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PLOS ONE: significado clínico de EML4-ALK gen de fusión y asociación con EGFR y KRAS mutaciones genéticas en 208 pacientes chinos con células no pequeñas de pulmón Cancer

2013/10/5


Extracto

El gen de fusión ALK-EML4 Recientemente se ha identificado en un pequeño subgrupo de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes que responden positivamente a los inhibidores de ALK. Las características del gen de fusión ALK-EML4 en pacientes chinos con NSCLC son poco conocidos. Aquí, se presenta en la prevalencia de EML4-ALK, el estado de EGFR y KRAS mutaciones en 208 pacientes chinos con NSCLC. mutaciones de EGFR se encontraron en el 24,5% (51/208) de los pacientes. En concordancia con los informes anteriores, estas mutaciones se identificaron en las frecuencias altas en las mujeres (47,5% frente a 15,0% en los hombres;
P Hotel & lt; 0,05); los no fumadores (42,3% vs 13,9% en los fumadores;
P Hotel & lt; 0,05), y los pacientes con adenocarcinoma (44,2% vs 8,0% en pacientes no adenocarcinoma;
P Hotel & lt; 0,05) . Sólo había 2,88% (6/208) de los pacientes con mutaciones de KRAS en nuestro grupo de estudio. Se identificaron 7 pacientes que albergaban el gen de fusión EML4-ALK (3,37%, 7/208), incluyendo 4 casos con la variante 3 (57,1%), 2 con la variante 1, y 1 con la variante 2. Todos los casos positivos correspondían a pacientes de sexo femenino (11,5%, 7/61). Seis de los casos positivos eran no fumadores (7,69%, 6/78). La incidencia de la translocación de ALK-EML4 en pacientes con adenocarcinoma de mujeres, no fumadores era tan alta como el 15,2% (5/33). No se detectaron mutaciones de EGFR /KRAS entre los pacientes EML4-ALK positivos. El análisis anatomopatológico mostró ninguna diferencia entre patrón sólido de células en anillo de sello (4/7) y el patrón cribiforme mucinoso (3/7) en pacientes ALK-positivos. La inmunotinción mostró una heterogeneidad intratumoral de reordenamiento ALK en carcinomas primarios y 50% (3/6) de los tumores metastásicos con tinción ALK-negativo. El metanálisis demostró que EML4-ALK translocación se produjo en 4,84% (125/2580) de los pacientes no seleccionados con CPNM, y también fue predominante en los pacientes no fumadores con adenocarcinoma. Tomados en conjunto, translocaciones EML4-ALK fueron poco frecuentes en toda la población de pacientes con CPNM, pero eran frecuentes en el subgrupo de NSCLC femenina, no fumadora, pacientes con adenocarcinoma. Hubo heterogeneidad intratumoral de reordenamiento de ALK en los carcinomas primarios y en los sitios metastásicos

Visto:. Li Y, Li Y, Yang T, S Wei, Wang J, Wang M, et al. (2013) Importancia clínica de EML4-ALK gen de fusión y asociación con EGFR y KRAS mutaciones genéticas en 208 pacientes chinos con células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (1): e52093. doi: 10.1371 /journal.pone.0052093

Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: Abril 10, 2012; Aceptado: 14 Noviembre 2012; Publicado: 14 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación está apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172233), el Programa de Ciencia y Tecnología de soporte clave de Tianjin (09ZCZDSF04000, 09ZCZDSF03800), la Fundación Tianjin Ciencias Naturales (12JCZDJC24400), el proyecto del Ministerio de Educación para la Nueva siglo talentos excelentes (NCET-10-0956), y la Fundación Wujieping (320.6720.10007, 320.6740.10008, 3.206.720,10008). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de pulmón es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer, donde se asocia con una tasa de supervivencia de 5 años en todo el mundo de menos del 15% [1], [2]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% de los cánceres de pulmón [3]. quimioterapia basada en cisplatino ha producido un beneficio de supervivencia significativo sobre el mejor tratamiento sintomático en pacientes con CPNM avanzado; Sin embargo, los resultados para los pacientes con CPNM todavía se consideran insatisfactorios [3], [4]. la quimioterapia y la radioterapia tradicional están asociados con efectos secundarios significativos en todos los pacientes con CPNM, debido a su falta de especificidad. El desarrollo y la aplicación de fármacos que se dirigen a moléculas específicas expresadas en las células de cáncer de pulmón se ha ganado una mayor atención, y los éxitos notables han sido reportados en varios grupos de estudio de pacientes con NSCLC [5], [6], [7], como un subgrupo de pacientes con NSCLC positivo por la activación de mutaciones en el gen (EGFR) receptor del factor de crecimiento epidérmico. Estos cánceres exhiben sensibilidad a inhibidores de EGFR de tirosina quinasa (TKIs), tales como gefitinib o erlotinib, que apoya el uso de estos fármacos para el tratamiento eficaz de NSCLC [5], [8]. Entre los pacientes que llevan la mutación EGFR activación, que tienen la enfermedad sin tratamiento previo, avanzada, gefitinib ha demostrado ser superior a la quimioterapia citotóxica [4], [9], [10]. La utilidad de las ITC del EGFR en estos pacientes pone de relieve la importancia de identificar subgrupos de pacientes específicos de genotipo para guiar la selección de terapias dirigidas.

Recientemente, una proteína de fusión entre la porción N-terminal de la proteína asociada a los microtúbulos equinodermo -como 4 (EML4) de proteínas y la parte de la señalización intracelular de la tirosina quinasa del receptor quinasa de linfoma anaplásico (ALK) se ha identificado en un pequeño subgrupo de pacientes de NSCLC [11]. Los pacientes que albergan la proteína de fusión ALK-EML4 demuestran características patológicas y fisiológicas únicas clínicos [12], [13]. Varios informes han identificado esta proteína de fusión predominantemente en los jóvenes no fumadores con adenocarcinoma [11], [14], mientras que otros informes han descrito esta proteína de fusión en diferentes poblaciones [15], [16]. El pequeño número total de casos positivos identificados por estudio puede explicar estas discrepancias. Las características de EML4-ALK en los cánceres de pulmón aún no se han dilucidado, en particular en pacientes chinos con NSCLC. Es la prevalencia de mutaciones EML4-ALK, al igual que la mutación de EGFR, vinculado a un grupo étnico específico?

Los EGFR /mutaciones KRAS y la translocación EML4-ALK se llaman mutaciones del conductor, ya que son responsables tanto de la iniciación y mantenimiento de cáncer de pulmón. Los adenocarcinomas exhiben cambios genómicos distintos que se pueden clasificar en subgrupos moleculares clínicamente relevantes de acuerdo con KRAS, EGFR, y el estado de EML4-ALK. Las mutaciones específicas en estos genes inducen tumores sensibilidades diferenciales a los agentes terapéuticos dirigidos. Por ejemplo, los tumores que tienen mutaciones somáticas dominantes en los exones del EGFR son típicamente sensibles a EGFR-TKI. Los tumores que albergan mutaciones somáticas en KRAS, que codifica una GTPasa aguas abajo de EGFR, muestran una mayor resistencia a estos fármacos. Por lo tanto, es necesario entender las correlaciones entre EML4-ALK y EGFR /mutaciones KRAS en pacientes con cáncer de pulmón.

Aquí, se presenta en las características clínicas y patológicas a gran escala de esta fusión en 208 pacientes con CPNM china y se correlacionan con la presencia de mutaciones de EGFR y KRAS en los mismos pacientes. También presentamos un meta-análisis del gen de fusión ALK-EML4.

Resultados

Características clínicas del gen de fusión ALK-EML4 en China CPNM pacientes

En el año 2007, Martelli et al. pacientes evaluados que expresaron transcritos EML4-ALK, usando fluorescencia
In situ
hibridación, y se encontró que sólo aproximadamente el 1,8% de las células albergaba el gen de fusión ALK-EML4 [17]. Estos investigadores fueron incapaces de detectar la proteína ALK-EML4 por inmunohistoquímica, Western Blot o inmunoprecipitación. RT-PCR es el método de detección más sensible y más populares disponibles en la actualidad. Se realizó RT-PCR anidada para amplificar la región de fusión de la translocación. Se evaluó la sensibilidad de nuestro protocolo de RT-PCR anidada mediante la amplificación de cDNA diluido en serie a partir de células H2228. La RT-PCR anidada detectó el gen de fusión ALK-EML4 a un límite inferior de 7,8 × 10
-4 ng de cDNA de entrada (Figura 1A).

anidados RT-PCR se realizó utilizando cDNA diluido en serie a partir células H2228. Tan poco como 7,8 × 10
-4 ng de ADNc podría ser utilizado para la detección coherente de la transcripción de la fusión variante 3 con este protocolo (panel superior). resultados de la electroforesis en gel representativos para la RT-PCR anidada (panel inferior). marcador de carril: escalera de 200 pb; control positivo: H2228; control negativo: A549. Otras calles corresponden a muestras que presentan la translocación EML4-ALK, marcada por el número de caso.

Hubo 208 pacientes con CPNM en nuestro estudio y sus características clínicas y patológicas se detallan en la Tabla 1. Los resultados de anidada amplificaciones de RT-PCR del gen de fusión EML4-ALK se muestran en la Figura 1B. Se identificaron 7 pacientes que albergaban el gen EML4-ALK de fusión (3,37%, 7/208), que se confirmó por secuenciación de ADN (Figura 2). De estos 7 pacientes, 2 casos muestran la variante EML4 ALK-1 (28,6%, 2/7), 1 caso expuesto variante 2 (14,3%, 1/7) y 4 casos lleva a la variante 3 (57,1%, 4/7) . Por lo tanto, la variante 3 puede ser la variante predominante en los pacientes con CPNM chinos con más de la mitad de las translocaciones EML4-ALK que exhiben fusiones entre el exón 6 de EML4 y el exón 20 de ALK.

(A) la variante 1, (B ) la variante 2, (C) la variante 3.

Las características clínicas de estos 7 pacientes se describen en la Tabla 2. Seis casos de adenocarcinoma y carcinoma de uno de los casos involucrados adenoescamosa involucrados. Las pruebas para otros tipos de carcinoma fueron negativas (0/106). Como se muestra en la Tabla 3, la prevalencia del gen de fusión ALK-EML4 fue 6,32% (6/95) de los casos de adenocarcinoma y el 14,2% (1/7) de los casos de carcinoma adenosquamous. Todos los casos positivos correspondían a pacientes de sexo femenino, lo que resulta en una tasa positiva entre las mujeres de 11,5% (7/61;
p
= 0,000). Seis de los casos positivos eran no fumadores (7,69%, 6/78). La frecuencia de la translocación EML4-ALK entre los pacientes con adenocarcinoma de no fumadores femeninos fue de 15,2% (5/33). La edad mediana de los casos EML4-ALK-positivos (55 ± 10,38) era mucho menor que la de los pacientes EML4-ALK-negativas (61,78 ± 8,71;
p = 0,045
). No se detectaron asociaciones significativas entre la fusión de genes y la fase o el estado metastásico.

El análisis histológico de EML4-ALK-positivo cáncer de pulmón

Como se muestra en la Figura 3, todo 7 de los tumores ALK-positivo, al menos, albergaban un componente de adenocarcinoma. Sólo en un caso (Caso 4) tenía diferenciación escamosa focal (que representa el 20% del volumen del tumor). El componente de adenocarcinoma mostraron una histomorfología variada, y el patrón de crecimiento predominante fue papilar (o micropapilar) en 1 caso (Caso 1), acinar en 3 casos (casos 2, 6 y 7), y sólidas en 3 casos (casos 3, 4 y 5). Sin embargo, la mayoría de los casos (5/7) en realidad tenía un componente mixto que incluye el adenocarcinoma papilar o micropapilar, las células en anillo de sello, y las células mucosas. Sobre la base de la pauta patológica se informó anteriormente para carcinomas ALK-positivo [18], 57,14% (4/7, casos 1, 3, 4 y 5) de los casos ALK-positivos mostró que el patrón de células en anillo de sello sólido y 42,86% (3/7, casos 2, 6 y 7) de los casos mostraron el patrón cribiforme mucinoso. Un cuerpo psamomatosa también fue identificado en la caja 6, que era un adenocarcinoma mezclado con células en anillo de sello, células mucosas y componente micropapilar. Curiosamente, encontramos una tasa de alcoholemia mucinoso puramente no invasivo (carcinoma bronquioloalveolar) en el asunto 7, en el que las células caliciformes mostraron un patrón de crecimiento lepidic. Los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos estaban disponibles en 6 de los casos ALK-positivos. Papilar o micropapilar, las células en anillo de sello con el moco extracelular, y cribiforme estructura se identificaron en 2 (casos 1 y 2), 1 (caso 6), y 3 (casos 3, 4 y 5) de los casos, respectivamente. Cinco casos mostraron el patrón sólido en anillo de sello de células, y 1 caso (Caso 6) mostró el patrón cribiforme mucinoso.

Los tumores primarios de los casos 1, 3, 4 y 5 mostraron el patrón de células en anillo de sello sólida compuesta de crecimiento sólido con papilar (o micropapilar) o un componente de células en anillo de sello, y otros sitios primarios de los casos 2, 6 y 7 mostraron el patrón cribiforme mucinoso que consta de moco extracelular abundantes y estructuras cribiforme. En los sitios de metástasis en los ganglios linfáticos, patrón de células en anillo de sello sólido se identificó en los casos 1-5, y el patrón cribiforme mucinoso sólo se observó en el asunto 6.

Además, un sistema de clasificación de 3 niveles de pulmón adenocarcinomas basados ​​en el patrón histológico se informó por Sica et al [19], incluyendo grado I: un modelo con un bajo grado (BAC), grado II:. patrón con grado intermedio (acinares y papilar); y Grado III: Modelo con alto grado (sólidos y micropapilar). El uso de este sistema de clasificación, sólo el Caso 7 pertenecía a Grado I, y todo el resto pertenecía a Grado III ya que la mayoría de ellos se mezclaron los adenocarcinomas con metástasis en los ganglios linfáticos.

A continuación, se realizó la tinción inmunohistoquímica ALK (ALK-IHC ) de los tumores primarios y metastásicos de todos los casos de ALK-positivo. Como se muestra en la Figura 4, ALK-IHC fue positivo en todos los tumores primarios, y expresión de la proteína ALK se encuentra en el citoplasma. Por otra parte, la tinción ALK-positivo no se observó en cada célula del tumor primario. Fue muy evidente en la caja 4 con el carcinoma adenoescamoso, donde ALK inmunotinción se produjo en el componente de adenocarcinoma pero no en el componente de carcinoma escamoso. Este resultado indica un fenómeno de heterogeneidad intratumoral de reordenamiento ALK en los sitios de tumor primario. Por otra parte, sólo había 3 casos (casos 2, 5 y 6) con tinción ALK-positivo en los tumores metastásicos. El otro 50% de los tumores metastásicos fueron tinción completamente ALK-negativas, incluyendo los casos 1, 3 y 4. Para el caso 4, a pesar de que los tumores metastásicos que comprenden la mayor parte del componente de adenocarcinoma, ALK inmunotinción era todavía completamente negativa.

inmunotinción ALK-positivo se muestra en los tumores primarios de los 7 pacientes con cáncer de pulmón ALK-reordenado con tinción difusa en el citoplasma. tinción ALK-positivo no fue aparente en cada célula del tumor primario, especialmente en el caso 4, que es un carcinoma adenoescamoso con tinción ALK positiva sólo en la parte adenocarcinoma, no en el componente de carcinoma escamoso (indicado en texto rojo: Adeno y células escamosas). Para los sitios de ganglios linfáticos metastásicos, los casos 2, 5 y 6 mostraron ALK-positivo tinción y Casos 1, 3 y 4 mostraron tinción ALK-negativo.

Finalmente, ALK tinción de inmunofluorescencia (ALK-SI) también fue empleado en ALK-IHC de los tumores primarios y metastásicos en todos los casos ALK-positivo, lo que confirmó los hallazgos más ALK-IHC. Como se muestra en la Figura 5, ALK-IF también fue positivo en todos los tumores primarios, con la proteína que localiza a la ALK en el citoplasma. Se obtuvieron resultados similares con ALK-IHC, donde el 50% de los sitios de metástasis mostró tinción completa ALK-negativa en los casos 1, 3 y 4. También se realizó RT-PCR para el gen EML4-ALK con ADNc a partir de todos los tumores metastásicos y obtuvo los mismos resultados, es decir, expresión negativa del gen EML4-ALK en los casos 1, 3 y 4 (datos no presentados). Todos estos datos confirman la heterogeneidad intratumoral de reordenamiento de ALK en los carcinomas primarios de pulmón.

inmunotinción ALK-positivo se muestra en el tumor primario de los 7 pacientes con cáncer de pulmón ALK-reorganizado. Para los sitios de los ganglios linfáticos metastáticos, los casos 2, 5 y 6 mostraron tinción ALK-positivo y casos 1, 3 y 4 mostraron tinción ALK-negativo. Estos resultados fueron similares a los de inmunohistoquímica ALK. ALK: verde; Ki-67: rojo; DAPI:. Azul

EGFR y KRAS mutaciones y características clínicas de los pacientes

De los 208 pacientes estudiados, se identificaron 51 casos de mutaciones de EGFR en los exones 18, 19, 20, o 21 (24,5%, 51/208; Tabla S1). Las mutaciones en el exón 18 de EGFR fueron identificadas en 3 casos; una deleción del exón 19 fue identificado en 21 casos, y no se detectaron mutaciones en los exones 20 y 21 mutaciones en los 6 y 26 casos, respectivamente. Cinco casos exhiben mutaciones dobles en los exones de EGFR. Entre los exones 18-21, mutaciones de EGFR se produjeron predominantemente en los exones 19 y 21 (90,19%, 46/51). En concordancia con los informes anteriores, la tasa de mutación de EGFR en pacientes con adenocarcinoma (44,2%, 42/95) era mucho más alta que en pacientes no de adenocarcinoma (8,0%, 9/113;
P
= 0,000). Además, la tasa de mutación de EGFR fue significativamente menor en pacientes de sexo masculino (15,0%, 22/147) que en los pacientes de sexo femenino (47,5%, 29/61;
P
= 0,000). Entre los no fumadores, la tasa de mutación de EGFR fue del 42,3% (33/78), mucho más alta que entre los fumadores (13,9%, 18/130;
P
= 0,000). No hay asociaciones fueron identificados entre las mutaciones del gen EGFR y la edad, estadio clínico, el tamaño del tumor, la metástasis o el estado de los pacientes (Tabla 3) guía.
Entre los 208 pacientes, 6 casos lleva a mutaciones del gen KRAS (2,88%, 6/208 ). No se detectaron asociaciones entre las mutaciones KRAS y la edad, estadio clínico, sexo, patología, el tabaquismo, el tamaño del tumor, la metástasis o el estado de los pacientes (Tabla 3). No se detectaron mutaciones de EGFR /KRAS en pacientes EML4-ALK-positivos en nuestro estudio.

El análisis de supervivencia

A partir de marzo de 2011, 181 pacientes tenían datos de pronóstico completos, incluyendo 49 muertes y 132 casos de la supervivencia. La mediana de seguimiento para toda la serie fue de 591 días (rango de 0 a 1329 días días). Se realizó un análisis de supervivencia de estos 181 pacientes con respecto a la presencia de genes de fusión ALK-EML4 y mutaciones de EGFR /KRAS. Se identificaron 45 pacientes con mutaciones de EGFR, para quienes el tiempo medio de supervivencia fue de 19,3 meses (578 días); 124-1281. De los 136 pacientes con EGFR normal, el tiempo medio de supervivencia fue de 19,8 meses (594,5 días; 0-1329). La diferencia en los tiempos mediana de supervivencia global entre estos grupos no fue estadísticamente significativa (
P = 0,467
). Se identificaron 4 pacientes con mutaciones de KRAS para quienes el tiempo medio de supervivencia fue de 16,3 meses (489 días; 233-818). De los 177 pacientes con KRAS normal, el tiempo medio de supervivencia fue de 19,7 meses (592 días; 0-1329). Entre los 181 casos, 7 pacientes llevan la translocación del gen de fusión EML4-ALK. La mediana de seguimiento de estos pacientes fue de 16,8 meses (504 días; 360-661), que no fue significativamente diferente en comparación con el grupo negativo EML4-ALK con 33,4 meses (594,5 días; 0-1329) (
P
= 0,655).

Meta-análisis de las características clínicas asociadas con EML4-ALK translocación

Como se muestra en la Tabla 4, el análisis sistemático de la literatura reveló 14 publicaciones analizar la frecuencia y características clínicas asociado con EML4-ALK translocación, incluyendo 2580 pacientes con NSCLC. De estos, 125 pacientes (4,84%, 125/2580) albergaban el reordenamiento EML4-ALK. El meta-análisis demostró que EML4-ALK translocación fue predominante en los pacientes con adenocarcinoma. Once estudios (1825 casos) examinaron una correlación entre el consumo de tabaco y la translocación EML4-ALK. Se detectó una tendencia significativa entre los grupos de fumadores y no fumadores (
P
= 0,49), lo que los datos se analizaron mediante un modelo de efectos aleatorios. Se detectó una diferencia significativa en el estado positividad EML4-ALK entre fumadores y no fumadores (OR [IC del 95%] = 0,26 [0,16, 0,43], Z = 5,26;
P & lt; 0,05
) (Figura 6A) . Estos resultados indican que el tabaquismo se asoció significativamente con la translocación EML4-ALK. Nueve informes (1413 casos) evaluaron la translocación EML4-ALK en grupos de adenocarcinoma y no de adenocarcinoma. No se detectaron sesgo significativa entre los dos grupos (
P
= 0,50), por lo que se utilizó un modelo de efectos fijos. Nuestros resultados sugieren que la frecuencia de translocación EML4-ALK diferían en el grupo de adenocarcinoma en comparación con el grupo no adenocarcinoma (OR [IC del 95%] = 2,07 [1,11, 3,84], Z = 2,30;
P & lt; 0,05
) (Figura 6B). Once estudios (1777 casos) evaluaron la translocación EML4-ALK en grupos de hombres y mujeres. No encontramos ningún sesgo significativa entre los dos grupos (
P
= 0,95) y se analizaron los datos mediante un modelo de efectos fijos. Nuestros resultados indican que no hubo diferencias significativas entre los grupos de hombres y mujeres. (OR (IC del 95%) = 0,64 [0.40,1.04] Z = 1.80, P
Restaurant & gt; 0,05). (Figura 6C)

(A) un metanálisis con un modelo de efectos aleatorios modelo demostró que el consumo de tabaco se correlacionó significativamente con EML4-ALK translocación; (B) El metanálisis de los datos mediante un modelo de efectos fijos indicó que el adenocarcinoma (AD) correlacionó significativamente con la translocación EML4-ALK. La translocación fue significativamente más frecuente en el grupo de AD que en el grupo no-AD; (C) El metanálisis mediante un modelo de efectos fijos sugiere que el género no se correlacionó significativamente con EML4-ALK frecuencia de translocaciones.

Discusión

El cáncer de pulmón es una enfermedad devastadora asociado con una tasa de supervivencia a 5 años de aproximadamente 10-15%. A pesar de los nuevos medicamentos quimioterapéuticos se han desarrollado durante las últimas dos décadas, todavía hay una urgente necesidad de tratamientos más eficaces. terapias dirigidas molecularmente presentan una nueva estrategia que ha demostrado recientemente la importancia de los pacientes sub-clasificación de acuerdo a las características biológicas específicas del tumor.

EGFR y KRAS son dos moléculas relevantes en CPNM, y EGFR está dirigido por EGFR-TKI. Estos fármacos muestran un gran potencial en el tratamiento de pacientes con NSCLC avanzado. Numerosos informes han confirmado que la eficacia de EGFR-TKI se correlaciona con mutaciones de EGFR exones [5], [8], y que la incidencia de mutaciones de EGFR es mayor entre los asiáticos, los no fumadores, las mujeres y los pacientes con adenocarcinoma. Soda et al. (2007) sugirieron un evento adicional potencialmente relevante oncogénica en cáncer de pulmón: la fusión del gen EML4 (región que corresponde al segmento N-terminal) con el gen ALK (región correspondiente a la parte de la señalización intracelular) para crear un gen de fusión EML4-ALK . La translocación EML4-ALK representa un nuevo subgrupo de pacientes con CPNM que responden positivamente a los inhibidores de ALK [11], [20].

Nuestro trabajo confirma la incidencia (24,5%) de las mutaciones de EGFR en una población no seleccionada de china pacientes con NSCLC. Entre los exones 18-21, mutaciones de EGFR se presentan predominantemente (90,19%) en los exones 19 y 21. En concordancia con los informes anteriores, estas mutaciones se identifican en las frecuencias altas en las mujeres, los no fumadores, las personas de origen asiático, y pacientes con adenocarcinoma. Curiosamente, la incidencia (6/208, 2,88%) de las mutaciones del gen KRAS en nuestro grupo de estudio era muy baja en comparación con los países occidentales (12-25%) [21].

Nuestro trabajo también confirma la baja incidencia ( 7/208, 3,37%) de la translocación EML4-ALK entre pacientes con NSCLC no seleccionados, que es consistente con la meta-análisis de las características clínicas asociadas con la translocación EML4-ALK en la literatura publicada (4,84%). Este resultado indica que la prevalencia de mutaciones EML4-ALK en la población china es similar a la publicada previamente para las poblaciones de otras etnias. La translocación EML4-ALK no puede estar vinculado a un grupo étnico específico, a diferencia de las mutaciones de EGFR en los asiáticos. Además, el análisis de variantes de mutación EML4-ALK reveló que la variante 3 puede ser la variante predominante en los pacientes con CPNM chinos con más de la mitad de las translocaciones EML4-ALK que exhiben fusiones entre el exón 6 de EML4 y el exón 20 de ALK. Estos resultados sugieren además que la prevalencia de EML4-ALK mutación puede no varía según la etnia, sino que una variante particular puede ser frecuente en un grupo étnico específico.

Nuestros resultados indican además que la translocación EML4-ALK se produce predominantemente en las mujeres, los no fumadores y pacientes con adenocarcinoma. Estos resultados fueron diferentes de los meta-análisis de género, en el que no hubo diferencia significativa entre los grupos masculinos y femeninos. En nuestro estudio, todos los casos 7 ALK-positivos fueron del sexo femenino, y la razón puede ser debido a la tasa de fumadores mucho más alto en los hombres que en las mujeres que en China. Un análisis más detallado demostró que la incidencia de EML4-ALK translocación en el sexo femenino, de no fumadores, pacientes con adenocarcinoma es tan alto como 15,2%. Estas características son de gran importancia, porque las mujeres, no fumadores, pacientes con adenocarcinoma se seleccionan típicamente de beneficiarse del tratamiento EGFR-TKI, lo que indica que una pantalla de translocación EML4-ALK debe preceder al tratamiento con ITC. Las mutaciones del gen KRAS /EGFR y la translocación EML4-ALK se llaman mutaciones del conductor, ya que son responsables tanto de la iniciación y mantenimiento de cáncer de pulmón. Los pacientes que albergan la translocación EML4-ALK por lo general no son sensibles al tratamiento EGFR-TKI, pero pueden ser sensibles a los inhibidores de ALK [11], [20].

En nuestro estudio, la comparación del estado de fusión ALK-EML4 con la presencia de mutaciones de EGFR y KRAS en las mismas muestras de cáncer revelaron que las fusiones de EML4-ALK se produjo en ausencia de EGFR o KRAS mutaciones. Aunque los informes anteriores han indicado que la fusión ALK puede ocurrir simultáneamente con mutaciones de EGFR (1/305) y mutaciones de KRAS (1/120), estos pueden ser eventos raros [7], [22]. Un análisis más detallado indica en los 32 casos de no fumadores, mujeres, pacientes con adenocarcinoma de que la frecuencia de mutaciones de EGFR exones y translocación EML4-ALK eran 62,5 %% (20/32) y 15,63% (5/32), respectivamente, que cubre todo 78,13% (25/32) de estos pacientes. Además, Sasaki et al. informado recientemente de que 6% (3/50) de los pacientes con CPNM tratados previamente con reordenamiento ALK tenían mutaciones de EGFR concurrentes activación y que el reordenamiento ALK fue inactivo en estos pacientes debido a EGFR mutación [23]. Como la mayoría de los pacientes con fusiones EML4-ALK no muestran mutaciones de EGFR, un subconjunto molecular específico de adenocarcinomas se caracteriza por EML4-ALK fusión [14]. Hoy en día, algunos fármacos moleculares específicos para la fusión de EML4-ALK se utilizan para tratar a los pacientes con CPNM con EML4-ALK translocación. Por lo tanto, se sugiere un enfoque paso a paso para la prueba de mutaciones de genes en el adenocarcinoma de pulmón: en primer lugar para KRAS, en segundo lugar para EGFR, y luego translocación EML4-ALK. Si un tumor es positivo para una mutación KRAS, no se requiere más pruebas moleculares, y las recomendaciones de tratamiento se centrará en la quimioterapia porque los tumores que tienen mutaciones somáticas en el gen KRAS, que codifica una GTPasa aguas abajo del EGFR, mostrar una mayor resistencia a estos fármacos dirigidos. Si el tumor es negativo, se le harán pruebas para las mutaciones de EGFR y translocación EML4-ALK. Un resultado positivo para una mutación de EGFR o la translocación EML4-ALK se disparará un tratamiento específico:. Un TKI del EGFR o un inhibidor de ALK

Para el análisis patológico, la estructura cribiforme, presencia de células mucosas, moco extracelular, y la falta de pleomorfismo nuclear significativas, podrían ser vistos en el EML4-ALK reorganizado el cáncer, que era similar a los hallazgos en un informe anterior [18]. "Patrón de anillo de sello sólido celular" y "patrón cribiforme mucinoso" son dos cytoarchitecures reconocibles presentes al menos focalmente en la mayoría de los tumores ALK-positivo [18]. Con respecto a estos dos modelos, no vimos una diferencia significativa entre el patrón de células en anillo de sello sólido y patrón cribiforme mucinoso en todos los casos positivos para ALK en nuestro estudio (4/7 vs 3/7, respectivamente). Curiosamente, nuestros resultados de inmunotinción ALK indicaron que no todas las células tumorales fueron tinción ALK-positivo en los sitios primarios, sobre todo en carcinoma adenoescamoso, en contraste con otros estudios que informan que las manchas de componentes carcinoma escamosas positivo [18], [24]. Aún más sorprendente, se encontró que el 50% de los tumores metastásicos fueron completamente negativas para ALK inmunotinción (IHC y SI). Este fenómeno también se ha encontrado en otros estudios con mutaciones de EGFR, que mostraron un 38,0% de los tumores (30 de 79) que tienen una heterogeneidad intratumoral de
EGFR
mutaciones y 62,0% (49 de 79) de ser homogénea, ya sea con
EGFR
mutación o ninguna mutación [25]. Nuestra inmunotinción también confirmó intratumoral heterogeneidad de reordenamiento de ALK en tumores primarios, y para nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre el reordenamiento de ALK en el cáncer de pulmón en los sitios metastásicos frente a sitios primarios, que mostraron diferencias moleculares. Estos resultados indican que la expresión de genes en el tumor metastásico no es completamente similar a la que en el tumor primario. Para los pacientes tratados con los fármacos dianas moleculares, estos resultados también señalan que la nueva detección molecular es muy necesario para estos pacientes con nuevos sitios de metástasis, especialmente para los pacientes con CPNM con translocaciones EML4-ALK.

En resumen, confirmamos que las mutaciones de EGFR exones son frecuentes en pacientes con CPNM, especialmente entre las mujeres, no fumadores y pacientes con adenocarcinoma. translocaciones EML4-ALK son poco frecuentes en toda la población de pacientes con CPNM, pero son frecuentes en el subgrupo de pacientes con CPNM de sexo femenino, de no fumadores, pacientes con adenocarcinoma. La presencia de una translocación EML4-ALK con mutaciones de EGFR /KRAS concomitantes es muy poco frecuente entre los pacientes con cáncer de pulmón. Nuestros resultados indican que la detección de la translocación EML4-ALK en los subgrupos de pacientes con NSCLC es crucial para la aplicación de la terapia dirigida.

Materiales y Métodos

Pacientes y muestras

Muestras fueron obtenidos de 208 pacientes con CPNM que fueron sometidos a resección quirúrgica de cáncer de pulmón primario en el Departamento de Cirugía del cáncer de pulmón, del hospital general de Tianjin Medical University para el diagnóstico y el tratamiento durante el período 2006-2010. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito, y el estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética del Hospital General de Tianjin Medical University. Los criterios de inclusión fueron: (1) el tratamiento quirúrgico sin quimioterapia previa o tratamiento con EGFR-TKI; (2) diagnóstico claro de NSCLC; y (3) la disponibilidad de tejidos para estudios de biomarcadores. Características clínicas y patológicas de los pacientes incluidos se detallan en la Tabla 1. estadificación del cáncer de pulmón para cada paciente se realizó de acuerdo a la AJCC Cancer Staging Manual, 7ª edición. Los pacientes en este estudio fueron clasificados de manera desproporcionada en la etapa III, porque esta etapa de cáncer de pulmón está asociado con el tratamiento quirúrgico. El tiempo de supervivencia se calculó a partir del día de la resección hasta el 6 de abril de 2011. Los tejidos pulmonares resecados se sumergieron inmediatamente en nitrógeno líquido.

H2228, línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano con gen de fusión ALK-EML4, era de la American Tissue Culture Collection (ATCC), y se mantuvo en DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino (Gibco) a 37 ° C con 5% de CO
2.

El aislamiento de ARN y la transcripción inversa

los tejidos congelados (50-100 mg) fueron molidos en un polvo en nitrógeno líquido y se suspendieron en 1 ml de reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.) para extracción de RNA total, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro (Beckman-Coulter, EE.UU.), y su calidad se evaluó por electroforesis en gel de agarosa. El ARN total (2 mg) fue inverso-transcrito (RT) utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, EE.UU.), con modificaciones menores en el protocolo del fabricante.

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