Extracto
El cáncer gástrico es una enfermedad maligna que surge del epitelio gástrico. Un biomarcador potencial para el cáncer gástrico es la anexina A4 proteína (ANXA4), un intracelular de Ca
2 + sensor. ANXA4 se encuentra principalmente en las células epiteliales, y se sabe que está implicada en diversos procesos biológicos, incluyendo la apoptosis, el ciclo celular y la anticoagulación. Con respecto al cáncer, ANXA4-sobreexpresión se ha observado en los cánceres de diversos orígenes, incluyendo tumores gástricos asociados con
Helicobacter pylori
infección.
H. pylori induce la expresión
ANXA4 e intracelular [Ca
2 +]
i elevación, y es un importante factor de riesgo de carcinogénesis que resulta en cáncer gástrico. A pesar de esta correlación, el papel de ANXA4 en la progresión de los tumores gástricos sigue siendo poco clara. En este estudio, hemos investigado si ANXA4 puede mediar la tasa de crecimiento de las células y si las señales de aguas abajo ANXA4 están implicadas en la tumorigénesis. Después de observar la tasa de crecimiento de las células en tiempo real, se determinó que ANXA4 promueve la proliferación celular. El perfil de la transcripción de genes de las células que sobreexpresan ANXA4 se midió y se analizó mediante exón arrays humanos. De estos datos de genes de transcripción, se muestra que la sobreexpresión de ANXA4 regula los genes que se sabe que están relacionados con el cáncer, por ejemplo la activación de hialuronano mediada por receptor de la motilidad (RHAMM), AKT, y quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1), así como la supresión de p21. La regulación de estos genes induce la proliferación de células cancerosas. También encontramos Ca
2 + podría regular la transmisión de señales aguas abajo por ANXA4. Sugerimos que ANXA4 desencadena una cascada de señalización, lo que lleva a una mayor proliferación de células epiteliales, en última instancia, la promoción de la carcinogénesis. Por tanto, estos resultados podrían proporcionar una nueva visión para la terapia del cáncer gástrico, específicamente a través de la modificación de la actividad ANXA4
Visto:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) revelar el mecanismo molecular del cáncer gástrico marcador Anexina A4 en la proliferación de células cancerosas Usando Exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615
Editor: Eric Y. Chuang, Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 6 Junio, 2012; Aceptado: 6 Agosto de 2012; Publicado: 7 Septiembre 2012
Copyright: © Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), Proyecto de la Universidad Nacional de Taiwán la investigación de vanguardia de dirección (10R70602C3) y el Instituto Nacional de Investigación en Salud, Taiwán (NHRIEX100-9819PI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y muestra una alta prevalencia en las poblaciones asiáticas. Aunque la incidencia de cáncer gástrico está disminuyendo, la tasa de supervivencia global a 5 años sigue siendo baja [1]. La determinación de los más eficaces terapias contra el cáncer gástrico y el desarrollo de la etapa inicial de las herramientas de diagnóstico son estrategias importantes que afectan a los resultados clínicos. La investigación exhaustiva de los mecanismos moleculares que subyacen a la carcinogénesis gástrica podría prestar asistencia en el desarrollo de estrategias terapéuticas útiles para esta enfermedad.
Helicobacter pylori
es un patógeno gástrico y es el factor etiológico predominante para la carcinogénesis gástrica . Aproximadamente la mitad de la población mundial está infectada con el
H. pylori
, y más de 60% de los pacientes con cáncer gástrico tienen una historia de
H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Estudios recientes han demostrado que
H. pylori
puede inducir tanto la proliferación de células de cáncer gástrico y respuestas inflamatorias de la mucosa [5], [6]. Por lo tanto, con el fin de investigar los mecanismos moleculares subyacentes carcinogénesis gástrica, es necesario investigar el papel y los mecanismos de
H. pylori
en la carcinogénesis gástrica.
Las anexinas se expresan de forma ubicua en la mayoría de los organismos, incluyendo animales, plantas, hongos y protistas. Se asocia con una variedad de funciones fisiológicas [7]. Sobre la base de la estructura de su dominio central conservado, anexinas se consideran intracelular de Ca
2 + sensores y proteínas de unión a fosfolípidos. Han sido observados para estimular el tráfico de membrana y la agregación de vesículas en respuesta al aumento intracelular [Ca
2 +]
i [8], [9]. En los seres humanos, las anexinas se ha observado que tienen una gama de funciones celulares que se han implicado en la organización del citoesqueleto, la exocitosis, endocitosis, la regulación de los canales iónicos, la inflamación, la apoptosis, la fibrinolisis y la coagulación [8]. también se consideran anexinas estar involucrados en el cáncer, la diabetes y la inflamación [10]. Recientemente, más y más estudios han surgido que implican la participación de las anexinas en la carcinogénesis, así como la promoción de la proliferación [11], [12], invasión [13] y la metástasis [14], [15]. Sin embargo, la relación entre todos los miembros de la familia de las anexinas con el cáncer no se ha caracterizado.
anexina A4 (ANXA4) es un miembro de la familia anexinas asociado con el sistema digestivo. Se expresa prominente en las células epiteliales [16]. Estudios recientes han demostrado que ANXA4 se considera que es un biomarcador potencial gástrico en base a su identificación en los tejidos de pacientes con cáncer gástrico en estudios proteómicos. Sobre regulación de ANXA4 se encuentra específicamente en
H. pylori
tejidos tumorales infectadas [17], [18]. Además, muchos estudios han informado de una relación entre la expresión ANXA4 y el cáncer. Esta relación se ha informado en adenocarcinoma de páncreas [19], carcinoma de células claras de ovario [20], [21], carcinoma renal [22], carcinoma de colon [23] y el cáncer de próstata [24]. En el carcinoma de células renales, sobre regulación de ANXA4 participa en la difusión de las células tumorales, la promoción de la migración celular [22]. En pacientes con cáncer colorrectal, la alta expresión de ANXA4 se asoció con una baja tasa de supervivencia y se informó como un posible biomarcador para el diagnóstico del tumor [23]. En la medida en función de como celular, ANXA4 podría inducir la señalización de calcio, la anticoagulación y la resistencia a la apoptosis [25], [26]. Estos hechos indican que ANXA4 tiene una función tumorigénicos mediante la regulación de la tasa de crecimiento celular.
En este estudio, se intentó dilucidar el mecanismo molecular por el cual ANXA4 induce carcinogénesis. Para lograr esto, que supervisó la tasa de crecimiento de células de cáncer gástrico con diferentes niveles de expresión de ANXA4. También se evaluó el perfil de expresión transcripcional de las células que sobreexpresan ANXA4 y utilizamos exón arrays para analizar la señalización aguas abajo de ANXA4. A partir de estos estudios, se identificaron 9 genes relacionados con el cáncer de señales descendentes ANXA4 mediante el uso de la base de datos de Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Por otra parte, hemos demostrado que ANXA4 regula la activación de RHAMM, AKT, CDK1 y la supresión de p21, por lo que propuso una vía de proliferación celular ANXA4 reguladas.
Resultados
La activación de ANXA4 Promueve La proliferación celular
Hemos informado anteriormente de que ANXA4 se sobreexpresa en
H. pylori
infectada tejido tumoral gástrico [17]. Para investigar más a fondo la relación entre ANXA4 y la carcinogénesis, que tuvo como objetivo determinar si ANXA4 promueve la proliferación celular. Las células fueron transfectadas con cualquiera de las expresiones ANXA4 de larga duración
ANXA4
ADNc para aumentar o siRNA dirigidos a silenciar la expresión ANXA4. Después de la transfección, que supervisó la tasa de crecimiento de células de cáncer gástrico AGS utilizando un sistema de análisis celular en tiempo real (RTCA). El número de células se registraron como un valor del Índice de Células (CI). Las curvas de crecimiento de células AGS se modificaron después de la transfección. La sobreexpresión de ANXA4 aumentó significativamente la tasa de crecimiento celular en células AGS comparación con las células de control (
P
& lt; 0.001; Figura 1A), mientras que ANXA4 desmontables disminuyó significativamente la tasa de crecimiento (
P & lt
; 0,001; Figura 1B). Estos resultados sugieren que ANXA4 tiene el potencial de promover la proliferación celular.
Para medir la proliferación celular, las células AGS se cultivaron en un 16 pocillos de microtitulación E-placa. Después de la incubación durante 24 h, la tasa de crecimiento celular de las células (A) que sobreexpresan ANXA4, y las células (B) que contiene
ANXA4
específicos de siRNA se midieron. Se observó que ANXA4 regula el índice celular de una manera dependiente del tiempo. (A y B) Los datos se normalizaron a partir de mediciones tomadas a las 24 h, que fue cuando se inició la transfección. El tiempo de detección de tres experimentos independientes se representa como media ± SD, n = 3.
P
valores se calcularon utilizando la muestra de dos test de Kolmogorov-Smirnov.
ANXA4 aumenta la expresión de las proteínas de membrana, RHAMM y LÁMPARA2
también se examinó la diferencia en la expresión de genes entre células que sobreexpresan ANXA4 y control de las células que expresan un vector vacío. Examinamos esta utilizando el análisis de exón gama, que ofrece una visión más precisa de la expresión de genes a nivel mediante el uso de cuatro sondas por el exón, en comparación con los 3 'matrices convencionales [27]. En la figura S1, el
X
eje x del gráfico de dispersión muestra las intensidades de expresión sonda midieron en un experimento y el
Y-
eje Y muestra la intensidad de la expresión de la sonda de medición en el otro experimento . Estos resultados indican una correlación entre los resultados de ambos experimentos y por lo tanto indican una consistencia entre nuestros microarrays duplicados. Los niveles de expresión de genes se calcularon a partir de las intensidades medidas a través de la sonda fija. En general, la expresión de 1.052 genes se encontró que eran significativamente diferentes (
P
& lt; 0,05). Entre las células ANXA4 sobreexpresan y células de control
ANXA4 es una proteína de unión a la membrana plasmática, por lo que proponen que otras proteínas de la membrana plasmática puede ser regulada por ANXA4 y trabajan juntos para transducir su señalización aguas abajo. Para explorar la transducción de señalización regulada por ANXA4, hemos investigado las proteínas de la membrana plasmática de la matriz de análisis de exón. Se han observado Cuarenta y siete proteínas de la membrana de plasma para tener un cambio ≥1.5 veces en las células ANXA4 sobreexpresan (Tabla S1). Entre éstos, el receptor de la motilidad mediada por ácido hialurónico (
HMMR
) mostró el mayor incremento en la expresión (2,4 veces; Tabla S1). Por otra parte, nuestro estudio anterior mostró que la expresión de la superficie celular de la proteína de la membrana lisosomal asociada a 2 (
LÁMPARA2
), un marcador lisosomal, está regulado por ANXA4 y está involucrada en la exocitosis (Figura S2 y S1 File) . Aquí, la expresión transcripcional de la
LAMP2
también mostró un aumento en la expresión (1.8 veces; Tabla S1) cuando se mide por análisis de exón matriz. En este estudio, ANXA4 se sobreexpresa o silenciada (Figura 2A) y después se analizó por inmunotransferencia para comprobar la expresión de la proteína de RHAMM y LAMP2. ANXA4 sobreexpresión aumentó la expresión de RHAMM (Figura 2B) y LÁMPARA2 (Figura 2C) y, en consonancia con esto, la caída de expresión ANXA4 disminuyó sus niveles de expresión (Figura 2B y 2C).
(A) AGS Las células fueron transfectadas ya sea con un vector vacío (pcDNA3.1), de larga duración
ANXA4 gratis (pcDNA3.1 /
ANXA4
), control de siRNA (siCONTROL), o
ANXA4
siRNA (SI
ANXA4
). (B-C) RHAMM y expresiones LÁMPARA2 se midieron en células que sobreexpresan ANXA4 o células que contienen
ANXA4
específicos de siRNA por análisis de inmunotransferencia. (B) La expresión de RHAMM fue significativamente hasta reguladas (
P Hotel & lt; 0,05) después de que sobreexpresan ANXA4 y significativamente las reguladas (
P Hotel & lt; 0,01) después de silenciamiento de la expresión ANXA4. (C) La expresión de LÁMPARA2 fue regulada hasta después de que sobreexpresan ANXA4 y significativamente las reguladas (
P Hotel & lt; 0,05) después de silenciamiento de la expresión ANXA4. Los datos se representan como media ± SD, n = 3. *
P
. & Lt; 0,05 frente a los valores de control de tratamiento
relacionados con el cáncer ANXA4 sobreexpresión regula la expresión génica
Se utilizó la base de datos de Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para llevar a cabo un análisis de la función del gen de la matriz de datos exón y encontramos que 25 de los 42 genes fueron elegibles para el análisis de la función de red (expresión diferencial ≥2 veces,
t
prueba,
P Hotel & lt; 0,05) (Tabla 1). Tres redes funcionales se asociaron significativamente con los genes regulados ANXA4. La red estaba más fuertemente asociado
cáncer, ciclo celular, y el sistema reproductivo de la enfermedad gratis (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 3A), y la parte superior del ranking de enfermedades o trastornos fue
cáncer gratis (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 3B). Hubo 9 genes clasificados como genes relacionados con el cáncer en las células que sobreexpresan ANXA4 incluyendo 7 genes que son regulados hasta en nuestros experimentos. Estos genes son la traducción eucariótica factor de iniciación 4E (
EIF4E
), complejo succinato deshidrogenasa, subunidad C, proteína de membrana integral, 15 kDa (
SDHC
), quinasa dependiente de ciclina 1 (
CDK1
), elimina en la leucemia linfocítica 2 (
dLEU2
), la cromatina modificación de la proteína 5 (
CHMP5
), proteínas que interactúan INTEMPORAL (
tipin
), PDZ quinasa vinculante (
PBK
). Coriónica somatomamotropina hormona 1 (lactógeno placentario) (
CSH1
) y el interferón alfa 2 (
IFNA2
) se redujeron regulado por ANXA4. En base a los resultados, proponemos que ANXA4 tiene una función en la inducción de la proliferación celular. Por otra parte,
CDK1
y
PBK gratis (Figura 3B y Tabla 1) fueron considerados de estar involucrados en el modelo de inducción de la proliferación ANXA4. Puesto que la activación CDK1 se asocia con la proliferación de las células en el desarrollo de linfoma MALT gástrico [28]. La activación mutuo de CDK1 y PBK se ha informado anteriormente [29]. En este estudio, la sobre regulación de
CDK1
y
PBK
observado en células que sobreexpresan ANXA4 fue validado mediante la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) (Figura S3) .
(a) 25 de los 42 genes candidatos mostraron una diferencia significativa en la expresión (un aumento del pliegue de ≥2 o una disminución pliegue de ≤0.5,
P Hotel & lt; 0,05 ) y se clasificaron entre las tres redes de alta clasificación. (B) Los genes fueron clasificados de acuerdo a sus funciones documentadas /establecidas en varios estados de enfermedades y trastornos.
ANXA4 regula la activación de AKT, CDK1 y la represión de p21
activación de CDK1 , que está regulado por p21, inhibe la fase de detención /M G2, promoviendo así la mitosis y la proliferación celular [30]. También se ha informado de que los bloques de AKT la activación de p21, provocando su acumulación en el citoplasma y la promoción en consecuencia la proliferación celular [31]. Utilizando el análisis de inmunotransferencia, se observó que la sobreexpresión de ANXA4 aumentó la fosforilación de la serina 473 en AKT y treonina 161 en CDK1 y la disminución de la expresión de p21 (Figura 4A). Además de esto, la caída de la expresión ANXA4 disminuyó fosfo-AKT y fosfo-CDK1 y aumentó la expresión de p21 (Figura 4B). Estos datos sugieren que fosfo-AKT, fosfo-CDK1 y p21 están regulados por ANXA4 y son señales descendentes de ANXA4
(A
- Francia B). Los niveles de proteína de p21, fosfo-AKT ( Ser473) y fosfo-CDK1 (Thr161) en células AGS, como se determina por análisis de inmunotransferencia. Las células (A) fueron transfectadas con el vector vacío o de larga duración
ANXA4
. (B) Las células fueron transfectadas con siCONTROL o Si
ANXA4
. Los datos representativos de tres experimentos independientes se presentan como media ± desviación estándar. α-tubulina se utilizó como control interno. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 frente a los valores de control de tratamiento
Ca
2 + media la transducción de señalización corriente abajo ANXA4
en la carcinogénesis, Ca
2 + está implicada en la causa de la transducción de señales para mediar en una amplia variedad de procesos biológicos incluyendo la invasión, la proliferación, la angiogénesis y la metástasis [32]. Se ha informado de que las anexinas pueden mediar algunos mecanismos fisiológicos en un Ca
2 + -dependiente [9]. En estudios previos, intracelular [Ca
2 +]
i elevación fue inducida por
H. pylori
infección, lo que, a su vez, hasta regula la expresión ANXA4 [17], [33]. Para determinar si un aumento de intracelular [Ca
2 +]
i media la transmisión de señales aguas abajo de ANXA4, las células AGS fueron tratados con ionomicina. Ionomycin es un Ca
2 + ionóforo y se añadió al medio de cultivo en nuestro modelo de células AGS para inducir una elevación sostenida de intracelular [Ca
2 +]
i [34]. Las expresiones proteína de ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT y fosfo-CDK1 se midieron mediante análisis de inmunotransferencia (Figura 5A). Al igual que en nuestras observaciones con sobreexpresión ANXA4, el aumento de [Ca
2 +]
i niveles significativamente hasta reguladas expresión de la RHAMM (
P Hotel & lt; 0,01) y fosfo-AKT (Ser 473) (
P Hotel & lt; 0,05) y significativamente baja regulado la expresión de p21 (
P Hotel & lt; 0,01) (Figura 5B). la activación de CDK1 se aumentó ligeramente por [Ca
2 +]
i elevación. Sin embargo, elevado [Ca
2 +]
i niveles no tuvo ningún efecto sobre la expresión de ANXA4 y LÁMPARA2. En nuestro estudio anterior, ANXA4 y LÁMPARA2 pueden localizar a la membrana plasmática después de
H. pylori
la infección con intracelular [Ca
2 +]
i elevación (Figura S4 y el archivo S1). Estos resultados sugieren que el Ca
2 + simplemente cambia la localización intracelular de ANXA4 y LÁMPARA2, pero no regula su expresión.
Las células (A) fueron tratados con ionomicina para aumentar intracelulares de Ca
2 + niveles, y los niveles de expresión de ANXA4, LÁMPARA2, RHAMM, fosfo-AKT (Ser473), p21, y fosfo-CDK1 (Thr161) se mostraron por inmunotransferencia. (B) El histograma muestra los niveles correspondientes de (A). Las expresiones relativas de RHAMM (
P Hotel & lt; 0,01), fosfo-AKT (Ser473) (
P Hotel & lt; 0,05) y p21 (
P Hotel & lt; 0,01) fueron significativamente diferentes. Los datos se toman de tres experimentos independientes (media ± DE). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 frente a los valores de control de tratamiento
Discusión
En la investigación del cáncer, la identificación de biomarcadores y la posterior aclaración de sus relaciones con la tumorigénesis mecanicistas pueden contribuir al desarrollo de herramientas de diagnóstico útiles y resultar en estrategias terapéuticas óptimas. Recientemente, cada vez más los estudios han demostrado que las proteínas candidatas biomarcador en la familia de las anexinas son potencialmente clave en la progresión de diversos tipos de cáncer; por ejemplo, ANXA1 para el cáncer de células claras renal, ANXA2 para el cáncer gástrico y el cáncer colorrectal, ANXA4 para el cáncer colorrectal, ANXA8 de cáncer de mama, ANXA10 para el cáncer hepatocelular, ANXA11 de cáncer de ovario y cáncer de colon [35]. ANXA4, un miembro de la familia de las anexinas, se ha observado que se sobreexpresa en los tejidos tumorales gástricas y también está asociado con el
H relacionada con el cáncer gástrico. pylori
la infección [17]. Además, otro miembro de la familia de las anexinas, ANXA2, también se ha observado que se sobreexpresa en el cáncer gástrico y está relacionado con un peor pronóstico clínico, por lo que es un potencial factor pronóstico [36]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren la participación de ANXA4 en la tumorigénesis; sin embargo, su mecanismo exacto en el proceso sigue siendo poco clara. Con el fin de evaluar más a fondo la función celular de ANXA4 en la progresión del cáncer gástrico, se exploró la relación entre los dos y posteriormente demostrado que ANXA4 puede regular los genes relacionados con el cáncer y propagar el camino a la proliferación celular.
el presente estudio, se encontró que las proteínas de carcinogénesis asociada como RHAMM, AKT, p21, PBK, y CDK1 están regulados por la sobreexpresión de ANXA4. Una representación esquemática de las señales de aguas abajo inducidas por ANXA4 relacionados con la proliferación celular se muestra en la Figura 6.
HMMR
(RHAMM) es un oncogén que se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico, y se ha implicado en muchas celular procesos, tales como la señalización celular, la proliferación celular, y la tumorigénesis [37], [38].
ANXA4 se une a la membrana plasmática en un Ca
2 + -dependiente e induce la transducción de señalización corriente abajo. ANXA4 hasta regula LÁMPARA2, un marcador lisosomal involucrada en la exocitosis, y RHAMM. Los informes anteriores han demostrado que RHAMM activa RAS y PI3K, que posteriormente conduce a la inducción de la AKT. ANXA4 hasta regula la activación de AKT y CDK1, la expresión génica PBK y regula a la baja p21. Ca
2 + también hasta regula RHAMM y fosfo-AKT y p21 regula a la baja. Esta cascada de señales podría eventualmente conducir a la hiperproliferación celular. Las líneas continuas con flechas y círculos azules indican confirmaron la regulación; líneas de puntos con flechas y círculos de color púrpura indican las referencias o las interacciones no confirmados.
Se ha informado de que RHAMM induce la cascada de señalización RAS y activa AKT [39]. La cascada de señalización RAS transduce señales descendentes mediante la activación de fosfo-AKT través phosphoinositide 3-quinasas. Esta activación de AKT también ha sido reportado como un marcador para la progresión del cáncer gástrico [40]. Hemos informado anteriormente de que
H. pylori
infección está asociada con la sobreexpresión ANXA4 [17].
H. pylori
puede suministrar el gen citotoxina asociada A (CagA) en las células huésped, lo que resulta en la activación de AKT, y promoviendo así la proliferación celular [41]. En cuanto a la supervivencia celular, AKT suprime la apoptosis mediante la estimulación de NF-kB [42]. Estudios recientes también han demostrado que ANXA4 interactúa con p105 (la proteína precursora p50 NF-kB) y suprime la actividad transcripcional de NF-? B para inducir un efecto anti-apoptótico [25]. En conjunto, estas observaciones indican que ANXA4 juega un papel importante en la supervivencia celular y el crecimiento celular.
CDK1-ciclina B1 complejos regulan la fase del ciclo celular G2 /M y también se han implicado en la promoción de tumorigénesis [43]. Un estudio reciente reveló que el aumento de expresión de CDK1 se asocia con la progresión de
H. pylori
gastritis -asociado al linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa [28]. En este estudio, la activación de CDK1 fue hasta reguladas por ANXA4. Estos hechos sugieren que ANXA4 podría mediar la vía de señalización corriente abajo, lo que conduce a la tumorigénesis en pacientes con cáncer gástrico con un
H. pylori
infección.
Además de su participación en la progresión del cáncer, ANXA4 también se ha relacionado con la quimio-resistencia adquirida a los medicamentos contra el cáncer [44], [45], [46]. En una línea de células resistentes a paclitaxel (H460 /T800), la expresión ANXA4 se incrementa y localizada en el núcleo [44]. En el carcinoma de células claras de las células de ovario y el mesotelioma, la expresión ANXA4 es elevado y se asocia con la resistencia al tratamiento con carboplatino, y se considera que es un biomarcador de susceptibilidad a cisplatino [45], [46]. Por otra parte, es un ANXA4 intracelular de Ca
2 + sensor, y Ca
2 + juega un papel importante en la neurotoxicidad y la insuficiencia cardíaca [47], [48]. Estudios recientes han demostrado que el aumento de la cantidad de ANXA4 no sólo se asocia con el cáncer, sino también la enfermedad de Alzheimer, insuficiencia cardíaca y lesión celular causada por el etanol [49], [50], [51].
Ca
2 + también se requiere sistema de mensajería para el proceso de proliferación celular y puede regular el ciclo celular [52], [53]. Se ha informado de que el Ca
2 + puede activar vía AKT para promover la supervivencia celular [54]. En este estudio, se encontró que la expresión de RHAMM, fosfo-AKT y la supresión de p21 se incrementaron significativamente por la [Ca
2 +]
i elevación (Figura 5).
H. pylori
la infección está asociada con la sobreexpresión ANXA4 e intracelular [Ca
2 +]
i elevación (Figura S4 y File S1) [17], [33]. Estos resultados indican que
H. pylori
infección podría inducir a algunos de señalización corriente abajo de ANXA4 mediante la estimulación intracelular [Ca
2 +]
i elevación. Sin embargo, el mecanismo de detalle en el proceso podría ser complejo y sigue sin estar claro. Estos podrían proporcionar elucidación de proceso de tumorigénesis gástrica subyacente
H. pylori
estimulación. En su conjunto, esta evidencia sugiere que el Ca
2 + podría ayudar a ANXA4 para la transducción de la señalización y promueve tumores gástricos en pacientes con
H. pylori
infección.
En conclusión, nuestros resultados muestran que el silenciamiento de ANXA4 disminuye la proliferación de células epiteliales, mientras que su sobreexpresión aumenta la proliferación. Además, ANXA4 induce señales aguas abajo que promueven el crecimiento celular. Nuestra hipótesis es que estas señales aguas abajo y la activación de la división de la célula huésped pueden ser eventos patogénicos en
H. pylori
carcinogénesis inducida. En la terapia clínica actual, AKT, p21 y CDK1 se han utilizado como una diana de fármaco contra el cáncer. inhibidor de AKT, Perifosine, es un agente oral anti-cáncer y tiene actividad anti-proliferación en varios modelos de tumores [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) y vincristina puede inducir y aumentar la expresión de p21 para disminuir G2 /M detención y la proliferación celular bloque [58], [59], [60], [61]. El flavopiridol es un inhibidor de varias CDK incluyendo CDK1 para inducir la apoptosis y anti-angiogénesis [62]. Estos estudios indican que la elevación de ANXA4 en pacientes podría ser considerado como una diana de fármaco para la terapia de cáncer gástrico. El uso de varios fármacos en combinación podría proporcionar un tratamiento más eficaz para el bloqueo de las señales en la vía. En su conjunto, este estudio podría proporcionar nuevos conocimientos sobre el desarrollo de estrategias terapéuticas para el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
adenocarcinoma de estómago humano células AGS (CRL-1739, ATCC) se cultivaron en 90% RPMI 1640 (Biological Industries, Bet Haemek, Israel), que fue suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal 10% (Biological Industries, Bet Haemek, Israel) . Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda controlada en un incubador que contenía 5% de CO
2.
Los plásmidos y transfecciones
De larga duración
ANXA4
WAS amplificado por PCR utilizando el par de cebadores
ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') y
ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), y el producto de amplificación se insertó en los sitios HindIII /sitios EcoRI de pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA).
ANXA4
específicos de siRNA y control negativo de la cautela siRNA (RNAi sigilo ™) fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se cultivaron en placas de seis pocillos o en cubreobjetos recubiertos de 24 h. Las células fueron luego transfectadas transitoriamente con pcDNA 3.1 (+) /
ANXA4 gratis (8 mg para una placa de seis pocillos; 0,4 mg /ml de 96 pocillos E-placa) o
ANXA4
siRNA (100 pmol para una placa de seis pocillos; 10 pmol de 96 pocillos E-placa) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La eficiencia de vector de expresión y la transfección de ARNsi se analizó mediante inmunotransferencia. Después de la transfección durante 48 h, se detectó la expresión diferencial de proteínas y genes
Los anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales de ratón utilizadas en este estudio fueron los siguientes:. P34 CDK1 (sc-51578) de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.); LAMP2 (ab25631) y RHAMM (ab67003) de Abcam (Cambridge, Reino Unido); y α-tubulina (T5168) de Sigma (Dorset, UK). El conejo anticuerpos policlonales fueron los siguientes: ANXA4 (sc-28827), p21 (sc-397), y p34 pCDK1 (Thr 161; sc-101654) de Santa Cruz Biotechnology; y AKT (9272) y pAKT (Ser473; 9271S). de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.)
inmunotransferencia
Los lisados celulares se prepararon a partir de células AGS que fueron transitoriamente transfectadas con el vectores de expresión pcDNA 3.1 (+) /
ANXA4 gratis (8 mg) o
ANXA4
siRNA (100 pmol). Para determinar las diferencias en la expresión de proteínas bajo condiciones de alta intracelular [Ca
2 +]
i, ionomicina (5 mM) se añadió a las células durante 1 h. Para estudiar los efectos de la inhibición de la fosforilación de Akt, se mueren de inanición las células durante 1,5 h después de una 48-h de la transfección y se trataron con 5 mM de la VIII inhibidor de AKT (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) durante 1 h. Las muestras fueron separadas por 10% SDS-PAGE y luego transferidos sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). anti-ANXA4 (: Después del bloqueo en 5% de leche descremada y suero salino (TBS) que contenía 0,1% de Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, se aplicaron los siguientes anticuerpos primarios tris-tamponada 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pAKT (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500), y el anticuerpo anti-RHAMM (1:400). Las membranas se incubaron con anticuerpos de cabra secundario anti-ratón conjugadas IgG (Sigma) o de cabra anti-conejo conjugado IgG (Rockland, Gilbertsville, PA), respectivamente. a-tubulina de anticuerpos (1:4000) se utilizó como control interno. Las inmunotransferencias se desarrollaron utilizando mayor quimioluminiscencia (ECL) kit de detección (Millipore) y se visualizaron en películas de rayos X. La intensidad de las bandas observadas se normalizó a la intensidad de la banda de α-tubulina. El análisis densitométrico se realizó a través de Kodak D-1 versión de software 3.6 Análisis de Imágenes (Eastman Kodak, Londres, Reino Unido).
El exón gama de hibridación y análisis
Para estudiar los genes abajo de ANXA4, se compararon los perfiles de expresión génica entre las células transfectadas con pcDNA3.1 (+) /
ANXA4
y células de control transfectadas con un vector vacío usando una matriz de exón. El ARN celular total se extrajo usando reactivo TRIzol® (Invitrogen), y el ARN pureza fue confirmada por espectrofotometría (relación A260 /A280), así como por electroforesis capilar (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.). el procesamiento del ARN y la hibridación se realizaron utilizando los Affymetrix Human exón 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada matriz tiene 28.869 genes bien anotado con 764,885 sondas diferentes. La matriz contiene aproximadamente 26 sondas para cada gen. información de Affymetrix sonda fija se muestran en el sitio web NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. el análisis de microarrays (n = 2 por grupo) se realizó utilizando la versión 6.5 Partek Genómica suite (Partek Inc., St. Louis, MO, EE.UU.). Los datos en bruto (archivos CEL) se normalizaron utilizando el algoritmo robusto de promedio multichip (RMA) y se analizaron utilizando
t
pruebas. Análisis de la función y el mecanismo biológico de los genes expresados diferencialmente se realizó utilizando el software del análisis Ingenuity Pathway (IPA) versión 7.5; una puntuación de 3 o superior se consideró estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,01) para anotar la información. Hemos presentado la matriz de datos a la base de datos GEO, y el número récord de la serie es GSE33620.
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
Los datos obtenidos exón serie utilizando el software Partek y la base de datos de IPA fue confirmada por QRT-PCR.