguladas en nuestros datos de microarrays (Tabla S2).
A. El diagrama de dispersión de perfil de expresión lncRNA. mapa B. El calor y el dendrograma de agrupamiento jerárquico de los chips lncRNA.
ARNm expresados diferencialmente
Había 19.644 ARNm identificadas en las sublíneas GC MDR analizados por la expresión de ARNm de perfiles de datos mediante el análisis de microarrays y el análisis de agrupación jerárquica presenta las relaciones entre los modos de expresión de ARNm que estaban presentes en las sublíneas GC MDR y su CELLINE parental (figura 2A y 2B) (Tabla S3). Entre los ARNm expresados diferencialmente entre SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR y SGC7901, 730 era consistentemente hasta regulada y 650 fue consistentemente baja regulado en SGC7901 /ADR y celllines SGC7901 /VCR en comparación con SGC7901 (figura 2B). (Tabla S4). NM_000735 (símbolo de genes: CGA, factor de cambio: 106.19) fue el más regulado hasta el ARNm, y NM_001136574 (símbolo de genes: LANCL1, doble cambio: 25.43) fue la más baja regulado ARNm (figura 2B)
A. Mapa de calor y dendrograma de agrupamiento jerárquico de los chips de mRNA. B. Formas muestra los Top 10 mRNAs expresados diferencialmente.
GO análisis
Para determinar el gen y los atributos del producto génico en los procesos biológicos, componentes celulares y moleculares funciones, ontología de genes (GO) análisis se realizó por la presente. La prueba exacta de Fisher se hace para probar si hay más coincidencia entre la lista y la lista DE GO anotación de lo que cabría esperar por azar. El valor p indica la importancia de GO términos de enriquecimiento en los genes DE. Cuanto menor sea el valor p, más significativo es el plazo GO (valor de p & lt; = 0,05 se recomienda). Se demostró que el SMO más alto enriquecidos dirigidos por transcripciones fueron hasta reguladas homeostasis tisular (GO: 0048731; ontología: proceso biológico; p = 6.84E-08) (figura 3A), nucleosoma (GO: 0000786; ontología: componente celular; p = 2.10E-07) (figura 3B) y vinculante (GO: 0005488; ontología: la función molecular; p = 0,001) (figura 3C) y que el SMO más alto enriquecidos objeto de las transcripciones fueron reguladas por los procesos de biosíntesis de esteroles (GO: 0016126; ontología: proceso biológico; p = 0,000) (figura 3D), periferia de la célula (GO: 0071944; ontología: componente celular; p = 3.80E-06) (figura 3E) la actividad esteroide deshidrogenasa (GO: 0016229; ontología: molecular función;. p = 0,001) (figura 3F) (Tabla S5)
El gráfico muestra los diez principales cargos de los términos de enriquecimiento significativos. La ontología abarca tres dominios: proceso biológico, componente celular y la función molecular. La prueba exacta de Fisher se utilizó para encontrar si hay más coincidencia entre la lista y la lista DE GO anotación de lo que cabría esperar por azar. El valor p indica la importancia de GO términos de enriquecimiento en los genes DE. Cuanto menor sea el valor p, más significativo es el plazo GO (valor de p & lt; = se recomienda 0,05) (AC) El Gos más alto enriquecidos dirigidos por transcripciones hasta reguladas: A, Proceso biológico (BP), B, componente celular ( CC), C, la función molecular (MF). (DF) El Gos más alto enriquecidos dirigidos por transcripciones reguladas por: A, Proceso biológico (BP), B, componente celular (CC), C, la función molecular (MF) guía empresas
Pathway análisis
En este estudio, la vía de análisis mostró que 20 correspondían vías consistentemente hasta reguladas transcripciones y que la red más enriquecido era "Alcoholismo-Homo sapiens (humanos)" (Fisher P-valor = 3.66E-08), integrado de 24 genes específicos (Fig 4A); Por otra parte, la vía de análisis también mostró que 15 vías correspondían constantemente a las transcripciones reguladas hacia abajo y que la red más enriquecido era "sapiens biosíntesis-Homo de esteroides (humanos)" (valor de Fisher-P = 0,00044) compuesto de 5 genes diana (figura 4B ) (Tabla S6, al recomendar p-valor de corte es de 0,05). Entre estas vías, se ha informado de la categoría de genes interrupción "ritmo circadiano" estar asociado con varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico [16], la leucemia mieloide crónica [17], de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [18], el carcinoma hepatocelular [19 ], endometrial carcinoma [20], y el cáncer de mama [21]. La categoría de genes "NOD-como vía de señalización del receptor", que consiste en NOD1, se ha demostrado que NOD1 /Card4 y NOD2 /CARD15 polimorfismos de genes pueden estar asociados con el riesgo de alteración de la gástrico [22], de colon [23], pulmón [24 ], de laringe [25], la vesícula biliar [26], de páncreas [27], intestino delgado, riñón [28], cáncer de vejiga urinaria [29], cáncer de piel, linfoma [30] y la leucemia [31]. Aquí, hemos examinado aún más la expresión y función de ARNT (aril hidrocarburos del receptor nuclear translocator) mediada por MDR1 (resistencia a múltiples fármacos 1) y la vía de la regulación. Se encontró que ARNT y MDR1 fueron significativamente hasta reguladas en SGC7901 /ADR y las líneas celulares /VCR SGC7901 comparación con SGC7901, el efecto de importantes sobre regulación de MDR1 mediada por ARNT vector de expresión de la transfección se vio comprometida a través de Sp1 siRNAs transfección. ensayo de formación de placa colonia mostró que las tasas de formación de colonias de células SGC7901 /ADR fueron remarably mayor en pARNT + /siSp1- grupo en comparación con pARNT animales + /+ siSp1 con el suplemento adriamicina (ADR) en la cultura Meida (p & lt; 0,0001) (figura 5).
(A) Vía: Alcoholismo-Homo sapiens (humanos). (B) Vía: sapiens esteroides biosíntesis-Homo (humana) .El diagrama de barras muestra la puntuación de diez top Enriquecimiento (-log10 (valor de p)) Valor de la vía de enriquecimiento significativo. Amarillo marcada nodos están asociados con reguladas por los genes, de color naranja, los nodos están asociados con hasta reguladas o sólo los genes de conjuntos de datos completos, los nodos verdes no tienen ningún significado.
Expresión
(A) de ARNT, y MDR1 SP1, una, el Western Blot, b, QRT-PCR. (B) El efecto de la transfección siARNT en la expresión de ARNT, MDR1 y Sp1, a, Western Blot, b, QRT-PCR de SGC7901 /ADR, c, QRT-PCR de SGC7901 /VCR. (C) El efecto de pARNT (vector de expresión ARNT) y transfección siSp1 en la expresión de ARNT, MDR1 y Sp1, a, Western Blot, b, QRT-PCR de SGC7901 /ADR. ensayo de formación (D) Placa de colonias de células SGC7901 /ADR con el suplemento de adriamicina en el medio de cultivo (1μg /ml) a la hora designada. (Los datos fueron medios de tres experimentos separados (media ± SEM), de una vía de análisis de ANOVA, *** p & lt; 0,0001) guía empresas
validación en tiempo real PCR cuantitativa
A. examinar los datos de microarrays, seis lncRNAs hasta reguladas y diez lncRNAs insuficientemente regulados fueron seleccionados al azar de los lncRNAs constantemente expresados diferencialmente utilizando SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR y SGC7901 cellines y la QRT-PCR resultados y los datos de microarrays son coherentes (figura 6A ); estudiar más a fondo los niveles de expresión de los estos lncRNAs en los tejidos gástricos resistentes a los medicamentos, veinte muestras gástricas resistentes a los medicamentos y emparejados tejidos no resistentes a múltiples fármacos se examinaron para determinar el nivel de expresión de estos lncRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) (Fig 6B) .Los resultados demostraron que las muestras de cáncer gástrico tratados con ADR durante 5 días exhibidos diferencia significativa de los niveles de expresión de estos dieciséis lncRNAs afformentioned compararon con los grupos de control (figura 6C). Además, el análisis de correlación mostró que los niveles de expresión lncRNA NR_015379 se correlacionaron negativamente con las tasas de inhibición de estos veinte muestras gástricas resistentes a los fármacos (Fig 6D y 6E, p & lt; 0,01).
(A) Dieciséis lncRNAs niveles de expresión en SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR celllines compararon con CELLINE SGC7901. (B) Representación esquemática de las muestras de cáncer gástrico tratados con HDRA seguido por QRT-PCR y ensayo de tasa de inhibición. (C) Dieciséis lncRNAs niveles de expresión en veinte muestras de cáncer gástrico tratados con ADR en comparación con los grupos control. (DE) lncRNA NR_015379 niveles de expresión eran una correlación negativa con las tasas de inhibición de las muestras de cáncer gástrico tratados con ADR.
Discusión
Nuestra investigación previa ya ha encontrado que el miR-21 puede promover la resistencia a los fármacos de diversos tipos de cáncer [32 ]; LncRNA-MRUL promueve la expresión de ABCB1 en sublíneas celulares de cáncer gástrico resistentes a múltiples fármacos [33]; cutl1 actividad se asocia inversamente con la resistencia a los medicamentos y por lo tanto es una atractiva diana terapéutica para modular la resistencia a múltiples fármacos en cáncer gástrico [34]; Los CCC gástricas fueron identificados a partir de la línea celular SGC7901 VCR-acondicionada previamente, caracterizado por una alta tumorigenicidad y la capacidad de auto-renovación y diferenciación [35]; MAD2 podría desempeñar un papel importante en el desarrollo de cáncer gástrico humano y que el silenciamiento del gen MAD2 puede ayudar a hacer frente a la resistencia a múltiples fármacos de las células de cáncer gástrico [36] y la expresión MGR1-Ag /37LRP hipoxia-suscitó activados por HIF-1 depende sobre la activación de ERK. Estos eventos son dependientes de intermediarios reactivos del oxígeno [37] .Sin embargo, los mecanismos de resistencia a múltiples fármacos de GC son mucho más dilucidado y lncRNAs desregulación de GC sublíneas resistentes a múltiples fármacos no se han estudiado todavía.
En este estudio, la línea celular GC , sublíneas SGC7901, y dos MDR, SGC7901 /VCR y SGC7901 /ADR se sometieron a un análisis lncRNA microarray. Se llevaron a cabo experimentos de la bioinformática y la verificación para investigar los lncRNAs potenciales involucrados en el desarrollo de la MDR. Pathway análisis indicó que 15 correspondían a vías transcripciones regulados hacia abajo y que 20 correspondían a vías hasta reguladas transcripciones (p-valor de corte es de 0,05). GO análisis mostró que el SMO más alto enriquecidos dirigidos por transcripciones fueron hasta reguladas "el desarrollo del sistema" y los más altos Gos esenriched objeto de las transcripciones fueron reguladas por "proceso de biosíntesis de esteroles".
aumento de la evidencia mostró que lncRNA ( ARN largo no codificante) podría desempeñar un papel importante en la carcinogénesis y la invasión tumoral y la metástasis [38]. Por ejemplo, John [39], etc. demostró que lncRNA
PCGEM1
se asocia con el cáncer de próstata; se encontró factor de crecimiento transformante-β-inducida lncRNA-Smad7 para inhibir la apoptosis de células de cáncer de mama de ratón JygMC (A) y por lo tanto sugieren ed un complejo mecanismo de regulación de los aspectos anti-apoptótica y tumor-progresivas de TGF-β de señalización [40] ; lncRNA, próstata asociada a cáncer transcripción 29 (PCAT29), se caracterizó junto con su relación con el receptor de andrógenos, funcionó como un supresor de tumor andrógeno-regulada en cáncer de próstata [41]; Yuan etc descubierto una nueva lncRNA inducida por TGF-β, lncRNA-ATB, que estimuló EMT a través de secuestrantes de miR-200 y facilitó la colonización mediante la estabilización
IL-11
mRNA, promoviendo así pasos tanto tempranas y tardías de la metástasis del cáncer [42].
se ha encontrado que lncRNAs desempeñan un papel fundamental en la alteración de la expresión de los genes codificantes de proteínas a través de cis o trans mecanismos. Aquí encontramos que lncRNAs hasta reguladas en SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR en comparación con SGC7901lncRNA como AF119893, que era antisentido intronic NRP2 (neuropilina-2). Se ha sugerido que el eje NRP2 /VEGF-C juega un papel en el cáncer de vejiga resistencia a la terapia y de la vía VEGF-paxillin-NRP2 podría representar una nueva diana terapéutica para el cáncer y otras enfermedades relacionadas con la angiogénesis. lncRNA AF461897 era intrón sentido acumulación de las ABCB9. Dong etc ha demostrado que el miR-31 ejerce un efecto anti-apoptótica más probable es que a través de la inhibición de la ABCB9 y por lo tanto proporcionar una nueva estrategia que implica el uso de miR-31 como un objetivo potencial en la quimioterapia del NSCLC. lncRNA BC065904 era intrón sentido superposición de CtBP2, uno de los corepressors de transcripción de la familia C-terminal la proteína de unión (CtBP), que funcionaba como un corepressor de E2F7 y como un regulador de respuesta al daño del ADN. lncRNA NR_026900 era exón sentido acumulación de las QSOX1, que fue demostrado para reducir la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer de mama in vitro y reduce el crecimiento tumoral in vivo.
Por otro lado, lncRNAs el regulado en SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR en comparación con SGC7901lncRNA como AF113689 era antisentido natural para RRM1. Khatri etc han informado de que la pre-exposición de RRM1 siRNA disminuyó el valor de IC50 de hidrocloruro de gemcitabina 5 pliegues en las células A-549 en comparación con clorhidrato de gemcitabina sola, lo que indica que RRM1 era un oncogén potencial de cáncer de pulmón. lncRNA uc010iyh era antisentido intrónica de NAIP (apoptosis neuronal proteína inhibidora), que es uno de los de la familia IAP. Se ha demostrado que IAPs podrían estar involucrados en el trastorno de la próstata (BPH, PIN y PC) desarrollo desde podría provocar la inhibición de la apoptosis y la proliferación de células posteriormente. LncRNA uc003jsd era exón sentido acumulación de las PDE4D, es decir, específica de cAMP 3 ', 5'-cíclico fosfodiesterasa 4D. Lin etc mostró que las funciones de PDE4D como un factor promotor de tumores y representa una enzima objeto de orientación única de las células cancerosas. LncRNA NR_002332 era exón sentido acumulación de las ST7, supresor de la tumorigenicidad 7, que ha sido propuesto para ser un gen supresor de tumor en la región del cromosoma 7q31.1-q31.2.
Pathway análisis reveló las vías posibles que implica el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) de cáncer gástrico. ARNT fue una de las 20 vías correspondido sistemáticamente hasta reguladas transcripciones y se informó de estar involucrados en el desarrollo de la resistencia a múltiples fármacos de múltiples tumores malignos [43], incluido el mieloma múltiple [44], y la LMA (leucemia mieloide aguda) [45] . MDR1 codifica la glicoproteína P, que es una bomba de salida dependiente de la energía que se podría exportar moléculas hidrofóbicas planares, incluyendo algunos fármacos quimioterapéuticos, tales como adriamicina, cisplatino, taxol y así sucesivamente de la célula [46, 47]. Aquí, encontramos que ARNT y MDR1 fueron significativamente fue comprometida hasta reguladas en SGC7901 /ADR y las líneas celulares /VCR SGC7901 compacared a SGC7901, el efecto de importantes sobre regulación de MDR1 mediada por ARNT vector de expresión de la transfección mediante Sp1 siRNAs transfección, el cual indica el papel de ARNT-MDR1pathway en el fenotipo MDR del cáncer gástrico.
investigaciones posteriores mostraron que algunos genes que codifican proteínas implicadas en el fenotipo de resistencia a fármacos y el desarrollo de tumores malignos tal vez eran cis-regulados por lncRNAs correlacionados . Por ejemplo, ABCB1 (ATP-binding cassette, subfamilia B (MDR /TAP), miembro 1, P-glicoproteína (P-gp) de genes de codificación), que se encuentra aguas arriba de 400Kb lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-relacionado y ascendente regulada lncRNA), fue significativamente hasta reguladas a través de un papel potencial de mejora similar interpretado por MRUL y promovido fenotipo de resistencia a fármacos de SGC7901 /ADR y SGC7901 células /VCR [33]; ADAM22, un gen candidato para la transformación maligna de la endometriosis de ovario [48], se correlacionó con lncRNA AL133090 de una manera sentido superpuestas exón; Plcg1 se correlacionó con lncRNA AK021471 de una manera sentido se solapan intrón y mutaciones recurrentes en plcg1 fue identificado en los angiosarcomas [49]; FYN se correlacionó con lncRNA AK AK090692 en un intrón sentido se solapan camino y antagomir-1290 suprime las células en el cáncer de pulmón de células no pequeñas CD133 (+) por la orientación relacionada fyn-Src tirosina quinasa de la familia [50], etc.
Este estudio demostró que la desregulación de lncRNAs estaba involucrado con el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos phynotype de cáncer gástrico. Un análisis más detallado de estos lncRNAs y relacionados con las vías podría dar una idea de los mecanismos de resistencia a los medicamentos de la quimioterapia del cáncer gástrico y proporcionar nuevas direcciones para la resistencia a múltiples fármacos phynotype inversa.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad médica Militar. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para todas las muestras de los pacientes.
Líneas celulares y cultivo celular
La línea celular humana GC SGC7901 se obtuvo de la Academia de Ciencias Médicas Militares (Pekín, China). Dos sublíneas resistentes a múltiples fármacos, SGC7901 /VCR y SGC7901 /ADR, se han desarrollado en nuestro laboratorio [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR y SGC7901 se cultivaron en medio RPMI1640 (Thermo Scientific Co., EE.UU.), que fue suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Thermo Scientific Co., EE.UU.) en un incubador humidificado con 5% de CO2 a 37 ° C. Se añadieron VCR (1,0 mg /ml) o ADR (0,5 mg /ml) en el medio de cultivo de las células apropiadas para mantener el fenotipo resistente a fármacos.
El aislamiento de ARN, el etiquetado y la gama de hibridación
el ARN total se extrae de SGC7901, SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) y el Kit RNeasy (Qiagen Co., Alemania) según las instrucciones del fabricante, incluyendo una etapa de digestión con DNasa. El ARN total de cada cellline se cuantificó utilizando un NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), la integridad del ARN se evaluó mediante estándar electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa, y la pureza se evaluó por la relación de absorbancia a 260 nm a 280 nm (A260 /A280). cDNA de doble cadena (ds-cDNA) se sintetizó usando 5 g de ARN total en un kit de síntesis de cDNA ds-Invitrogen superíndice en presencia de 100 pmol oligo dT. Entonces, el ds-cDNA se marcó y se llevaron a cabo la hibridación como se describe anteriormente [52]. El etiquetado de ARN y la hibridación de microarrays se realizó por Kangchen Bio-tech, Shanghai, República Popular de China.
Highthroughput lncRNA perfil de expresión análisis
ARN Calificado fue utilizado para sintetizar cDNA de doble cadena utilizando Superíndice Double- hebra de síntesis de cDNA Kit (Invitrogen Co., EE.UU.). ADNc de cadena doble se marcó y se hibrida con la V2.0 lncRNA microarrays humana (Arraystar Co. EE.UU.). microarrays V2.0 contiene alrededor de 33.000 lncRNAs recogidos de las fuentes de datos NCBI RefSeq normativas que incluyen, UCSC, RNAdb, lncRNAs de las literaturas y UCR. Las secuencias se seleccionan con las estrategias de propiedad. Se suprimieron las secuencias repetidas y ncRNAs más corta que 200 pb. Para aumentar la confianza estadística, cada matriz lncRNA humana se compone de 60,302 sondas distintas (60 meros) y cada transcripción fue representada por 1-5 sondas. Cada transcripción fue representado por una sonda de unión exón o empalme específica para identificar las transcripciones individuales con precisión. La hibridación de microarrays y el análisis bioinformático se realizó mediante Kangchen Bio-tech, Shanghai, República Popular de China. Los datos de intensidad primas y datos normalizados se muestran en la Expresión Génica Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).
Cuantitativa PCR en tiempo real (QRT-PCR)
se aisló el ARN total de SGC7901, SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) y fue luego a transcripción inversa utilizando PrimeScript RT kit de reactivos con ADNg Borrador (Perfect Tiempo real) (Takara, Dalian, china) según trucciones del fabricante. La expresión de ocho lncRNAs hasta reguladas y seis lncRNAs abajo regulados se midió mediante qRT-PCR usando ensayos SybrGreen (Takara, Dalian, China), y GAPDH se utilizó como control interno. Los primers se enumeran en la Tabla 1. El nivel de expresión de cada lncRNA se representa como factor de cambio usando 2- △△ métodos Ct. El nivel de expresión de lncRNAs expresados diferencialmente entre SGC7901 y MDR sublíneas SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR se analizaron mediante la prueba t de Student con SPSS (SPSS versión 17.0 Lnc). Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo.
histocultivo ensayo de respuesta de Drogas (HDRA) tejido tumoral fresco GC fue cosechada de cada espécimen resecado quirúrgicamente y se coloca en una placa de 24 pocillos. Cubos de la esponja gel de colágeno (1 cm
3) se sumergieron en 1 ml de RPMI 1640 que complementa con suero bovino fetal 20%. Los tejidos tumorales se colocaron en esponja de colágeno siguiente ADR se añadieron a una concentración final de 6 mg /ml y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2. Los tejidos tumorales tratados con solución salina normal (N.S) sin ADR fueron utilizados como control. Los métodos de evaluación y cálculo son como se describe anteriormente [53]. La tasa de inhibición (IR) del crecimiento tumoral = (1-media absorbancia de los pocillos tratados por gramo de tumor /absorbancia media de los pocillos de control por gramo de tumor) × 100. En este estudio, el valor de corte IR igual o mayor que 30% (IR30) se definió como la quimiosensibilidad de acuerdo con resultado estudio preliminar [54]. Del mismo modo que las instrucciones, la información clínica patológica de la fuente del tejido tumoral utilizado para HDRA se debe dar, respectivamente, se presentaron en la Tabla 2.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
La célula humana GC línea de SGC7901 se obtuvo de la Academia Militar de Ciencias médicas (Pekín, china). sublíneas resistentes a múltiples fármacos SGC7901 /VCR y SGC7901 /ADR se han desarrollado en nuestro laboratorio. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, y SGC7901 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Thermo Scientific, EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (ThermoScientific) en una incubadora de CO2 al 5% humidificada a 37 ° C. Vincristina (VCR; Sigma, Inc., St. Louis, MO; 1,0 mg /ml) y ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO; 0,5 mg /ml) se añadieron al medio de cultivo de sublíneas de células apropiadas para mantener el fenotipo resistente a fármacos
Construcción de pcDNA3.1 (+) -. ARNT plásmido
Para más de expresar ARNT, pcDNA3.1 (+) - ARNT plásmido se construyó. El vector de expresión de ADNc humano ARNT (pcDNA3.1 (+) - ARNT) fue construido por CW Biotech Co. Ltd, Beijing, China. Brevemente, el plásmido pcDNA3.1 (+) - ARNT se genera de acuerdo a la secuencia de ADNc a partir de GenBank. El gen ARNT se generó mediante amplificación por PCR. El plásmido pcDNA3.1 (+) se extrae a través de un kit Maxi Preparación (Omega, Georgia, EE.UU.). El producto de PCR se subclonó en los sitios BamHI (Takara, Mountain View, EE.UU.) y los sitios HindIII (Takara) del plásmido pcDNA3.1 por ligasa de T4 (Takara, Mountain View, Estados Unidos). El pcDNA3.1 (+) -. ARNT constructo se verificó mediante secuenciación de ADN (Invitrogen, Grand Island, EE.UU.) (datos no mostrados)
Generación de líneas celulares estables ARNT
SGC7901 /ADR las células se cultivaron en placas de 12 pocillos con 1,0 × 10
5 células de cada pocillo, en una incubadora con suministro constante de 5% de CO2 a 37 ° C. El medio se cambió 24 horas más tarde con diferentes concentraciones de G418 antibiótico G418 (600 ug /mL) y se reemplazó cada 3 días durante 14 días después de cultivo de células. células parentales fueron transfectadas con el pcDNA3.1 (+) - plásmidos ARNT usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad de células fue de 2 × 10
5 células por pocillo en placas de seis pocillos. de colonias de células monoclonales con resistencia a G418 se generó utilizando el método de dilución limitante mediante el cultivo de células individuales en 100 l de medio en placas de 96 pocillos durante 24 h. colonias de células monoclonales fueron digeridos 15 días más tarde para la amplificación adicional a las células de cultivo con expresión ARNT estable en placas de 24 pocillos. Las células se transfieren a un matraz de cultivo celular hasta que fue de aproximadamente 90% de confluencia. Los ARNT líneas celulares transfectadas sobre-expresado por pcDNA3.1 (+) - ARNT fueron nombrados como SGC7901 /ADR ARNT
ARN pequeño de interferencia (siRNA) transfección
Para knockdown el ARNT expresión mRNA. , se realizó siRNA transfección. Para las transfecciones, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 50 nM siRNA (Gen Pharma Co., Shanghai, China) se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, tal como se describe anteriormente [55]. Las secuencias de siRNA utilizados son: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'
Western Blot
proteína celular total se lisaron usando tampón de lisis suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM. ) sobre hielo. Entonces, la proteína se sometió a electroforesis a través de 12% en geles de SDS poliacrilamida y se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore, Massachusetts, EE.UU.). 5% de leche sin grasa en polvo se utiliza para bloquear las membranas a temperatura ambiente durante 1 h y los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente después de tres lavados de 10 min en trietanolamina solución salina tamponada con Tween (TBS-T). Por último, las señales se detectaron utilizando un kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EE.UU.) y las membranas fueron escaneados y analizados mediante un ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, EE.UU.) sistema de imagen con el software de imagen (Versión 1.0) .