Extracto
Antecedentes
La evidencia reciente de
in vitro y Hoteles en
in vivo
estudios ha demostrado que la reactivación aberrante de la proteína Sonic Hedgehog (SHH) vía de señalización regula los genes que promueven la proliferación celular en diferentes células madre de cáncer humano (CSC). Por lo tanto, los agentes quimioterapéuticos que inhiben la activación de factores de transcripción Gli han surgido nuevos fármacos terapéuticos como prometedores para el cáncer de páncreas. GDC-0449 (Vismodegib), molécula administrable por vía oral que pertenece a la clase 2-arilpiridina, inhibe la vía de señalización de SHH mediante el bloqueo de las actividades de Smoothened. Los objetivos de este estudio fueron examinar los mecanismos moleculares por los cuales GDC-0449 regula las características CSC pancreáticos humanos
in vitro
.
Metodología /Principales conclusiones
GDC-0499 inhibieron la viabilidad celular y la apoptosis inducida en tres líneas celulares de cáncer de páncreas y células madre cancerosas pancreáticas. Este inhibidor también suprimió la viabilidad celular, la unión Gli-DNA y las actividades de la transcripción, y la apoptosis inducida a través de la caspasa-3 de activación y escisión de PARP en células madre cancerosas pancreáticas. GDC-0449-inducida por la apoptosis en células madre cancerosas mostró un incremento en la expresión de Fas y la disminución de la expresión del PDGFR. Por otra parte, Bcl-2 se redujo reguladas mientras que TRAIL-R1 /DR4 y la expresión de TRAIL-R2 /DR5 se incrementó después del tratamiento de células madre cancerosas con GDC-0449. La supresión de ambos Gli1 más Gli2 por shRNA imitaba los cambios en la viabilidad celular, la formación de esferoides, la apoptosis y la expresión génica observada en células madre cancerosas de páncreas tratados con GDC-0449. Por lo tanto, los genes activados Gli reprimir la DRS y de Fas expresiones, hasta de regular la expresión de Bcl-2 y PDGFR y facilitar la supervivencia celular.
Conclusiones /Importancia
Estos datos sugieren que la GDC-0499 puede ser utilizado para el tratamiento de cáncer de páncreas en la orientación células madre cancerosas pancreáticas
Visto:. BN Singh, Fu J, RK Srivastava, Shankar S (2011) de señalización Hedgehog Antagonista GDC-0449 (vismodegib) inhibe el cáncer de páncreas Características de células madre : Mecanismos moleculares. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10.1371 /journal.pone.0027306
Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Septiembre 2011; Aceptado: October 13, 2011; Publicado: 8 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) es un tumor maligno altamente letal. caracterizado por el diagnóstico tardío y la resistencia al tratamiento. PC es la cuarta causa principal de cáncer en los Estados Unidos, con una supervivencia a 5 años inferior al 5%. La resección quirúrgica es la única opción terapéutica potencialmente curativa para PC; Sin embargo, debido a la falta de los primeros síntomas, la gran mayoría de los pacientes presentan enfermedad metastásica, haciendo que su tumor maligno inoperable [1], [2]. La terapia actual estándar de atención, gemcitabina, se extiende la supervivencia del paciente por sólo unas pocas semanas [3]. La identificación de nuevas dianas moleculares para PC para superar el mal pronóstico, por lo tanto es necesario. alteraciones genéticas recurrentes en los genes definidos en asociación con perturbaciones de vías de señalización celular en el desarrollo se han asociado con el desarrollo y la progresión de PC. La evidencia reciente de
in vitro y Hoteles en
in vivo
estudios sugiere que el Sonic Hedgehog (SHH) vía [4] se reactivó de manera aberrante y reconocido como uno de los mediadores en la mayoría de los PC de señalización; Por lo tanto, el bloqueo de SHH tiene el potencial de prevenir la progresión de la enfermedad y la diseminación metastásica [5].
señalización de SHH se inicia por la unión del ligando de acción corta polipéptido saber Shh (Sonic Hedgehog, Indian Hedgehog o Desert Hedgehog) a su receptor, Patched que de ese modo, disminuye los efectos inhibidores de Patched en Smoothened [6]. Smoothened se localiza entonces en el cilio primario de la célula, un orgánulo que juega un papel crítico en la señalización de SHH [7]. Allí, Smoothened activa una cascada intracelular que resulta en la activación y translocación nuclear del factor de transcripción de la familia Gli Gli2 [8]. Gli2 se transloca en el núcleo e induce la transcripción de genes diana SHH, tales como Gli1, un marcador fiable de la señalización de SHH [8], [9]. Gli2 es un componente crítico de la señalización de SHH y su inactivación conduce a una inhibición de la señalización de SHH. Estos factores de transcripción Gli encienden genes en el núcleo que promueven la proliferación celular, la supervivencia celular, stemness, y la determinación del destino celular en una variedad de órganos [5], [10]. vía SHH es un morfógeno requerido para la formación de patrones adecuada durante la embriogénesis; sin embargo, la desregulación de esta ruta es responsable de varios cánceres humanos [8], [10], [11]. La evidencia reciente indica que SHH vía de señalización a nivel de los genes Gli tiene un papel crítico en el desarrollo del páncreas normal y no hay pruebas de que desregula la señalización de Shh juega algún papel en el cáncer de páncreas [12]. Por otra parte, varios informes indican que los cánceres pancreáticos humanos por encima de los genes Gli expreso [13], [14].
Los factores de transcripción de la familia Gli tienen una doble función como activador y represor que se definen sólo parcialmente y pueden responder a Gli actividad combinatoria y cooperativo. La familia Gli juega un papel crítico en la mediación y la interpretación de las señales de SHH [15]. cánceres impulsados por SHH surgen de una variedad de mutaciones que afectan a diferentes componentes, incluyendo el efector transcripcional proteínas clave Gli, conduce a una variedad de tumores malignos humanos, incluyendo meduloblastoma, rabdomiosarcoma, melanoma, carcinoma de células basales, y de mama, pulmón, hígado, estómago, próstata y cáncer de páncreas [16], [17], [18], [19], [20]. Constitutivamente, la señalización de SHH-Gli es activa en células basales carcinomas, meduloblastomas y los cánceres de esófago, debido a la mutación en Patched o Smoothened [21], [22]. Melanomas y carcinomas de próstata han demostrado además un eje SHH-Gli señalización [23]. En los cánceres gastrointestinales, la activación de señalización de SHH se produce a través de la transcripción hasta la regulación del ligando SHH [24]. Recientemente se ha sugerido que la señalización de SHH progresa durante la carcinogénesis de colon [25], [26] y en la enfermedad metastásica [27], mientras que en el tejido normal de colon, la señalización de SHH está implicada en la diferenciación [28]. Recientemente, los genes se han perfilado que son regulados aguas abajo de Gli1 y Gli2 que están involucrados en la proliferación celular y el ciclo celular [29], [30], y la supervivencia celular (PDGFRa y Bcl-2) [22]. Gli2 también se expresa en muchos carcinomas de células basales [31], lo que sugiere que estos genes también pueden estar involucrados en el desarrollo de PC, lo que podría ser consistente con su acción parcial como mediador de las señales de SHH [32]. Sin embargo, las funciones de los genes Gli (Gli1 y gli2) en la supervivencia y la muerte celular respuestas celulares SHH impulsada permanecen mal definidos, y en concreto, de su papel en la proliferación celular y la supervivencia de las células madre cancerosas de páncreas es desconocida y los los genes diana implicados en la determinación del destino celular.
Mucha atención se ha centrado recientemente en el papel de las células madre del cáncer (CSC) /cáncer de células iniciadoras (AIC) en la iniciación y progresión de tumores sólidos. CSC puede ser responsable de la aparición del tumor, auto-renovación /mantenimiento, la acumulación de mutaciones, y metástasis debido a su capacidad para expresar proteínas resistentes anti-apoptóticas y de drogas, sosteniendo así el crecimiento del tumor [33], [34]. La vía de señalización de SHH es un regulador clave de los procesos celulares fisiológicos que incluyen la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [35]. Estudios recientes indican que el sistema de señalización de SHH desempeña un papel clave también en la biología incluyendo CSC en la regulación de células madre cancerosas auto-renovación, la diferenciación; y el potencial tumorigénico, lo que sugiere la señalización de SHH podría ser un objetivo terapéutico prometedor en PCs [14]. La activación de la señalización de SHH puede abrogar la resistencia de células madre cancerosas a la quimioterapia y podría conducir al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de los PC.
Para identificar los objetivos de abajo de los genes Gli que regulan la proliferación celular y la supervivencia en el cáncer de páncreas células madre (CSC), se empleó un inhibidor de la señalización de SHH, GDC-0449 (inhibidor de alisado), que se ha identificado en una pantalla de molécula pequeña basado en células de inhibidores de Gli mediada por la familia de la transcripción [36]. GDC-0449 actúa como un potente inhibidor de la Smoothened y muestra un alto grado de selectividad para la señalización de SHH-Gli [36]. En células madre cancerosas pancreáticas humanas, puso de manifiesto la inhibición de la vía de señalización de SHH por la orientación de los factores de transcripción Gli. GDC-0449 indujo muerte celular significativa en tres líneas celulares de cáncer de páncreas (ASPC-1, PANC-1 y MIA PaCa-2) y células madre cancerosas pancreáticas. En los análisis más detallados de las células madre cancerosas pancreáticas, GDC-0449 disminuyó componentes de la señalización de Shh (Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, SHH y Smoothened) expresión, unión Gli-ADN y actividades reportero Gli-luciferasa. Además, desmontables de ambas expresiones Gli1 y gli2 utilizando shRNA confiere resistencia a la citotoxicidad inducida por el GDC-0499. Además, GDC-0449 disminuyó la expresión de PDGFR concomitante con niveles elevados de Fas, el aumento de la expresión de TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5, disminución de Bcl-2 expresión, y se indujo la actividad de caspasa-3 y la escisión de PARP. Los cambios inducidos por la GDC-0449 en la expresión génica y la apoptosis fueron bloqueados por Gli1 más Gli2 shRNA, señalando así un papel de Gli para la proliferación celular y la supervivencia en células madre cancerosas pancreáticas humanas. Estos datos sugieren que GDC-0449 suprime la proliferación de páncreas células madre cancerosas y la supervivencia mediante la inhibición de la vía de señalización de SHH en el nivel de genes Gli.
Resultados
SHH vía de señalización componentes se expresan en líneas celulares de cáncer de páncreas humano y células madre cancerosas pancreáticas
primero mide la expresión de varios componentes de la vía de SHH en el cáncer de páncreas humano AsPC-1, PANC-1, y las líneas celulares MIA-PaCa-2 y células madre cancerosas pancreáticas por RT-PCR (Fig. 1). Los datos demuestran que los componentes de la vía de señalización de SHH, incluyendo el ligando (Shh), las moléculas de señalización (Patched-1, Patched-2 y Smoothened) y los efectores (Gli1, y Gli2) se expresan en líneas celulares de cáncer de páncreas humano y de páncreas Los CSC. Estos datos sugieren que la vía SHH está intacto en líneas celulares de cáncer de páncreas y células madre cancerosas, y apoya el concepto de que la unión del ligando Shh al receptor de Patched disminuye sus efectos inhibidores sobre la Smoothened, lo que permite la transducción de señales que resultará en la activación y translocación nuclear de factores de transcripción Gli familia [13], [37].
cáncer de páncreas células (AsPC-1, PANC-1 y MIA Paca-2) y células madre cancerosas pancreáticas se cultivaron durante 48 h. ARN total fue aislado y la expresión de Shh, Patched-1, Patched-2, alisado, Gli-Gli-1 y 2 se midió mediante qRT-PCR. HK-GAPD se utilizó como control endógeno normalización. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. El cambio n veces en la expresión ARNm se determinó de acuerdo con el método de 2
-ΔΔCT con GAPDH empleado como control endógeno.
GDC-0449 reduce la viabilidad celular e induce la apoptosis en pancreática humana líneas celulares de cáncer de páncreas y células madre cancerosas
Los estudios clínicos previos han sugerido que la GDC-0449 es un inhibidor de molécula pequeña de Smoothened. En primer lugar, tratamos de examinar los efectos de la GDC-0499 sobre la viabilidad celular y la apoptosis en el panel de tres líneas celulares de cáncer de páncreas humanos y células madre cancerosas pancreáticas. Se observó una inhibición de la supervivencia celular y la inducción de apoptosis dentro de 24 h después de la exposición a este medicamento (datos no presentados), pero se observó al máximo a las 72 h (Figs. 2 y 3). En todas las líneas celulares, inducida GDC-0449 apoptosis es una forma dependiente de la dosis que llega hasta un 65%. En comparación, la GDC-0449 fue menos eficaz en la inducción de la apoptosis en las células madre cancerosas (Fig. 3). Para más estudios sobre el mecanismo que hemos utilizado células madre cancerosas pancreáticas.
Las células fueron tratadas con GDC-0449 (0, 1, 5 y 10 mM) durante 48 y 72 h. Al final del período de incubación, la viabilidad celular se midió por XTT en (A) AsPC-1, (B) MIA PaCa-2, (C) PANC-1, y (D) células madre cancerosas pancreáticas. Los datos representan la media ± SD. @ O#significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05)
Las células fueron tratadas con GDC-0449 (0, 1, 5 y 10 mM) para 48 y 72 h.. Al final del periodo de incubación, se recogieron las células y se midió la apoptosis. Los datos representan la media ± SD. @ O#significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05).
GDC-0449 regula objetivos de abajo de la vía SHH, inhibe la interacción Gli-ADN, la actividad de transcripción Gli y disminuye Gli translocación nuclear en células madre cancerosas pancreáticas
a continuación examinó el efecto de la GDC-0449 sobre la expresión de Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, Bcl-2, caspasa-3, y PDGFR por el Western blot (Fig. 4). GDC-0449 indujo la expresión de Fas, DR4, DR5 y e inhibió la expresión de Bcl-2 y PDGFR en células madre cancerosas pancreáticas. Además, GDC-0449 induce la escisión de la caspasa-3 y PARP en células madre cancerosas pancreáticas, en correlación con la extensión de la supervivencia celular y la apoptosis.
CSC pancreáticas fueron tratados con GDC-0449 (0, 1, 5 y 10 M) durante 48 h. La expresión de Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, la escisión de PARP, Bcl-2, y la caspasa-3 por el análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga.
A continuación trató de examinar los efectos de la GDC-0449 en la vía SHH mediante la medición de la expresión de receptores SHH (Patched-1, Patched-2 y alisado ) y los efectores (Gli1 y gli2) por QRT-PCR (Fig. 5A). GDC-0449 inhibe la expresión de alisado, Patched-1, y Patched-2. Del mismo modo, GDC-0449 inhibe la expresión del factor de transcripción Gli1 y Gli2. Estos datos sugieren que la GDC-0449 puede regular características CSC mediante la inhibición de diversos componentes de la vía SHH.
. (A), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con GDC-0449 (10 M) durante 36 h. Al final del periodo de incubación, se extrajo el ARN y la expresión de Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, smoothened y Shh se midió mediante qRT-PCR. Los datos representan la media ± SD. @ Significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (B), células madre cancerosas pancreáticas se trataron con y GDC-0449 (0, 1, 5 y 10 mM) durante 48 h. Se prepararon extractos nucleares y se realizó el experimento gelshift. Sonda solamente, control (sin GDC-0449) muestras, y se trató GDC-0449 (1, 5 y 10 mM), respectivamente. Los datos son representativos de tres experimentos. (C), la actividad luciferasa Gli-dependiente se reduce en GDC-0499. Células madre cancerosas pancreáticas fueron transducidas con el constructo lentiviral que expresa indicador de luciferasa Gli-dependiente, y tratados con GDC-0449 (0, 5 y 10 mM) durante 48 h. Se prepararon lisados, y se midió la actividad de luciferasa. la actividad luciferasa normalizada se presentan como media ± desviación estándar. @ O#significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (D), GDC-0449 inhibe la expresión de Gli1 y Gli2 en células madre cancerosas pancreáticas humanas. Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos de fibronectina y se trataron con GDC-0449 (10 mM) durante 48 h. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se bloquearon en suero de cabra normal al 10% y se tiñeron con Gli1 y GLI2 anticuerpos primarios (1:100) para 16 horas a 4 ° C y se lavó con PBS. Después, las células se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1:200) junto con DAPI (1 mg /ml) durante 1 h a temperatura ambiente y las células se montaron y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. Para una mejor visualidad, el color de DAPI se cambió de azul a rojo.
Desde Gli media los efectos de Shh, el próximo examinado la interacción Gli-ADN mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) en humanos células madre cancerosas pancreáticas. El tratamiento de células madre cancerosas con GDC-0449 dio lugar a disminución de la actividad de unión Gli-ADN de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5B).
A continuación examinó el efecto de la GDC-0449 sobre la actividad transcripcional Gli (Fig. 5C ). La exposición de las células madre cancerosas con GDC-0449 durante 36 h dio como resultado la inhibición de la actividad de informador de luciferasa Gli dependiente de una manera dependiente de la dosis. GDC-0449 inhibe la expresión de Patched-1 y Patched-2, ya que son objetivos de abajo Gli. A continuación empleó la técnica de inmunofluorescencia para examinar los efectos de la GDC-0449 sobre la expresión nuclear de Gli (Fig. 5D). CSC pancreáticas fueron tratados con GDC-0449, y la expresión nuclear de Gli1 y se observó Gli2. GDC-0449 inhibe la expresión nuclear de Gli1 y Gli2. En general, estos datos sugieren que GDC-0449 puede inhibir ADN Gli unión y la actividad transcripcional.
CSC pancreáticos humanos requieren función Gli activo para la expresión sostenida de los genes implicados en la supervivencia y la proliferación celular
En para examinar los efectos de Gli1 y Gli2 sobre la proliferación celular, la apoptosis y corriente abajo objetivos, que inhibe la expresión de Gli1 y GLI2 factores de transcripción por shRNA. Como se muestra en la Fig. 6A, lentiviral mediada por la expresión de Gli1 y Gli2 shRNA inhibe la expresión de proteínas Gli1 y gli2 en células madre cancerosas pancreáticas. Si GDC-0449 inhibe la viabilidad celular e induce la apoptosis mediante la inhibición de factores de transcripción Gli, la inhibición de la Gli1 y Gli2 debería bloquear los efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos de la GDC-0449. Para confirmar los efectos Gli-dependientes anti-proliferativa y pro-apoptóticos GDC-0449, se utilizaron células madre cancerosas pancreáticas que expresan Gli1 + Gli2 shRNA (Fig. 6B). GDC-0449 inhibe la viabilidad celular y la apoptosis inducida en células CSC /revueltos. La inhibición de la Gli1 y Gli2 solo por shRNA fue incapaz de inhibir completamente los efectos de la GDC-0449 sobre la viabilidad de CSC (datos no mostrados). En comparación, la inhibición de la Gli1 más Gli2 entre sí por shRNA suprime los efectos de la GDC-0449 sobre la viabilidad celular y la apoptosis en células madre cancerosas. Estos datos sugieren que los genes son necesarios tanto Gli1 y gli2 para efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos de la GDC-0449.
(A), Fuera de combate de Gli1 shRNA y Gli2 shRNA en células madre cancerosas pancreáticas humanas. Células madre cancerosas pancreáticas fueron transducidas con partículas lentiviral que expresa revueltos, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA o Gli1 más Gli2 shRNA (KO). (B), células madre cancerosas pancreáticas fueron tratados con GDC-0449 (0, 1, 5 y 10 mM) durante 72 h, y la viabilidad celular y la apoptosis se midió en revueltos y Gli1 más Gli2 shRNA células madre cancerosas. Los datos representan la media ± SD, n = 4. @ o#significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (C), revueltos y Gli1 más Gli2 shRNA células madre cancerosas pancreáticas fueron tratados con GDC-0449 (0 y 10 mM) durante 48 h, y se extrajeron los lisados para determinar la expresión de DR4, DR5, PDGFR, Fas y Bcl-2 por Western El análisis de transferencia. ß-actina se utilizó como control de carga. (D), la inhibición de esferoides primarias y secundarias por GDC-0449. Células madre cancerosas pancreáticas (revueltos, y Gli1 + Gli2 shRNA) se sembraron en suspensión y tratados con GDC-0449 (10 M) durante 7 días. Al final del período de incubación, se recogieron esferoides, y se disociaron con Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). Para esferoides secundarias, las células se volvieron a sembrar y se trataron con GDC-0449 (10 M) durante 7 días adicionales. La viabilidad celular se midió por el ensayo de azul de tripano. Los datos representan la media ± SD. @ O#significativamente diferentes de los controles respectivos, P & lt;.
0,05
A continuación examinó los efectos de la inhibición de la expresión de Gli en blanco de abajo de la vía SHH por Western blot (Figura 6C.). GDC-0449 (10 M) indujo la expresión de Fas, DR4 y DR5, PARP escindida, y se inhibe la expresión de Bcl-2 y PDGFRa en CSC /células revueltos. Es interesante observar que la expresión de PDGFR se redujo después del tratamiento GDC-0449 con aumento concomitante de Fas. En comparación, la GDC-0449 no tuvo efectos significativos en la expresión de estos objetivos de abajo de la vía de señalización de SHH en las células de los CAC /Gli1 + Gli2 shRNA.
A continuación examinó el efecto de la GDC-0449 sobre la formación de esferoides primaria y secundaria (Fig. 6D). GDC-0449 inhibe la formación de esferoides de primaria y secundaria en las células CSC /revueltos. En comparación, la transducción de Gli1 más Gli2 shRNA en células madre cancerosas suprimió los efectos inhibitorios de la GDC-0449 sobre la formación de esferoides primaria y secundaria. Estos datos sugieren que la GDC-0449 puede inhibir características pancreáticas CSC.
Discusión
Nuestro estudio demuestra, por primera vez, que el agente terapéutico GDC-0449 alisado dependiente regula la supervivencia celular en pancreática humana Los CSC. En concreto, la GDC-0449 inhibe la viabilidad celular y la apoptosis inducida en tres líneas celulares de cáncer de páncreas y células madre cancerosas pancreáticas. En células madre cancerosas pancreáticas, GDC-0449 también suprimió la viabilidad celular, la unión y las actividades de la transcripción Gli-Gli-ADN, la apoptosis inducida por la activación de la caspasa-3 y PARP división. Análisis de los mecanismos moleculares de la muerte celular GDC-0449-inducida en células madre cancerosas mostró aumento de la expresión de Fas y disminución de la expresión de PDGFR, que también regula Fas. Por otra parte, se había reducido regulado Bcl-2, mientras que DR4 y DR5 expresiones se incrementaron tras el tratamiento de la GDC-0449. La supresión de ambos Gli1 más Gli2 por shRNA imitaba los cambios en la viabilidad celular, la formación de esferoides, la apoptosis y la expresión de genes relacionados con la muerte observada en células madre cancerosas de páncreas tratados con GDC-0449. Así, los genes Gli activados reprimen DRs y expresiones Fas mientras que hasta la regulación de expresiones Bcl-2 y PDGFRa para inhibir Fas. Nuestros resultados ponen de manifiesto el papel fundamental de la señalización de SHH en células madre cancerosas pancreáticas humanas y la posibilidad de apuntar a Gli1 y gli2 funciones activadoras utilizando GDC-0449 en las células madre del cáncer de páncreas.
SHH señalización de eventos han sido implicados en la proliferación de células tumorales y supervivencia, así como es el sello molecular de diferentes entidades tumorales humanas que incluyen carcinoma esofágico de células escamosas, carcinoma de células basales [38], subconjuntos de meduloblastoma [39], cáncer de próstata [40], cáncer de colon [41], tumores cerebrales [42 ], rabdomiosarcoma [43], y el cáncer de mama [44]. Múltiples líneas de evidencia apoyan la idea de que la señalización de SHH es un requisito previo para el aumento de la viabilidad de las células madre cancerosas de páncreas, de manera que el bloqueo de la señalización de SHH activo con las moléculas inhibidoras terapéuticos tales como GANT-61 (con el objetivo efectores Gli1 y Gli2) y ciclopamina (dirigido a un receptor de SHH smoothened) inducida por la muerte celular [45]. Hemos demostrado que las líneas celulares de cáncer de páncreas humanos y células madre cancerosas expresar consistentemente diversos componentes de la vía SHH incluyendo efectores (Gli1 y gli2), y los receptores (Patched-1, Patched-2, y Smoothened), y lo más importante el ligando: SHH, lo que sugiere , vía de SHH es uno de los un modo autocrino de la señalización de SHH en estas células vía de señalización de "núcleo" o. La activación de la cascada de señalización de SHH induce constantemente Gli factores de transcripción de la familia (Gli1 y GLI2), por lo tanto, ambos genes Gli ARNm [46], expresada en líneas celulares de cáncer de páncreas y células madre cancerosas, indicando la participación potencial de la señalización de SHH en la carcinogénesis pancreática humana.
activación aberrante de la señalización de SHH está implicado en muchos cánceres humanos. Para identificar nuevas dianas terapéuticas, la inhibición de la señalización de SHH se ha intentado en múltiples cánceres humanos [11], [41], [45]. Recientemente, los antagonistas de Gli y SMO se han utilizado para abrogar la señalización de SHH en los cánceres humanos (40). antagonistas smoothened naturales y sintéticas tales como la ciclopamina [24] y IPI-926 [11], la proliferación, respectivamente, han inhibido, la supervivencia y tienen funciones anti-tumorales, dando como resultado la abrogación de la señalización de SHH. Sin embargo, durante los ensayos clínicos se han observado varios niveles de resistencia. Los agentes farmacológicos incluyendo ciclopamina (11), GDC-0499 y el GANT-61 [41] tienen funciones de supervivencia y antitumorales inhibidas en modelos preclínicos de los cánceres humanos. genes Gli son miembros potenciales de la vía SHH, que actúan como mediadores aguas abajo de la señalización de SHH y tienen efectos reguladores sobre el ciclo celular y la apoptosis. Por lo tanto, un objetivo druggable potencial radica en factores de transcripción Gli familia, que son los mediadores finales de la regulación transcripcional de la vía de señalización de SHH. En el presente estudio, la exposición a la GDC-0449 induce citotoxicidad y apoptosis significativa en las células de cáncer de páncreas humanos y células madre cancerosas.
tratamiento GDC-0449 disminuyó con eficacia vinculante Gli-Gli ADN y la actividad transcripcional en células madre cancerosas pancreáticas humanas. Estos resultados sugieren que la GDC-0449 puede provocar alteraciones de genes Gli posttranscriptional, que podrían apuntar hacia, un aumento de la fosforilación de que, o bien impedir la unión de ADN o desestabilizar el complejo Gli-ADN. Las modificaciones post-traduccionales de gen GLI es un importante mecanismo que regula la capacidad de los diferentes factores de transcripción para inhibir conjuntos de genes distintos, participan en la regulación de la inhibición de la muerte celular [41], en consonancia con las observaciones anteriores en las células de cáncer de páncreas ingeniería genética para expresar Gli1 [13 ]. De particular interés, alisado dependiente de tratamiento GDC-0449 de células madre cancerosas pancreáticas marcadamente expresiones inhibidos de receptores SHH (Patched-1, Patched-2 y Smoothened) y efectores (Gli1 y gli2), demostrando así el potencial para la aplicación terapéutica para el tratamiento del cáncer de páncreas . Se informó previamente que GDC-0449 fue identificado como inhibidor de la actividad transcripcional Gli1, y también abrogó Gli2 mediada por la transcripción [36]. Posteriormente, hemos observado que la reducción en la expresión Gli2 precedió a la de Gli1 en células madre cancerosas pancreáticas. Además, los estudios en ratones han puesto de manifiesto que es Gli2 mediadores primarios de la señalización de SHH y es conocido para regular transcripcionalmente la expresión Gli1 [25]. Debido a que la vía de señalización de SHH ya está activado en células madre cancerosas pancreáticas humanas, se llevaron a cabo estudios utilizando shRNA desmontables de Gli1 y Gli2 solo y de forma simultánea. GDC-0449 de manera significativa la viabilidad celular inhibida y la apoptosis inducida en shRNA Gli1 y Gli2 sola (datos no mostrados). Curiosamente, una protección significativa contra la citotoxicidad inducida por el GDC-0449 y la apoptosis se registró en shRNA desmontables de ambos Gli1 y Gli2. Estos nuevos datos apoyan la idea de que la GDC-0449 puede tener Gli-dependiente y el modo -independiente de acción (Fig. 7) y, además, muestran la importancia de los genes Gli funcionales en el mantenimiento de la supervivencia celular en células madre cancerosas pancreáticas humanas.
Activado Gli1 y Gli2, aguas abajo de Smoothened SHH-Patched, regular los objetivos de la señalización de SHH incluyendo Bcl-2, PDGFRa, Fas, y los Dres. GDC-0449 (dirigido a smoothened) bloquea las funciones indirectas de activadores Gli, lo que resulta en la muerte celular.
Para evaluar el efecto antiproliferativo de la GDC-0449 con más detalle, el próximo correlacionado la expresión del ciclo celular y genes relacionados con la apoptosis con la señalización de Shh en células madre cancerosas pancreáticas. En varias células madre y las células cancerosas, SHH actúa como un factor de supervivencia [9], [47]. SHH ha sido reportado para controlar la proliferación de varios tipos de células a través de diversos mecanismos moleculares tales como aumento de la PDGFRa y Bcl-2 expresiones, disminuir en DRs y Fas expresiones, y la inhibición de la escisión de PARP y la caspasa-3 de activación en líneas celulares de cáncer de colon que sobreexpresan genes Gli [41] o, una sobreexpresión de FADD dominante negativo en células que expresan SHH o una Smoothened constitutivamente activa [41]. En nuestro estudio, la GDC-0449 indujo un marcado aumento en la expresión de Fas y los dos proyectos de resolución (TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R1 /DR5), lo que sugiere la posible participación de estos proyectos de resolución en la apoptosis inducida por fármacos. Informes recientes indican la ausencia de Gli sitios en la región promotora de DR4 y DR5 de unión. La regulación de la expresión DR por el Gli es actualmente desconocido y puede ser a través de un mecanismo indirecto. Sin embargo, la GDC-0449 inducida sobre regulación de los dos proyectos de resolución en células madre cancerosas pancreáticas, lo que sugiere la regulación transcripcional de los proyectos de resolución por un mecanismo actualmente desconocido. También se determinó la contribución de las vías de apoptosis muerte celular (receptor intrínseca y la muerte extrínsecos de señalización mediada por mitocondrias mediada), basado en la regulación conocida de PDGFRa aguas arriba de Fas [2], [48], y de Bcl-2, que puede ser una diana transcripcional directa de ambos Gli1 y Gli2, una proteína anti-apoptótica clave en la supervivencia celular dependiente de SHH [49]. Hemos demostrado que el tratamiento GDC-0449 reduce la proteína pro-supervivencia Bcl-2 expresión en células madre cancerosas pancreáticas. Por lo tanto, nuestros datos demuestran que la activación de la vía SHH puede regular los genes implicados en las dos vías por células y extrínsecos de células intrínseca de la apoptosis.
En conjunto, este estudio revela que la señalización de SHH endógena controla la capacidad de auto-renovación de los recursos humanos células madre cancerosas pancreáticas por la orientación dianas aguas abajo de Gli. En conclusión, GDC-0449 se puede utilizar para el tratamiento de cáncer de páncreas humano, ya que puede dirigirse a células madre cancerosas de cáncer de páncreas.
Métodos
Anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos contra SHH, smoothened, Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, y β-actina fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, PDGFR y la caspasa-3 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). quimioluminiscencia (ECL) Western blot reactivos de detección fueron de Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib; C19H14Cl2N2O3S) se adquirió de Tocris (Ellisville, MO). Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado analítico y se compraron a Fisher Scientific (Suwanee, GA) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de páncreas ( AsPC-1, PANC-1 y MIA PaCa-2) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. Células madre cancerosas pancreáticas humanas (CD133
+ /CD44
+ /CD24
+ /ESA
+) se obtuvieron de Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Ellos fueron aisladas de los tumores primarios y se han descrito anteriormente [33]. Las células madre cancerosas se cultivaron en DMEM suplementado con 1% Suplemento N2 (Invitrogen), 2% Suplemento B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crecimiento de plaquetas humano (Sigma-Aldrich), 100 ml de factor /ng de crecimiento epidérmico (Invitrogen) y 1 % de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. Células madre cancerosas pancreáticas se verificaron rutinariamente por morfología y características de crecimiento
producción de partículas de Lentiviral del shRNA y Gli1 y Gli2 shRNA transducción
Gli1 shRNA (5'-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3 ';. GTTTGAATCTGAATGCTAT 5'-3 '; 5' AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3 '; 5' CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3 'y 5'-GGCTGGACCAGCTACATCA-3') y Gli2 shRNA (5'-CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3 '; 5' CACAGCATGCTCTACTACT-3 '; 5' TCGCTAGTGGCCTACATCA -3 '; 5' TCCGAGAAGCAAGAAGCCA-3 'y 5'-CCAGACGACGTGGTGCAGT-3') se obtuvieron de Abrir Biosystems, Huntsville, aL) y se clonó en vector TRIPZ.