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PLOS ONE: roturas de ADN de doble cadena inducidas por efectos mecánicos de cavitación del ultrasonido en Cancer Cell tecnologías Lines

2015/11/19


Extracto

ultrasónicos impregnan el campo de la medicina: como una modalidad de imagen de larga data en el diagnóstico clínico; y, con la aparición de alta intensidad dirigida ultrasonido enfocado, como medio de los tumores de ablación térmicamente. En paralelo, también se está evaluando rigurosamente el potencial de los ultrasonidos de intensidad intermedia [no térmico] como una terapia mínimamente invasiva. Aquí, se ha observado la inducción de la apoptosis en células de cáncer, aunque la identificación definitiva del mecanismo subyacente hasta el momento ha sido difícil de alcanzar. Un proceso probable candidato ha sugerido involucrar la actividad sonoquímica, donde las especies reactivas de oxígeno (ROS) median la generación de ADN se rompe solo capítulo. Aquí, sin embargo, le proporcionamos nuevas pruebas convincentes de que apoya firmemente un mecanismo puramente mecánico. Por otra parte, por una combinación de ensayos específicos (de la cola del cometa neutro y de tinción para la formación de focos γH2AX) hemos demostrado por primera vez que la exposición en los Estados Unidos incluso intensidades moderadas exhibe potencial genotóxico, a través de su facilidad para generar daño en el ADN a través de múltiples líneas de cáncer. En particular, los ensayos de colocalización destacar que la radiación ionizante y la ecografía tienen claramente diferentes firmas a sus respectivos patrones de formación de focos γH2AX, probablemente refleja las diferentes distribuciones de tensiones que iniciaron la formación de daños. Por otra parte, paralelamente inmunotransferencia sugiere que la DNA-PKcs tienen un papel preferente en la reparación de los daños inducidos por ultrasonidos

Visto:. Furusawa Y, Fujiwara Y, P Campbell, Zhao QL, Ogawa R, Ali Hassan M , et al. (2012) rupturas de ADN de doble cadena inducidas por efectos mecánicos de cavitación del ultrasonido en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 7 (1): e29012. doi: 10.1371 /journal.pone.0029012

Editor: Martin G. Marinus, Universidad de Massachusetts Medical School, Estados Unidos de América

Recibido: 26 Septiembre, 2011; Aceptado: 18 Noviembre 2011; Publicado: enero 3, 2012

Derechos de Autor © 2012 Furusawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) (22390229), la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el ultrasonido (US) es indispensable en la mayoría de los campos de la medicina: (i) los Estados Unidos a intensidades muy bajas (& lt; 0,1 MPa de presión acústica) muy por debajo de los umbrales de los efectos adversos que presenta térmicas y /o cavitación se utiliza con fines médicos diagnóstico; (Ii) enfocado de alta intensidad de Estados Unidos (HIFU, & gt; 10 MPa de presión acústica) se utiliza para la ablación térmica de tumores; y (iii) no térmica de baja intensidad de Estados Unidos (0,1-1,5 MPa de presión acústica entre los dos anteriores) como un candidato potencial para la terapia del cáncer está actualmente bajo investigación [1]. Los tejidos expuestos a la energía de los Estados Unidos pueden obtener un espectro de respuesta biológica, cada uno con potencial terapéutico distinto [1] - [6], incluyendo la absorción de moléculas exógenas [7] - [14], necrosis y apoptosis [1], [3] , [6], [15], [16]. Los modos biofísicas de los Estados Unidos se dividen en tres clases, térmica, cavitación y efectos no térmicos no cavitación. La cavitación conduce a una variedad de tensiones mecánicas, tales como la tensión de cizallamiento, ondas de choque, de alta presión, y el estrés químico debido a la formación de radicales libres, los cuales se han deducido a actuar simultáneamente sobre todos los materiales biológicos [15] - [17]. La acumulación de pruebas indica que la intensa EE.UU., así como de baja intensidad de EE.UU. excluyendo efecto térmico inducimos especies reactivas de oxígeno (ROS), la fluidez de membrana, roturas de ADN de cadena sencilla (SSB) y varios estudios anteriores implicaba la importancia de SSB derivados de ROS producido sonochemically como daño en el ADN inducido por Estados Unidos de iniciar la muerte celular /de la muerte [2] - [4], [6], [15]. Sin embargo, este punto de vista es cuestionable, debido a numerosos SSB inducidos, por ejemplo, por la gama mmol /L de H
2O
2 conducen a ninguna o muy pocas roturas de la doble hebra (DSB), las lesiones más citotóxicos de DNA [18]. Hasta la fecha, sin embargo, no hay evidencia directa de DSBs inducción y si la activación subsiguiente de respuesta al daño del ADN (DDR) vías podría ocurrir después de la exposición a los Estados Unidos. En contraste obvio, los datos sobre la respuesta celular a la radiación ionizante (IR), incluyendo la inducción de DSBs de ADN y la respuesta al daño aguas abajo (DDR) se han reportado más ampliamente [19]. A continuación, nos dirigimos a este punto, la evaluación del potencial genotóxico de baja intensidad de Estados Unidos. En nuestro estudio, se evaluaron varios puntos finales definitivos relacionados con la formación y transformación de daño en el ADN, incluyendo las DSB, después de la exposición a los Estados Unidos con un conjunto de experimento llevado a cabo en paralelo con la irradiación IR sering como controles positivos.

Resultados y Discusión

Neutral cola de cometa ensayar (NCTA) se utilizó para detectar el ADN DSBs que ocurre en cuatro líneas de leucemia diferentes (U937, Molt-4, Jurkat, y HL-60), que se había sometido ya sea para IR ( 10 Gy, a menos que se especifique lo contrario), o de los Estados Unidos (como exposiciones utilizando intensidades de 0,3 o 0,4 W /cm
2 duración de 1 minuto). Los resultados positivos, en términos de la cola de los cometas prolongados en comparación con los controles no irradiados, se observaron en todas las líneas celulares medidos en el período inmediatamente posterior a la exposición (t = 0) (Figura 1A). La comparación cuantitativa, en términos del momento relativa media cola de cometa (RCTM) derivada (Figura 1B) produce la siguiente tendencia en todas las líneas celulares: RTCM
0.4US & gt; RTCM
IR & gt; RTCM
0.3US, que subraya la comparabilidad de las respectivas dosis de Estados Unidos e IR elegidos para esta investigación, en términos de su facilidad para inducir niveles similares de daño en el ADN. Es interesante sin embargo, nos dimos cuenta de que el IR produce predominantemente RCTMs promedio dentro del rango de 1,1-3, mientras que las exposiciones de los Estados Unidos dan lugar a una gama más amplia de RTCM resultante, la distribución para la que fue también una función de la intensidad de los Estados Unidos (Figura 1C y Figura S1).

(A) SYBR verde-manchado colas de los cometas neutros inmediatamente después de la exposición de U937 (
T
), Jurkat (
J
), Molt-4 (
M
) y las células de los Estados Unidos (0,3 o 0,4 W HL-60 (
H
) /cm
2) o infrarrojos (10 Gy). (B) de la cola momentos relativos (
n = 100 células
, medios ± DE), normalizadas con respecto a los respectivos controles sin tratar (= 1.0). (C) la distribución heterogénea a & gt; 3,0, 1.1~3.0 y 1 (= nivel de control) significan momentos cola relativos después de Estados Unidos, pero una distribución uniforme de 1.1-3 momento de la cola relativa después de 10 Gy en ~ 90% de células U937 (
n
= 100 células). Ver Fig. S1 para otras líneas celulares. (D) imágenes Verde-fluorescentγH2AX en U937, Jurkat, Molt-4 y células HL-60 30 minutos después de 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos (imágenes de células de control no fueron mostradas, debido a ninguna célula γH2AX +). (E) La inducción de células γH2AX + como una función de la intensidad de los Estados Unidos más allá de un umbral de 0,1 a 0,2 W /cm
2 (
n
= 3, media ± s.d.). imágenes de células (F) γH2AX + y (G) histogramas FCM de γH2AX + U937 células 30 minutos después de 0,3 W /cm
2 y 10 Gy IR. Los perfiles en negro, verde y rojo son para el control, los Estados Unidos, e IR, con las IMF de células γH2AX + (5-100) γH2AX de registro). (H) Inducción /decadencia de γH2AX + células U937 (FCM) con el tiempo después de 0,3, 0,4 W /cm
2 (i) y 10 Gy IR (ii). (I) la reducción en los momentos de cola durante 3 h posteriores a 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos (i) o 10 Gy IR (ii). zVAD-fmk en 50 mmol /L se utiliza para eliminar DSBs apoptóticos.

Considerando que los análisis NCTA son considerados como DSBs, la presencia de distintos focos γH2AX puede también representar una firma definitiva para DSBs [20]. Hemos observado tales tinción γH2AX en todas las células expuestas a 10 Gy (Figura 1F), y esto es importante, en todas las líneas de células expuestas a los Estados Unidos (Figura 1D) por encima de un umbral de intensidad de alrededor de 0,1-0,2 W /cm
2 (Figura 1E y la Figura S2, S3), lo que indica, por primera vez, que la exposición de Estados Unidos podría inducir DSBs y por lo tanto presentan un riesgo genotóxico tangible.

la observación post-exposición de las células expuestas a IR se compara favorablemente con los informes anteriores [21 ] en que focos discretos + células γH2AX exhibido distribuido a través del núcleo (Figura 1F), y también que el perfil temporal posterior de la población γH2AX + exhibió un pico a los 30 minutos después de la exposición, seguida por la descomposición gradual (Figura S4). Cabe destacar que esta última reducción en el total de las poblaciones + γH2AX marcó cualitativamente con las tendencias observadas utilizando también NCTA (Figuras 1H (ii) y 1I (ii)), apoyar la reparación de DSB inducidas por IR.

En expuesta por los Estados Unidos ( insonado) las células, la fracción relativa de γH2AX + fue más pronunciado, como se confirmó mediante citometría de flujo, donde los niveles de γH2AX + fueron aproximadamente tres veces mayor en comparación con las células expuestas IR (Figura 1G). Las células afectadas también mostraron un γH2AX pan-nuclear + de distribución, con ocasionales focos pero distintas superpuestas (Figura 1F). Curiosamente, la población γH2AX + alcanzó su punto máximo a los 60 minutos después de la exposición, tanto para el 0,3 y 0,4 W /cm
2 casos estadounidenses empleados, seguido de un período de recuperación que se estabilizó después de 6 h (Figura 1H (i) y la figura S4).

Las diferencias obvias en típicos + coberturas γH2AX derivadas de células de IR y US expuestos, junto con sus distintivos distribuciones relativas de cometas cola momento (Figura 1C), y significativamente diferentes γH2AX + veces en horas pico, sugiere que su respectiva señalización DDR vías son de naturaleza diferente. Por otra parte, en los casos en los Estados Unidos se aplicó la exposición, el empleo del inhibidor pan-caspasa z-VAD-FMK para suprimir la apoptosis parece tener un efecto insignificante (Figura 1I (i) y la Figura S5), mientras inducida por TRAIL-γH2AX (mediada por la caspasa γH2AX), por ejemplo, podría ser abolida (Figura S5):. pruebas convincentes de que la pérdida de inducción y posterior al de máxima observada de γH2AX en todos los casos es probable que estuviera asociado con el daño y reparación del ADN

para investigar, se realizó co manchas de localización de γH2AX con dos quinasas principales responsables de la fosforilación de H2AX, ataxia-telangiectasia mutada (ATM) y DNA-PKcs [22]. Figs. 2A-B muestran que el grueso de fosfo-NBS1 y -ATM focos colocalizó a γH2AX focos después de que ambos
exposiciones IR estadounidense
y, lo que sugiere un reclutamiento general y coordinada de las DSB NBS1 y cajero automático para el estrés inducido por [23] , [24]. La tinción nuclear de pan-γH2AX que se produce sólo después de EE.UU. exposición puede surgir a través de la activación global ATM, tal vez a través de remodelación de la cromatina [25] en respuesta a la naturaleza de la tensión de Estados Unidos.

(A) colocalización de NBS1 distinta Ps343 focos de distinta focos γH2AX; (B) La colocalización de ATM pS1981 focos de γH2AX focos; (C) DNA-PKcs pT2609 focos en gran medida independiente de γH2AX focos. (D) US- y IR-inducidos DNA-PKcs pS2056 y focos γH2AX. EE.UU. inducidos alta fluorescentes focos peri-nuclear DNA-PKcs pS2056 (

derecha) o eran pan-nuclear con focos discretos
(izquierda)
, mientras que tanto los focos después de IR eran distintos y colocalizó. Fluorescente imágenes fueron adquiridas 30 minutos después de 0,3 W /cm
2 Estados Unidos y 3 Gy IR en las células U937.

Además, las investigaciones de tinción de los dos grupos principales de fosforilación (T2609 y S2056) a disposición DNA-PKcs (para fines de procesamiento de OSD a través de extremos no homólogos (NHEJ) [26] - [29]) revelado (Figura 2C), que los focos de ADN-PKcs-pT2609 eran en gran parte independiente de γH2AX después de exposiciones IR Estados Unidos y , el apoyo a las sugerencias anteriores de que NHEJ se produce por separado de HR recombinación homóloga [30], [31]. Por el contrario, todas las células expuestas-IR muestran discreta, co-localizada DNA-PKcs-pS2056 /γH2AX + focos nucleares (Figura 2D), también confirma informes anteriores que el ADN-PKcs complementa H2AX en respuesta a IR [22]. Curiosamente, las observaciones de los Estados Unidos indujeron γH2AX + poblaciones también mostraron regiones superpuestas de co-localización con DNA-PKcs, pero, además, una firma distinta de la no-colocalizó peri-nuclear DNA-PKcs-pS2056 (Figura 2D). Por lo tanto, la fosforilación preferencial del ADN-PKcs-pS2056 puede mediar tanto NHEJ de reparación de DSB inducidas por Estados Unidos a granel-nuclear, sino también la señal de presencia γH2AX alrededor de la periferia nuclear (véase también la figura S6). El mecanismo por el cual DNA-PKcs S2056 se distribuye alrededor de la periferia del núcleo sigue siendo poco claro, sin embargo, esta patrones de localización del DNA-PKcs S2056 pueden ser una de las respuestas celulares característicos a DSBs inducidas por Estados Unidos.

además, evaluó las funciones bioquímicas de ATM y DNA-PK aplicando los respectivos inhibidores de la quinasa farmacológica KU55993 (KU) y NU7026 (NU). Inmuno-borrones revelaron que IR provocó una mayor fosforilación de ATM que hicieron los Estados Unidos (Figura 3A), algo que refleja nuestra anterior observación NCTA (Figura 1A). Cabe destacar sin embargo, se encontró que KU, pero no NU, reduce selectivamente los niveles de fosfo-ATM después de Estados Unidos y IR (Figura 3A). Aquí, la fosforilación de la DNA-PKcs-S2056 (pS2056) fue mayor después de los Estados Unidos de IR. Como se preveía, NU inhibe la fosforilación S2056 significativamente, mientras que reduce la fosforilación KU T2609 cajero automático que dependen [26], después de Estados Unidos y del IR. Por otra parte, KU parcialmente reducido inducidos por Estados Unidos en ADN-PKcs pS2056 tanto en inmunotransferencia y la inmuno-tinción (Figura 3B, D), lo que sugiere la diafonía entre la ATM y la DNA-PKcs-S2056 de Estados Unidos en respuesta a la exposición.

(A) inmunotransferencias de extractos de células U937 30 minutos después de Estados Unidos o IR y efectos de KU y NU sobre ATM pS1981 y ADN-PKcs pS2056 /pT2609. (B) una mayor supresión de γH2AX inducida por Estados Unidos por NU que KU hasta 6 h después de Estados Unidos en las células U937 en el análisis del BM. (c) Efectos de KU y /o NU: una mayor supresión de la inducida por Estados Unidos células γH2AX + por NU que KU, y la derogación por KU-más-NU en el análisis FCM. (
n
= 3, media ± S. D.). *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001. Las células se trataron con KU y /o NU (10 mmol /L) durante 1 h antes y después de la exposición a 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos (i) o 10 Gy IR (ii). (D) DNA-PK precedida ATM para la inducción γH2AX por los Estados Unidos: un papel preferencial de DNA-PK en la inducción γH2AX se determinó por inmunotinción. Las células se trataron como Fig. 4C. ATM pS1981 (AT), DNA-PKcs pS2056 (PK), y células negativas γH2AX (H2) positivos /se contaron al menos 100 células en cada experimento. Los datos muestran las medias de 2 experimentos independientes.

Dado que Estados Unidos parece activar la DNA-PK en lugar de ATM, tal vez no sea sorprendente que NU fue más eficaz en la reducción de la proteína inducida por γH2AX de EE.UU. niveles que era KU (como se ilustra para el caso de células U937 (Figura 3B), y en las otras líneas celulares ensayadas (Figura S7)) observación -an que fue reforzada aún más por el flujo complementario citometría de mediciones (Figura 3C y Figura S8), que también demostró la inhibición completa cuando se utiliza una combinación KU /NU (Figura 3C (i)). Tales inhibiciones farmacológicos también fueron confirmados por inmuno-tinción y se reproducen en todas las células (Figuras Figue 3D y S7, S9). La dependencia de la DNA-PKcs en la fosforilación de H2AX inducida por Estados Unidos también se confirmó mediante la comparación de los EE.UU.-respuesta de las líneas celulares de glioblastoma defectuosos DNA-PKcs (M059J) con la de sus líneas celulares parentales (M059K) (Figura S10). En resumen, estos resultados apoyan fuertemente un papel preferencial para DNA-PKcs sobre ATM, posiblemente sin la participación de ATR, en la señalización temprana de DSBs inducidas por Estados Unidos para γH2AX, pero con el sentido directamente opuesto de la señalización de DSBs inducidas-IR (Figura 3A, C) como se ha demostrado anteriormente [22].

por último, hemos querido explorar el mecanismo físico-químico en bio-efectos inducidos de Estados Unidos con estudios posteriores de la hipótesis de que sonoquímica juega un papel dominante. A continuación, se evaluó la relación entre inducidas por Estados Unidos • OH radicales e inducción OSD. Se encontró que el US-OH • indujo niveles (DMPO-OH aductos) en la solución DMPO aeróbico incrementado en un intensidad-, y la exposición tiempo-, de forma dependiente (Figura 4A), donde las tasas de inducción de 1 y 2 DMPO-OH aductos por 0,3 y 0,4 W /cm
2 /min, respectivamente, fueron de un orden de magnitud menor que los 30 productos de adición por 10 Gy (Figura 4A) la observada para el caso de la exposición IR. Por lo tanto, el extracelular OH • nivel post-Estados Unidos fue inferior al 10% de la que se produce después de la IR, a pesar de que las dosis comparables se aplicaron (en términos de su potencial para generar daño en el ADN (
a saber
Figura 1A). inducidas por Estados Unidos OH • niveles por otra parte, además de los captadores de radicales DMSO y NAC en concentraciones respectivamente de alta o baja a la solución DMPO, ya sea abolida o parcialmente reducido (Figura 4A; ver leyenda, y métodos para más detalles). a continuación, se determinó la intracelular de OH • niveles inmediatamente después de los Estados Unidos utilizando una fluoresceína hidroxifenil (HPF) de ensayo [32]. en este caso, la intensidad media de fluorescencia (MFI) de un flujo desplazado citometría de histograma fue de 1,57 ± 0,07 inmediatamente después de la exposición a 0,3 W /cm
2 (Figura 4B), por lo tanto, los niveles bajos de ambos extra e intra-celular OH • surge en respuesta a los Estados Unidos no puede explicar completamente la inducción de los EEUU de las DSB. por otra parte, ninguno de los captadores de radicales era eficaz en la supresión γH2AX inducida por Estados Unidos (Figura 4C). Por el contrario, N
2O gas, que es conocido para suprimir la cavitación inercial de US [3], anulado por completo la inducción de DMPO-OH aductos, γH2AX + células y la muerte celular (Figura 4D-F ). Estas observaciones tomadas en su totalidad nos obligan a la conclusión de que los Estados Unidos mediada por estrés mecánico, en lugar de cualquier actividad de los radicales generados sonochemically, genera las DSB genómicos.

(A) Detección del EPR US- o IR inducida por extra- e los niveles intracelulares de OH • como aductos DMPO-OH (ver Métodos); Aumento de los niveles de OH • en solución DMPO (10 mmol /L) como una función del tiempo insonación en 0.3 (

izquierda) y 0,4 (
medio
) W /cm
2 de EE.UU. o en dosis de 5-20 Gy IR (
derecho, cerrado círculo
). La inducción de DMPO-OH aductos de 0,3 o 0,4 W /cm
2 fueron reducidas parcialmente por 50 mmol /L de DMSO (
triángulo hacia arriba
) o 5 mmol /L NAC (
triángulo hacia abajo
), y anulado por una 10 veces mayores concentraciones: 50 mmol /L o NAC 500 mmol /L de DMSO (
cerró diamante
para ambos). Los recuadros muestran amplitudes de las señales EPR de DMPO-OH. (B) Ensayo de HPF a base de FCM para intracelulares OH • niveles inmediatamente después de 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos en células U937. El cambio hacia el histograma de fluorescencia de alta HPF por OH • oxidación era pequeña, y por lo tanto, un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) fue de 1,57 ± 0,07 veces el control (
n
= 3, media ± DE), con protección parcial por el pretratamiento con 5 mmol /L NAC durante 3 h antes de la sonicación. (C) No hay efectos protectores de 5 mmol /DMSO L o 5 mmol /L NAC (basureros) añadida a los cultivos inmediatamente antes de 0,3 y 0,4 W /cm
2 de Estados Unidos, o de otro tipo 3 h-tratamiento previo con 5 mmol /L NAC (NAC-pre) en contra de la inducción de células U937 γH2AX + 30 min post-estadounidenses. (
n
= 3, media ± S. D.
ns
medios
no es significativo
). (D-F) Saturado N
2O de gas causó la abrogación de eventos inducidos por Estados Unidos de la siguiente manera: (D) Los Estados Unidos de exposición en tiempo de inducción depende de OH • en solución DMPO 10 mmol /l en el 0,3 y 0,4 W /cm
2 (
n
= 3, media ± DE). (E) La inducción de células U937 γH2AX + 30 minutos después de 0,3 y 0,4 W /cm
2 (
n
= 3, media ± S. D.). : (F) 20% de células no viables (azul de tripano colorante prueba de exclusión) y la pérdida de 30% en los recuentos de células en relación con el control de células U937 6 h después de 0,3 o 0,4 W /cm
2 de Estados Unidos (
n
= 3, media ± dE).

a continuación, hemos demostrado por primera vez que la acción mecánica de los Estados Unidos utilizando intensidades de nivel intermedio puede inducir DSB, que se anuncian por la presencia de cola de cometa neutra y γH2AX focos entre un γH2AX pan-nuclear manta con peri-nuclear DNA-PKcs S2056. Además, los presentes intensidades de los Estados Unidos de 0,3 y 0,4 W /cm
2, que dieron lugar a 0.132 y 0.144 presiones MPa picos acústicos, respectivamente [16], están fuera del rango diagnóstico de Estados Unidos (& lt; 0,1 MPa) [1 ] y se confirmó que Estados Unidos en 0,1 W /cm
2 (0,082 MPa) no pudo inducir DSBs (Fig. 1E). Estos resultados enfatizan la seguridad de diagnóstico de Estados Unidos, sobre todo si se tienen en cuenta los tres puntos siguientes: (i) los pulsos muy cortos (un par de microsegundos) que se utilizan en el diagnóstico, (ii) Las ondas es poco probable que se produzca en
In vivo
exposiciones, y (iii) la atenuación de las ondas acústicas en el cuerpo humano. En conclusión, esperamos que estas nuevas y convincentes observaciones proporcionarán no sólo una base biofísica y bioquímica sólida para entender el potencial genotóxico de los Estados Unidos, sino también guía de traducción futuro en términos de límites de seguridad.

Materiales y Métodos

Química y células

El NU7026 inhibidor de la DNA-PK y ATM inhibidor KU55933 se adquirieron de Calbiochem (Cambridge, Reino Unido). líneas celulares de leucemia humana U937, Molt-4, y Jurkat-T se obtuvieron comercialmente (Japanese Collection de Recursos Biológicos de investigación (JCRB) Cell BANK [32]. HL-60 también se obtuvo de JCRB Cell Bank (IFO50022). Las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% TRAIL recombinante /Apo2L era de PeproTech (Londres, Reino Unido);. un inhibidor de pan-caspasa zval-Ala-DL-Asp-fluorometil cetona (zVAD-fmk) era de Peptide Institute (Osaka, Japón);
N
-acetil-L-cisteína (NAC) y yoduro de propidio (PI) fueron de Wako Pure Chemical (Tokio, Japón); 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) y 5,5-desmetil-1-pyrroline-
N-óxido
(DMPO) eran de Dojindo (Kumamoto, Japón).

La sonicación y la irradiación

baja intensidad- pulsado de Estados Unidos con 100 Hz de frecuencia de repetición de impulsos fijo y el factor de trabajo del 10% (designado en adelante como los Estados Unidos) se generó utilizando un 1,0 MHz configuración acústica [16], [33]. en los experimentos de insonación, un ml-alícuota 2 a una densidad fija de 1 × 10
6 células /ml en una placa de cultivo de polietileno de 35 mm (Corning, NY) se sometió a sonicación en 0,1 a 0,4 W /cm
2 (intensidades indicadas-idear) para 1 min. Estos cuatro intensidades correspondían a 0.061, 0.105, 0.132 y 0.144 presiones acústicas de pico MPa, respectivamente [16]. Un aumento de la temperatura del medio durante insonación estaba por debajo de 1 ° C [16]. Para el tratamiento IR, las células se irradiaron con 3 Gy (para producir IRIFs discretas) o 10 Gy (una dosis cercana a la isoefecto para colas de los cometas neutros inducida por 0,3 y 0,4 W /cm
2) a una tasa de dosis de 5 Gy /min utilizando una unidad Modelo MBR-1520R-3 de rayos X (Hitachi Medico Tecnología, Kashiwa, Japón).

Neutro ensayo cometa

Neutral colas de los cometas (DSB) se evaluaron en expuestos por los Estados Unidos células por medio de una unidad de equipo de ensayo y electroforesis Comet (Trevigen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al menos 50 células por muestras se analizaron usando un software Comet Assay IV (Leica Microsystems). El momento de la cola relativa fue dada por la relación de los momentos en cola de cometa (media ± DE) de las células tratadas con los de los controles (ratio = 1,0).

La inmunodetección

Para las imágenes de inmunofluorescencia, paraformaldehyde- control fijo y las células tratadas se permeabilizaron /bloqueado con 2% de BSA /0,05% de Triton X-100 /solución salina tamponada con Tris, y se inmunotiñeron para 2 h con el anticuerpo monoclonal primario (mAb): anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Milipore) , 1:400 o anti-ATM pS1981, 1:250 (Upstate Biotechnology) o el anticuerpo policlonal primario (pAb), anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Active Motif), 1:500, anti-NBS1 Ps343, 1:1000 (Novus Biologicals), o anti-DNA-PKcs pT2609 o pS2056, 1:250 o 1:600 ​​(Abcam), respectivamente. Luego, las células se tiñeron para 1,5 h con el anticuerpo secundario: Alexa Fluor 488 anti-ratón F (ab ') o IgG Alexa Fluor 555 anti-conejo F (ab') IgG (Cell Signaling Technology), 1:400. Por último, los núcleos se contratiñeron con 2 g /ml DAPI, y las muestras fueron montadas en Antifade ™ (Molecular Probes). Fluorescente imágenes se adquirieron usando un microscopio de fluorescencia BX-50 (Olympus Optics).

Para la citometría de flujo (FCM), las células se fijaron con 70% de metanol frío durante la noche, después se bloquearon con 2% de BSA /0,05% de Triton X-100 /solución salina tamponada con Tris y se hizo reaccionar con γH2AX mAb /Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratón (1:400) para teñir γH2AX + células, seguido de incubación con 1 mg /ml de RNasa a y 50 mg /ml PI para la asignación de γH2AX + células a cada una de las fases del ciclo celular basados ​​en IP. Las muestras fueron finalmente se ejecutan en un flujo Epics XL (Beckman Coulter).

Para el análisis de inmunotransferencia, extractos de células enteras se prepararon en tampón de lisis RIPA que contiene ortovanadato de sodio y cóctel de inhibidores de la proteasa (Nacalai Tesque). moléculas de alto peso molecular de ATM y DNA-PKcs se separaron en 5% prefabricados de geles SDS-PAGE, mientras que otras proteínas de menor peso molecular se separaron en 15% prefabricados de geles de SDS-PAGE. Después de la transferencia, las proteínas en las membranas Immobilon-P (Millipore) eran oeste-borrado mediante el uso de los anticuerpos primarios: γH2AX mAb, ATM Pab (Santacruz), ATM pS1981 mAb (Epitomics), DNA-PKcs Pab (Epitomics), DNA-PKcs pS2056 pAb, DNA-PKcs pT2609 mAb, caspasa 3 pAb (señalización de la célula) o GAPDH mAb (referencia de carga, Organon Teknika), y los anti-ratón o anti-conejo IgG conjugado con HRP secundaria (señalización celular). los niveles de expresión de proteínas se visualizaron por un aumento de quimioluminiscencia (ECL) sistema de detección (Nacalai Tesque), y las imágenes fueron adquiridas mediante un analizador de imágenes luminiscentes LAS-4000 (Fuji Film).

Detección de extra e intra-celular ROS

los niveles de usuarios, o bien IR inducida OH • en los fluidos extracelulares fueron cuantificados por la resonancia paramagnética electrónica (EPR) método de captura spin-[3], [16]. Para estos, de 2 ml de alícuotas de DMPO 10 mM se dispensaron en placas de 35 mm y se expusieron a 0,3 y 0,4 W /cm
2 durante 1 a 5 min o a dosis graduadas IR (5-20 Gy), seguido de la detección inmediata de señales de aductos DMPO-OH utilizando un RFR-30 EPR espectrómetro (Radical Research). aductos DMPO-OH (OH •) se expresaron como cantidades relativas a una referencia interna (Mn
2 +). Para detectar intracelular OH •, se utilizó permeable a las células hidroxifenil fluoresceína (HPF) (Sekisui Médica), que detecta principalmente OH • y marginalmente ONOO
- (~ 1/10 la cantidad de OH •) [31]. Las células se cargaron con 5 nM HPF durante 15 minutos a 37 ° C, y se expusieron a 0,3 W /cm
2, seguido por el análisis FCM inmediata de intracelular inducida por Estados Unidos • OH. La media de intensidad de fluorescencia (IMF) de la sonda oxidado se cuantificó para evaluar su aumento veces sobre el control.

Estadísticas

Los datos se presentan como media ± S. D. La significación estadística entre dos conjuntos de datos se analizaron mediante
t-test
con Microsoft Excel 2007.

Apoyo a la Información de Student para datos independientes
Figura S1.
ensayo para colas de los cometas neutros en Jurkat, Molt-4 y células HL-60 inmediatamente después de 0,4 W cm
2 de Estados Unidos reveló la desigual distribución más amplia de 25-30, 35-50 y 10-23% /% de células a los rangos de & gt; 3, 1.1-3, y 1 momentos de cola relativos, respectivamente, en comparación con una distribución bastante uniforme de las células de la mayoría 80 a 90% a un rango menor de 1.1-3 momentos relativos después de 10 Gy IR. Relativa momento de la cola de 1,0 representa ninguna DSBs inducidas como en las células de control. Después de 0,3 W /cm
2, de manera similar, 10-25, 30-40% y ~ 50% de células incurridos & gt; 3, 1,1 a 3 y 1 (sin DSBs) momentos de la cola relativos, respectivamente. Estos resultados recapitulan los resultados en células U937 (figura 1A, C.)
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s001 gratis (PDF)
figura S2.
imágenes de fluorescencia mostraron patrón γH2AX pan-nuclear de células 30 minutos después de 0,4 W /cm
2 de Estados Unidos, pero no hay γH2AX + células después de 0,1 W /cm
2 en U937. Las células con 10 Gy de IR se utilizaron como control positivo para la tinción γH2AX
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s002 gratis (PDF)
Figura S3.
imágenes de fluorescencia de γH2AX en U937, Jurkat, Molt-4 y células HL-60 sin US- o IR-exposición. datos cuantificados se muestran en la Fig. 1E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s003 gratis (PDF)
figura S4. histogramas
Representante FCM mostraron la inducción y el declive de γH2AX + células U937 con el tiempo hasta 6 horas después de 0,3 o 0,4 W /cm
2 (1 min) de Estados Unidos o 10 Gy IR. El cambio de horario platos en células γH2AX + después de Estados Unidos o del IR (Fig. 1 h) procedían de fluorescencia media de los histogramas (sombreado). Nota máximas + fracciones γH2AX a 0,5 o 1 h, seguido por sus descensos más tarde, con algunas γH2AX persistentes + fracciones alrededor de 6 h post-estrés
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s004 gratis (PDF)
Figura S5. Las diferentes respuestas
H2AX a los Estados Unidos y la muerte-receptor de TRAIL ligando en U937, Jurkat, Molt-4 y células HL-60. (A) aumenta dependientes del tiempo en la expresión de la proteína p17 y γH2AX /p19 formas activas de la caspasa-3 troceados, un marcador de apoptosis esencial, después de la adición de 0,1 mg /ml de TRAIL. (B) zVAD- supresora de la caspasa-3 división en U937, Jurkat, Motl-4 y HL-60 células: la inhibición de la caspasa-3 división mediante tratamiento con zVAD- FMK durante 6 horas después de 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos ( superior) o 3 horas después de TRAIL (parte inferior). Z-VAD FMK fueron pretratados 1 h antes para tratamiento de TRAIL. (C) inducida por TRAIL, apoptótica DSB-impulsados ​​células γH2AX + pero no impulsado por el propio OSD γH2AX + células principios de los 30 minutos después de 0,3 W /cm
2 de Estados Unidos, fueron abrogadas por el tratamiento de todas las líneas celulares con 100 mmol /L zVAD- FMK . El color azul con DAPI se cambió a rojo para la visualización fácil amarilla en la combinación de la imagen verde con γH2AX mediante el uso de Adobe Photoshop Elements 2.0. (Adobe Systems)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s005 gratis (PDF)
Figura S6.
Inmunofluorescencia análisis de IR inducida por Estados Unidos y DNA-PKcs pS2056 y focos γH2AX. Pan-nuclear γH2AX focos verde y rojo altamente focos fluorescentes de ADN-PKcs pS2056 después de Estados Unidos, pero bajo fluorescente distinta γH2AX y focos de ADN-PKcs pS2056 después de IR. Las flechas rojas indican con células peri-nucleares DNA-PKcs pS2056 focos observada en las células sonicadas, pero no en las células irradiadas. imágenes ampliadas estaban en la Fig. 2D
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s006 gratis (PDF)
Figura S7.
análisis de Western blot que muestra los efectos de Ku55933 (KU) y /o Nu7026 (NU) en γH2AX 1 h después de Estados Unidos en Jurkat, Molt-4 y células HL-60. Las células fueron pretratadas con 10 mmol /l de KU y /o NU 1 h antes de EE.UU.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s007 gratis (PDF)
Figura S8.
histogramas FCM típicos que muestran γH2AX inducida por Estados Unidos en la presencia o ausencia de Ku55933 (KU) y /o Nu7026 (NU). Las distribuciones de fase del ciclo celular se determinaron mediante tinción con yoduro de propidio. Tenga en cuenta que la inducida por Estados Unidos γH2AX no se limita en la fase S y efectos supresores de KU y /o NU sobre γH2AX fueron identificados a lo largo de las fases del ciclo celular
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s008 gratis (PDF )
Figura S9.
imágenes típicas que muestran γH2AX inducida por Estados Unidos, fosfo-cajero automático en S1981, fosfo-DNA-PKcs en S2056 en la presencia o ausencia de Ku55933 (KU) y /o Nu7026 (NU). El efecto de KU o NU sobre la expresión de estas proteínas se cuantificó como en la Fig. 4D
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s009 gratis (PDF)
Figura S10.
histogramas típicos FCM demostrar US-inducidos en las células γH2AX M059K dominio del ADN-PKcs, pero no en las células deficientes M059J ADN-PKcs. Estas líneas de células adherentes se resuspendieron por tripsinización y luego por ultrasonidos a 0,4 W /cm
2 durante 60 segundos en el medio de cultivo. Las células se recogieron en tubos de plástico inmediatamente después de la sonicación a continuación, se incubaron durante 30 min seguido de la fijación.

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