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PLOS ONE: un cáncer específico de la célula Penetrante péptido, BR2, para la prestación eficiente de un scFv en células cancerosas

2013/6/19


Extracto

Teléfonos de penetración péptidos (CPPS) han demostrado ser muy eficaz como vehículos de suministro intracelular para diversos productos terapéuticos. Sin embargo, hay algunas preocupaciones acerca de la penetración no específica y la citotoxicidad de CPP para los tratamientos efectivos para el cáncer. En este documento, basado en el motivo penetrante en las células de un péptido contra el cáncer, buforin IIb, hemos diseñado varios derivados de CPP con especificidad de células de cáncer. Entre los derivados, se encontró que un péptido de 17 aminoácidos (BR2) de tener cáncer de especificidad sin toxicidad para las células normales. Después dirigido específicamente a las células cancerosas mediante la interacción con los gangliósidos, BR2 entró en las células a través de macropinocitosis mediada por lípidos. Además, BR2 mostró una mayor eficiencia de translocación de membrana de la conocida CPP Tat (49-57). La capacidad de BR2 como un vehículo de fármaco específica del cáncer se demostró mediante la fusión de BR2 a un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) dirigida hacia un mutados K-ras (G12V). fusionado-BR2 scFv indujo un mayor grado de apoptosis que scFv fusionado-Tat en K-ras mutado células HCT116. Estos resultados sugieren que el nuevo péptido de penetración celular BR2 tiene un gran potencial como un portador de transferencia del fármaco útil con especificidad celular de cáncer de

Visto:. Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Yang KS , et al. (2013) un cáncer específico de la célula Penetrante péptido, BR2, para la prestación eficiente de un scFv en células cancerosas. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10.1371 /journal.pone.0066084

Editor: Robert W. Sobol, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América

Recibido: 2 de noviembre de 2012; Aceptado: May 6, 2013; Publicado: 11 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Lim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Biología sintética inteligente del Proyecto Global Frontier financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2011 a 0031955). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

los efectos beneficiosos de muchos agentes terapéuticos potenciales recién descubiertas, tales como proteínas, ácidos nucleicos y fármacos hidrófilos, están limitados por su incapacidad para alcanzar los objetivos intracelulares apropiados [1], [2]. Por lo tanto, se han explorado numerosos enfoques tales como microinyección, electroporación, la formulación liposomal y el uso de vectores virales para promover la administración de fármacos eficiente [3], [4]. Una de las principales preocupaciones acerca de estas técnicas es su escasa especificidad celular [4], [5]. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de administración de fármacos específica de la diana es una preocupación principal para la mejora de la eficacia terapéutica de los fármacos, mientras que la reducción de sus dosis eficaces y efectos secundarios [6], [7].

péptidos celulares de penetración ( CPP), también conocidos como dominios de transducción de proteínas, han llamado la atención especial como un vehículo de suministro de fármacos intracelular alternativa desde el descubrimiento de la primera CPP, Tat, en 1988 [8]. CPP son péptidos cortos que consiste en menos de 30 aminoácidos y compuesta principalmente de aminoácidos básicos, con carga positiva (por ejemplo, Arg, Lys y His) que tienen la capacidad de trasladar a través de la membrana celular y para ofrecer una variedad de cargas impermeables a las células a través de la membrana celular [9], incluyendo las proteínas [10], ácidos nucleicos [11], siRNA [12], ácidos nucleicos peptídicos (PNA) [13], terapias de moléculas pequeñas [14], los puntos cuánticos [15], y el contraste MRI agentes [16]. Aunque el mecanismo exacto de la CPP es desconocida, recientes estudios sobre los mecanismos implican que sus resultados de absorción celular de una interacción electrostática rápida inicial con la membrana plasmática, seguida por la absorción endosomal [17], [18].

Uso de CPP para el el suministro intracelular de una amplia gama de macromoléculas es un enfoque poderoso debido a su versatilidad emparejado con fácil funcionalización de las cargas vinculadas y la alta eficiencia de suministro en varias líneas celulares, la superación de los retos que se enfrentan a menudo con otros métodos de entrega [19], [20]. Por lo tanto, muchos estudios se han centrado en el desarrollo de nuevos CPP; el número de CPP disponibles con diferentes características, tales como el aumento de la estabilidad y la entrega de la carga eficiente, sigue aumentando [17].

A pesar de que el potencial de CPP como agentes de entrega es grande, su falta de especificidad de la célula, efectos citotóxicos y los efectos secundarios inesperados son preocupaciones importantes para su desarrollo como vehículos de administración de fármacos [21]. Para la terapia del cáncer, la especificidad celular CPP es especialmente importante por lo que los efectos secundarios sobre las células normales se reducen al mínimo [22], [23]. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad para el desarrollo de CPP cáncer específico y no tóxicos para los tratamientos eficaces para el cáncer.

Hemos informado anteriormente de que un péptido antimicrobiano potente, buforin IIb (RAGLQFPVG [RLLR]
3), tiene una fuerte capacidad de penetración celular y actividad anticancerígena frente a varias líneas celulares de cáncer [24], [25]. A pesar de que buforin IIb mostró citotoxicidad selectiva contra las células cancerosas, sino que también afecta a la viabilidad de las células normales a altas concentraciones. Para desarrollar buforin IIb como un vehículo de suministro de fármaco eficaz, su citotoxicidad contra las células normales debe reducirse al mínimo, manteniendo su especificidad de las células cancerosas.

En este estudio, hemos diseñado un nuevo celular de penetración específica del cáncer y no tóxico péptido, BR2, basado en el motivo penetrante en las células de buforin IIb y estudiado el potencial como vehículo de administración de fármacos eficiente en las células cancerosas mediante la fusión de BR2 a un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) de anticuerpos contra K-ras mutados.

Materiales y Métodos

Cell Cultura y
línea celular de cáncer cervical humano HeLa, línea celular de cáncer de colon humano HCT116, línea celular de melanoma de ratón B16 /F10, línea celular de fibroblastos de ratón NIH 3T3, humana línea celular de queratinocitos HaCat y la línea celular de fibroblastos humanos BJ se obtuvieron todos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) y se cultivaron en un medio completo [medio eagle modificado de Dulbecco] (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) , 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas en condiciones de humedad a 37 ° C con 5% de CO
2.

Péptido Diseño y Síntesis

Hemos diseñado varios derivados de buforin IIb (BR3) por eliminación por etapas del C-terminal regulares a-helicoidal repeticiones motivo RLLR de buforin IIb para crear una célula de cáncer específico y CPP no tóxico. Los péptidos diseñados consistían en un número diferente de la normal RLLR motivo α-helicoidal C-terminal y el nombre BR1 y BR2 (Tabla 1).

CPP Tat, BR1, BR2, BR3 y se sintetizaron químicamente ( Anygen, Gwangju, Corea) en un sintetizador de péptidos MilliGen 9050. El resto de fluoresceína (FITC) se une a la N-terminal a través de un espaciador de ácido aminohexanoico por tratamiento de un péptido unido a resina (0,1 mM) con FITC (0,1 mM) y diisopropil etil amina (0,5 mM) en N, N-dimetilformamida ( DMF) durante 12 h. Todos los péptidos brutos se purificaron y se analizaron por cromatografía de fase inversa de alto rendimiento líquido (RP-HPLC) en una columna C18, y los péptidos purificados se caracterizan por electrospray espectrometría de masas de ionización (ESI-MS).

láser confocal Scanning Microscopy

Para investigar la capacidad de penetración celular y la distribución intracelular de los péptidos internalizados, vivir microscopía confocal se realizó en tres líneas de cáncer (HeLa, HCT116 y B16 /F10) y tres líneas de células normales (HaCat, BJ y NIH 3T3). Brevemente, las células (2 × 10
5) se sembraron en un cubreobjetos de vidrio colocado en una placa de 6 pocillos, cultivadas durante la noche, y después se incubaron con los péptidos marcados con FITC (5 M para cada línea celular) para 30 min. Después las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se montaron en portaobjetos con solución de montaje de fluorescencia (Dako Corp, Carpinteria, CA). Colocalización de BR2 con los lisosomas se observó mediante el uso de LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probe, Eugene, OR). Para evitar los efectos de los artefactos de fijación, con la participación tanto de metanol y paraformaldehído, las células no se fijaron [26], [27]. La distribución de los péptidos marcados con FITC se analizó utilizando un láser de barrido confocal Zeiss LSM 510 microscopio (Jena, Alemania) equipado con un objetivo de 40 × 20 × y. Fluoróforos se excitaron con un láser de argón (488 nm) para FITC y un láser de He-Ne (543 nm) para LysoTracker Roja.


in vitro Ensayo de citotoxicidad


La citotoxicidad de péptidos a las células de mamífero se investigó mediante la evaluación de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) a partir de cáncer y células normales. La cantidad de LDH liberada de las células dañadas en el sobrenadante se midió usando el kit de detección de citotoxicidad (Roche Applied Science, Alemania) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se sembraron células en microplacas de 96 pocillos (1 x 10
4 células por pocillo) en DMEM completo suplementado con 10% de FBS y se incubaron durante la noche a 37 ° C para permitir la fijación y propagación de las células. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con varias concentraciones de péptidos (0-100 mM) y se incubaron durante otras 24 h a 37 ° C. El medio extracelular de cada pocillo se transfirió a una nueva microplaca y se incubaron durante 10 min con 100 l bien mezcla /reacción, seguido de una solución de parada. Se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de ELISA. la liberación de LDH de las células lisadas con 0,2% de Triton X-100 en PBS se definió como 100% de fugas y la liberación de LDH de células no tratadas como 0% de fuga.

Hemólisis Ensayo

actividad hemolítica se ensayó como se descrito por Aboudy
et al Chat con ligeras modificaciones [28].; se lavó 3 ml de eritrocitos humanos recién preparados con PBS isotónica, pH 7,4, hasta que el color del sobrenadante se volvió transparente. Los eritrocitos lavadas se diluyeron a un volumen final de 20 ml con el mismo tampón. muestras de péptido (10 l), diluidos en serie en PBS, se añadieron a 190 l de la suspensión celular en tubos de microcentrífuga. Después de mezclado suave, los tubos se incubaron a 37 ° C durante 30 min y después se centrifugaron a 4000 xg durante 5 min. El sobrenadante (100 l) se separó a un nuevo tubo y se determinó la absorbancia a 567 nm. La densidad óptica relativa, en comparación con la de la suspensión de células tratadas con 0,2% Triton X-100, se define como porcentaje de hemólisis. El porcentaje de hemólisis se calculó usando la siguiente ecuación: porcentaje de hemólisis = [(Abs
567 nm en la solución de péptido - Abs
567 nm en PBS) /(Abs
567 nm en 0.2% de Triton X-100 - Abs
567 nm en PBS)] x 100

Caracterización del péptido de captación
placas
Para evaluar la internalización de los péptidos marcados con FITC, se sembraron células HeLa en 12 pocillos a. una densidad de 2 x 10
5 células por pocillo y se incubaron durante 24 h. péptidos marcado con FITC, a varias concentraciones que van desde 2 a 10 mM, se incubaron con las células durante 30 min a 37 ° C. Para comparar la absorción celular de los péptidos, el cáncer y las células normales fueron tratados con los péptidos marcados con FITC (cada uno, 10 mM) y se incubó durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo para eliminar el exceso de complejos extracelulares. A continuación, las células se trataron con tripsina (1 mg /ml) durante 10 min para eliminar cualquier resto de péptidos unidos a la superficie celular. Después de tripsinización, las células se recogieron por centrifugación (1000 x g durante 5 min), se resuspendieron con 500 l enfriado en hielo 2% FBS /PBS que contiene yoduro de propidio (PI), y luego se analizaron inmediatamente (10.000 eventos /muestra) por activadas por fluorescencia clasificación de células (FACS).

Para comprender mejor el mecanismo de penetración celular de los péptidos, se examinaron los efectos de la temperatura y los inhibidores metabólicos. Para dilucidar la dependencia de la temperatura, las células HeLa se incubaron a 4 ° C durante 30 min antes de la adición de los péptidos. A continuación, las células se trataron con los péptidos marcados con FITC (cada uno, 5 M) a 4 ° C durante 30 min. Para el estudio de energía-agotamiento, las células HeLa se preincubaron con azida de sodio (NaN
3, 10 mM) a 37 ° C durante 1 h y después se incubaron con los péptidos marcados con FITC (cada uno, 5 mM) a 37 ° C durante . 30 min

para estudiar el papel de la endocitosis en la captación de péptido, las células fueron pretratadas con varios inhibidores de la endocitosis a 37 ° C durante 1 h: (i) amilorida (5 mM), que se sabe que bloquea macropinocytosis por la inhibición de un canal de sodio; (Ii) nocodazole (100 ng /ml), que inhibe la ruta mediada por clatrina; y (iii) metil-ß-ciclodextrina (MßCD, 5 mM), que inhibe los procesos de balsa de lípidos mediada por el agotamiento de colesterol de la membrana plasmática [29]. Todos los inhibidores se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO).

Para examinar los efectos de los componentes de carga negativa en la superficie celular para la internalización de péptidos, las células HeLa se trataron previamente con gangliósidos (monosialogangliósido GM3 a partir de sangre canina), sulfato de heparina, o el ácido siálico (Neu5Ac, todos de Sigma) (20 mg /ml) durante 30 min. Para la inhibición de la biosíntesis de gangliósidos, las células fueron pretratadas con D-
treo
-1-fenil-2-hexadecanoil amino-3-morfolino-1-propanol (PPMP, 5 mM) durante 48 h.

Por todas estas condiciones experimentales, citometría de flujo análisis se realizaron con células vivas utilizando un Becton Dickinson FACSCalibur citómetro de flujo (BD Biosciences, San Diego, CA). En cada caso, se adquirió la fluorescencia de 10.000 células viables. Las células viables fueron con acceso basado en una dispersión hacia los lados y hacia adelante. Para el análisis de datos, software WinMDI se utilizó (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA). La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student en un intervalo de confianza del 95%.

Clonación y expresión de proteínas de fusión de péptido-

Para emplean BR2 como un vehículo para la entrega de proteínas terapéuticas, un ADNc del gen de fragmento variable de Y13-259 de una sola cadena (scFv) se sintetizó en Bioneer (Daejeon, Corea). Los genes tat o fusionado-BR2 Y13-259 scFv se obtuvieron mediante PCR recombinante. Los ADNc recombinante que codifican el anti-Ras scFv, Tat-scFv y fusiones BR2-scFv fueron digeridos con
Nco I y

EcoR
I (ambas de New England Biolabs, Beverly, MA), y clonado en el
Nco I y

EcoR I
sitios de pET21c, produciendo pscFv, pTat-scFv y scFv-pBR2, respectivamente. Anti-Ras scFv, Tat-scFv y scFv-BR2 proteínas de fusión se expresaron en
E. coli
Origami (DE3) después de la inducción con IPTG 0,1 mM durante 4 horas a 37 ° C. Las células se recogieron por centrifugación a 3000 xg durante 15 min a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en tampón de fosfato (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); Las células se rompieron mediante sonicación a 4 ° (instrumentos de B. Braun, Allentown, PA) C. Se añadió el fluoruro de fenilmetilsulfonilo inhibidor de la proteasa (PMSF, 1 mM) antes de la sonicación. Las fracciones solubles e insolubles se separaron por centrifugación a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C. El sedimento que contenía los cuerpos de inclusión se resuspendió en tampón de lavado (20 mM Tris-HCl, EDTA 5 mM y 1% de Triton X-100, pH 8,0) y se centrifugó a 8.000 xg durante 10 min a 4 ° C.

Los cuerpos de inclusión lavados fueron desnaturalizados y se solubilizaron en tampón de lisis (tampón de 0,3% de sarcosina de N-lauroil, 50 mM CAPS, y 0,3 M NaCl, pH 11,0) durante 3 h y se centrifugaron a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C . Todas las proteínas fueron purificados por afinidad mediante el uso de la resina de Ni-agarosa AIF (biotecnología ELPIS, Daejeon, Corea). En resumen, el Ni-AIF-Enlazar Su resina se empaquetó en una columna equilibrada con tampón (idéntico al tampón de lisis) de unión. El sobrenadante se aplicó lentamente a la columna, después de lo cual se aplicó lavar tampón (0,3% N-lauroil sarcosina, 50 mM tampón CAPS, NaCl 150 mM, e imidazol 30 mM, pH 11,0). Las proteínas se eluyeron con tampón de elución (0,3% N-lauroil sarcosina, 50 mM tampón CAPS, NaCl 150 mM, e imidazol 250 mM, pH 11,0) y se analizaron mediante 10% de SDS-PAGE. Las proteínas eluidas se replegaron por diálisis en PBS que contenía NaCl 200 mM, 10% de glicerol, mM GSH 1, GSSG 0,2 mM y 0,4 M arginina con reducción gradual del pH (pH 10, pH 9, pH 8 y pH 7,4). Cada etapa de diálisis se realizó a 4 ° C durante 12 h contra 20 × volumen de la muestra para eliminar el detergente completamente.

Western Blotting

Para controlar la captación intracelular péptido mediada por proteínas scFv, la proteínas de fusión internalizadas se examinaron mediante transferencia Western. células HCT116 (1 × 10
6) fueron tratados con PBS, scFv purificado, Tat-scFv, o proteínas de fusión scFv-BR2 (cada uno, 2 M) durante 2 horas a 37 ° C. Después, las células se lavaron dos veces con PBS (4 ° C), raspado en 0,5 ml de PBS y se centrifugó a 1.000 × g a 4 ° C durante 5 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 l de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na 1
2EDTA, mM EGTA 1, 1% de Triton, pirofosfato de sodio 2,5 mM, beta 1 mM glicerofosfato, mM Na 1
3Vo
4, 1 mg /ml de leupeptina y 1 mM PMSF (Cell Signaling Tech., Danvers, MA) y se mantuvo en hielo durante 30 min. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 12.000 × g a 4 ° C durante 15 min y se recogieron los sobrenadantes. las concentraciones de proteína en los extractos de células se determinaron por el método de Bradford [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 g de proteína de los extractos de células se fraccionó en un gel de SDS-PAGE 10%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia (glicina 192 mM, 25 mM Tris-HCl, pH 8,8, y 20% de metanol [v /v]) mediante electrotransferencia. Después de bloquear con leche descremada al 5% durante 1 h, la membrana se incubó con un anticuerpo anti-His primaria 1:1,000 diluido (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), se lavó tres veces con TTBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, y 0,5% de Tween-20), y se incubaron posteriormente con un anti-anticuerpo secundario de conejo conjugado con peroxidasa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) en la leche que contiene TTBS durante 1 h. Después del lavado final, la membrana se expone a continuación, y las bandas de proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia (ORO WESTSAVE; AbFrontier, Seúl, Corea).

Ensayos de proliferación celular (ensayo MTT)

Para evaluar la actividad anti-proliferativa de péptidos y proteínas de fusión anti-Ras scFv, las células HCT116 (K-ras células mutadas) se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células /pocillo en 100 l de DMEM suplementado con 10% de FBS y se cultivaron durante 24 h a 37 ° C. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con scFv o proteínas de fusión de péptido-scFv (0, 0,5, 1 y 2 M) y se incubaron durante otras 24 h. La viabilidad celular se midió con el ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil (MTT) utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96® no radiactivos (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia de la solución se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad). La viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células viables tratadas con scFv o proteínas de fusión de péptido-scFv en comparación con el control tratado con PBS (100%). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Detección de la apoptosis

células HCT116 (1 × 10
6 /pocillo en una placa de 6 pocillos) fueron tratados con scFv de péptidos fusionados (cada , 2 M) o un conocido inductor de la apoptosis estaurosporina (0,5 M) durante 24 h a 37 ° C y los extractos celulares se prepararon como se describe anteriormente. poli escindido (ADP ribosa) polimerasa (PARP), un indicador de la apoptosis, se detectó mediante transferencia de Western como se describe anteriormente. Los anticuerpos anti-PARP y anti-α-tubulina (Cell Signaling Tech.) se utilizaron a una dilución 1:1,000 como los anticuerpos primarios, mientras que de rábano picante IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) se utilizó a una . dilución 1:10,000 como anticuerpo secundario

Además, las células apoptóticas se identificaron mediante tinción con anexina V-FITC (150 ng /ml) y 7-amino actinomicina D (7-AAD; BD Biosciences, San Diego, CA). 1 × 10
6 células HCT116 se trataron con PBS, estaurosporina (0,5 M), o scFv de péptidos fusionados (cada uno, 2 M) como se describe anteriormente. A la hora designada, las células se lavaron dos veces con PBS (pH 7,4), se recogieron y se resuspendieron en 500 l de tampón de unión suplementado con fluos Anexina-V (1:100 diluido; BioBud, Seúl, Corea), y se incubaron durante 15 min a 25 ° C en la oscuridad. Para detectar necrosis, 7AAD se añadió antes de la medición. Las muestras se sometieron inmediatamente a un análisis FACS con un citómetro de flujo FACSCalibur (FL1 y FL3) y software WinMDI (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 × 10
4 células por muestra se analizaron por citometría de flujo.

Ras Ensayo de Activación

Para estudiar la supresión dependiente de la proteína de fusión de péptido-scFv de la actividad de Ras, el nivel de Ras -GTP (forma activa) se midió utilizando un kit de ensayo de activación de Ras (Millipore, Billecia, MA) según las instrucciones del fabricante. Este método se basa en una unión selectiva de Ras-GTP utilizando el dominio de unión a Ras (RBD) de Raf-1 (una quinasa aguas abajo de Ras) que no puede enlazar Ras-PIB (forma inactiva). Brevemente, 50 l de proteína RBD fusionados a glutatión transferasa (GST) se revistió sobre una placa de 96 pocillos glutatión recubierto a 4 ° C durante 1 h y se lavó con TBST (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween -20, pH 7,6). células HCT116 se trataron con scFv, Tat-scFv, o BR2-scFv para 1 o 2 h, después de lo cual las células se lisaron usando 1 × Mg
2 + de lisis /tampón de lavado (Millipore). La concentración de proteínas se calculó por el ensayo de Bradford. Los lisados ​​celulares que contienen 50 g de proteína se incubaron durante 1 h en las RBD-GST-revestido los pocillos a 25 ° C. Después de lavar tres veces con TBST, se añadió solución de anticuerpo primario y se incubó a 4 ° C durante 1 h. Después de lavar con TBST, se añadió el anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP secundaria y se incubó a 25 ° C durante 1 h. Después de un lavado final con TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6), se añadieron 50 l de los sustratos quimioluminiscentes a cada pocillo. señales de quimioluminiscencia de cada pocillo fueron controlados mediante el luminómetro Berthold (MicroLumat LB96P; Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Los resultados se expresaron como la actividad de Ras relativa.

Resultados

BR2 internaliza eficazmente en diversas líneas celulares de cáncer sin citotoxicidad para las células normales

La captación celular y la distribución intracelular de los péptidos diseñados , BR1 y BR2, se estudiaron mediante microscopía confocal. BR2 se internaliza fácilmente en células cancerosas (HeLa, HCT116 y B16 /F10) dentro de 30 min y se distribuye por todo el citoplasma y el núcleo de las células cancerosas (Fig. 1A). Sin embargo, fue muy mal internaliza en las células normales (HaCat, BJ y NIH 3T3) bajo las mismas condiciones experimentales. Por el contrario, BR1 muestra niveles de captación celular insignificantes en el cáncer y las células normales, lo que indica que no podía trasladar a través de la membrana celular (Fig. 1A). La fluorescencia de las células tratadas con Tat también se detectó claramente tanto en el núcleo y el citoplasma de cáncer y células normales. Más Tat acumula en el núcleo de citoplasma, mientras que la mayoría BR2 se distribuye de manera uniforme en las regiones intracelulares (Fig. 1A).

(A) la distribución intracelular de péptidos marcados con FITC examinadas por microscopía láser confocal. Tanto las células cancerosas (HeLa, HCT116 y B16 /F10) y las células normales (HaCat, BJ y NIH 3T3) se sembraron en placas de 6 pocillos 1 día antes del experimento para alcanzar el 70% de confluencia. Las células se incubaron con los péptidos marcados con FITC (5 mM) durante 30 minutos a 37 ° C y se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). a continuación, la distribución de péptidos se analizó utilizando un confocal de barrido LSM 510 microscopio láser equipado con un 40 × objetivo. (B, C)
in vitro
citotoxicidad de los péptidos. perturbación (B) de la membrana se midió por lactato deshidrogenasa de fuga (LDH) a partir de las líneas celulares indicadas 24 h después del tratamiento de péptidos. fuga de LDH de las células sembradas en una placa de 96 pocillos a 10.000 células /pocillo se midió después de la exposición a 1, 2, 5, 10, 20, 50 o 100 mM péptidos de 24 h. la liberación de LDH de las células tratadas con PBS era considerado como 0% de fuga y LDH liberada de 0,2% X-100 células tratadas como Triton 100% de fuga. (C) La actividad hemolítica de cada péptido contra eritrocitos humanos se analizó en concentraciones graduadas (0-200 mM) y se compara con un Triton X-100 0,2% de control positivo, por el que se definió hemólisis como 100%. Las barras de error en todas las figuras representan los errores estándar de las medias (n = 3).

Para evaluar la
in vitro
citotoxicidad de los péptidos diseñados, la pérdida de LDH se midió en líneas celulares de cáncer (HeLa, HCT116 y B16 /F10) y líneas de células normales (HaCat, BJ y NIH 3T3). tratamiento BR2 (20-100 M) se asoció con la pérdida de LDH de las células cancerosas; la fuga aumenta gradualmente con concentraciones BR2, llegando a alrededor de 40-60% a los 100 M (Fig. 1B
a-c
). Sin embargo, LDH fugas de las células normales tratadas con BR2 no se detectó en concentraciones por debajo de 70 BR2 mu M, y se observó una fuga débil (~ 17%) en 100 mM (Fig. 1B

d-f). BR3 indujo pérdida de LDH sustancial tanto de cáncer (aprox. 80-90%) y las líneas de células normales (aprox. 30%), incluso a 50 mM (Fig. 1B

a-f).

Para examinar la citotoxicidad de los péptidos más, también se examinó la actividad hemolítica del BR1, BR2, BR3 y Tat contra eritrocitos humanos. De acuerdo con los resultados de fuga de LDH, no se indujo ninguna hemólisis incluso después de los eritrocitos fueron tratadas con Tat, BR1 o BR2 en ≥200 mu M, mientras que BR3 provocó la hemólisis (≥5%) a ≥25 mu M (Fig. 1C). Posteriormente sobre 34,3% de los eritrocitos se lisaron después de ser tratado con 200 mM BR3. Tomados en conjunto, estos resultados indican que BR2 penetra eficazmente células cancerosas sin efectos citotóxicos en las células normales, mientras que Tat mostró similar penetración en ambos tipos de células.

BR2 Penetra específicamente a las células cancerosas en un función de la concentración

Para comparar la cantidad de los péptidos internalizados en diferentes tipos de células, se realizó un análisis de citometría de flujo. BR2 fue interiorizado de manera más eficiente en las células cancerosas (HeLa, HCT116 y B16 /F10) que en las células normales (HaCat, BJ y NIH 3T3); más de 95% de las células cancerosas tratadas con BR2 BR2 internalizado, mientras que sólo el 23-34% de las células normales tratadas con BR2 hizo. Sin embargo, Tat penetrado el cáncer y las células normales sin mucha discriminación (Fig. 2A). penetración específica de BR2 y Tat en células cancerosas también se analizó en presencia de ambas células de fibroblastos HeLa y BJ por microscopía láser confocal. BR2 fue preferentemente especialmente captado por las células HeLa, mientras que la captación celular de Tat fue similar en ambos células de fibroblastos HeLa y BJ (Fig. S1). Estos resultados muestran claramente que el BR2 buforin-derivado tiene la especificidad de células de cáncer, mientras que Tat no lo hace.

(A) Análisis de la eficiencia de penetración de células de cada péptido en diferentes tipos de células por citometría de flujo. Marcado con FITC Tat, BR1 y BR2 péptidos (10 mM) se añadieron a diferentes tipos de células: HeLa, HCT116 y células de cáncer /F10 B16 y HaCat, BJ y NIH 3T3 células normales. Después de 30 min de incubación a 37 ° C, las células FITC positivas se contaron mediante citometría de flujo. Los valores representan el porcentaje de células con fluorescencia positiva en la población celular total. (B) La evaluación cuantitativa de la penetración celular de cada péptido por citometría de flujo. Las células HeLa se incubaron con los péptidos marcados con FITC, a concentraciones de 1, 2, 5, o 10 m para 30 min a 37 ° C. Después las células se lavaron con PBS frío y se recogieron y la fluorescencia celular se analizó mediante citometría de flujo. Las células de control no recibieron tratamiento péptido. Antes del análisis, la fluorescencia extracelular de péptidos unidos a la superficie se eliminó mediante un tratamiento con tripsina (1 mg /ml durante 10 min).

La intensidad de fluorescencia de las células tratados con péptido se mejoró con concentraciones crecientes de BR2 o Tat. A concentraciones superiores a 5 M, BR2 entró en más de 80% de las células HeLa dentro de 30 min (Fig. 2B). BR2 células penetraron más eficientemente que lo hizo el péptido Tat en cada concentración ensayada. Además, BR2 internalización para todas las líneas celulares de cáncer (HCT116 y B16 /F10, los datos no se muestran) que parecía ser homogénea en toda la población de células como un solo pico en el histograma. Entre los péptidos, BR1 está representada la captación más baja, lo que indica su incapacidad para penetrar la membrana celular, incluso a 10 mM.

interacción electrostática inicial con BR2 cargados positivamente y negativamente cargados gangliósidos en la membrana celular del cáncer es esencial para la Energía la endocitosis dependiente de BR2

el mecanismo de captación celular de BR2 se analizó con células HeLa, la línea celular de cáncer más representativo y ampliamente utilizado, para comparar con los de otros péptidos que penetran en las células. Primero examinamos el efecto de la temperatura sobre la penetración BR2. La reducción de la temperatura reducida drásticamente la captación de péptido en células HeLa (Fig 3A.); la captación celular de BR2 y Tat a 4 ° C se redujo en 88,5% y 31,6%, respectivamente, en comparación con la observada a 37 ° C. Además, también se observó una absorción dependiente de la energía de los péptidos cuando la piscina ATP celular se agota por la preincubación de las células con azida de sodio (NaN
3). agotamiento de ATP también redujo la absorción de BR2 y Tat en células HeLa, por 67,7% y 42,5%, respectivamente (Fig. 3A). Estos resultados apoyan la implicación de la endocitosis para la absorción BR2 y Tat.

(A) Efectos de la baja temperatura y agotamiento de la energía en la internalización de los péptidos marcados con FITC en células HeLa. Las células HeLa se preincubaron ya sea a 4 ° C o pretratados con azida de sodio (NaN
3) para agotar ATP durante 1 h, y después se incubaron con 5 M Tat o BR2 de 30 min en las mismas condiciones, como se describe en Materiales y métodos. la absorción del péptido se determinó por citometría de flujo. (B) Los efectos de los inhibidores de endocitosis en la entrada de BR2 y Tat. La influencia de los fármacos inhibidores de la captación de péptido se determinó por preincubación de las células HeLa con los inhibidores de endocitosis nocodazol, amilorida o metil-ß-ciclodextrina para 1 h antes de la adición de los péptidos marcados con FITC. Después del tratamiento de péptido durante 30 minutos a 37 ° C, las células FITC positivas se contaron mediante citometría de flujo. Los valores representan el porcentaje de células con fluorescencia positiva en la población celular total. Los datos representan la media ± s.d. de tres experimentos independientes. (C) colocalización de BR2 con el marcador lisosomal LysoTracker rojo DND-99 en células HeLa vivo. Después de 30 min de incubación de BR2 (5 M) con LysoTracker, imágenes de células HeLa en vivo se obtuvieron por microscopía confocal. (D) Efectos de moléculas cargadas negativamente (gangliósidos, heparinas, y ácidos siálicos) sobre la captación de péptido. (A, b) las células HeLa se trataron con BR2 y Tat en presencia de gangliósidos, heparinas, o ácidos siálicos (cada uno, 20 mg /ml) durante 30 min. En (c, d), las células HeLa se trataron previamente con PPMP (5 M) para agotar los gangliósidos. La captación celular de BR2 y Tat se determinó por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT.

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