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PLOS ONE: una mayor expresión de la proteasa del receptor activado por 4 y 2 en trébol Factor Humano colorrectal Cancer

2013/4/7


Extracto
receptor activado por proteasa
4 (PAR4), un miembro de la familia de la proteína G receptores acoplados, fue recientemente informado que muestran una disminución de la expresión en el cáncer gástrico y el cáncer escamoso de esófago, sin embargo, el aumento de expresión durante la progresión del cáncer de próstata. factor trébol 2 (TFF2), un pequeño péptido constitutivamente expresado en la mucosa gástrica, juega un papel protector en la restitución de la mucosa gástrica. TFF2 expresión alterada también se relaciona con el desarrollo de cáncer gastrointestinal. TFF2 se ha verificado para promover la migración celular a través de PAR4, pero las funciones de PAR4 y TFF2 en el progreso del cáncer colorrectal son todavía desconocidos. En este estudio, el nivel de expresión de PAR4 y TFF2 en tejidos de cáncer colorrectal se midió usando PCR en tiempo real (n = 38), Western Blot (n = 38) y microarrays de tejidos (n = 66). Los niveles de mRNA y expresión de proteínas de PAR4 y TFF2 se incrementaron notablemente en el cáncer colorrectal en comparación con los tejidos no cancerosos coincidentes, especialmente en los ganglios linfáticos positivos y cánceres pobremente diferenciados. La célula de carcinoma colorrectal LoVo mostró un aumento en respuesta a TFF2 según la evaluación de la invasión de células después de la expresión PAR4. Sin embargo, después de la intervención de expresión PAR4, PAR4 celular de carcinoma colorrectal positivo HT-29 fue menos sensible a TFF2 en la invasión celular. secuenciación de bisulfito genómico mostró la hipometilación del promotor PAR4 en tejidos de cáncer colorrectal y la hipermetilación en la mucosa normal que sugirió la baja metilación del promotor se correlacionó con el aumento de la expresión PAR4. Tomados en conjunto, los resultados demostraron que la expresión arriba regulada de PAR4 y TFF2 se produce con frecuencia en tejidos de cáncer colorrectal, y que la sobreexpresión de PAR4 puede ser el resultado de promotor hipometilación. Mientras TFF2 promueve la actividad invasión de las células LoVo que sobreexpresan PAR4, y este efecto se redujo significativamente cuando se PAR4 knockdowned en células HT-29. Nuestros resultados serán útiles para nuevas investigaciones sobre las funciones y los mecanismos moleculares de los receptores activados por proteinasa (PAR) y los factores factor trébol (TFFS) durante la progresión del cáncer colorrectal

Visto:. Yu G, P Jiang, Xiang Y, Zhang Y, Zhu Z, Zhang C, et al. (2015) El aumento de la expresión del receptor activado por proteasa del trébol de 4 y el factor 2 en el cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10.1371 /journal.pone.0122678

Editor Académico: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, CHINA

Recibido: 4 de Junio, 2014; Aceptado: February 24, 2015; Publicado: 13 Abril 2015

Derechos de Autor © 2015 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (81160302, 31270835), la Academia de Ciencias de china (KJZD-EW-L03), la provincia de Yunnan Ciencia y Tecnología Departamento Fundación de Investigación básica (2011FZ109) y el Laboratorio Estatal de recursos de genética y Evolución (GREKF11-13)

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

La progresión del cáncer colorrectal es un proceso de múltiples pasos implicados en alteraciones en poligenéticos prooncogenes y /o genes supresores de tumores, y la regulación epigenética de los genes aberrantes puede conducir a un crecimiento anormal de los tumores malignos [1,2]. PAR son siete transmembrana receptores acoplados a la proteína G (GPCR) que comprende cuatro miembros nombrados PAR1, PAR2, PAR3 y PAR4 [3]. Como tener la capacidad de degradación de proteínas de matriz extracelular, PARs sirven como moléculas de señales implicados en la migración de células tumorales, invasión y metástasis [4]. PAR1, que se expresa ampliamente en los cánceres, promueve la génesis de tumores y la invasión de células de cáncer de mama y las células colorrectales [5,6]. PAR2, sobreexpresa en cáncer de próstata, próstata promueve la migración de células de cáncer [7]. Por el contrario, PAR2 también mostró un papel-tumor de protección en la carcinogénesis de la piel [8]. PAR3 se encontró en el riñón y cáncer de hígado [9,10]. expresión PAR4 se detecta fuertemente en el pulmón, tiroides, páncreas, intestino delgado y testículos por transferencia Northern [11]. Sin embargo, la expresión y los posibles roles de PAR4 en la tumorigénesis son todavía desconocidos. PAR4 expresión estaba ausente en la mucosa del colon normal, pero parecía evidente en la tinción displásicas y mucosa colorectalous. PAR4 ARNm se encontró en 10 de 14 (71%) las líneas celulares de carcinoma colorrectal humano [12].

factores trébol (TFFS), ampliamente expresadas en la mucosa del tracto gastrointestinal, son péptidos pequeños y compactos que contienen uno o dos dominios en trébol. Tres factorías francas estrechamente relacionados son conocidos en humanos, pS2 (TFF1), polipéptido espasmolítico (SP o TFF2), y el factor trébol intestinal (ITF o TFF3) [13]. péptidos TFFS se cree que contribuyen a la curación de la mucosa y la restitución en virtud de la promoción de la migración celular y la supresión de la apoptosis [14]. Factorías francas también están implicados en la tumorigénesis [15]. TFF2, que contiene dos dominios en trébol, se cree que es el principal factor trefoil citoprotectora en el estómago, y el nivel de expresión de TFF2 fue desregulado en la úlcera gástrica y el tejido de cáncer [16]. En nuestra investigación reciente, TFF2 se ha demostrado que la promoción de la migración de células epiteliales y la cicatrización de heridas a través de PAR4 involucrado fosforilación de ERK1 /2 [17], pero las funciones de detalle y mecanismos moleculares de PAR4 y TFF2 en la progresión de tumor gastrointestinal no se han descubierto . En el estudio, mostramos los niveles de expresión de PAR4 y TFF2 se incrementaron en tejidos de cáncer colorrectal en comparación con la mucosa no canceroso emparejado, y la expresión de la regulación de PAR4 en los cánceres colorrectales pueden ser el resultado de la hipometilación del promotor. Por otra parte, nuestros datos muestran que TFF2 promueve la invasión de células de cáncer colorrectal mediante la activación de PAR4.

Materiales y Métodos

Ética declaración

El estudio fue aprobado por el Instituto de Zoología de Kunming, la Academia china de Ciencias y la Universidad de Medicina de Kunming. escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes antes de la obtención de muestras para este estudio.

Los sujetos del estudio

Un total de 38 pacientes con cáncer colorrectal, que accedió a participar en nuestro estudio, firmaron el consentimiento informado formar y recibió las operaciones en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Kunming. especímenes de cáncer colorrectal se obtuvieron a partir de tejidos de tumor colorrectal y las zonas no cancerosas adyacentes, que eran al menos 6 centímetros de la tumor. Los tejidos recogidos se verificaron adicionalmente por histología y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. microarrays de tejidos de cáncer colorrectal en representación de 66 cánceres colorrectales con sus márgenes de resección no neoplásicas construye [18] eran de Shanghai aventajan Centro biochip (Shanghai, China).

La extracción de RNA y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

la extracción de RNA y el primer capítulo de síntesis de ADNc se realizó como se describe anteriormente [19]. Por semi-cuantitativos de RT-PCR y PCR en tiempo real, los cebadores utilizados fueron los siguientes: los cebadores para PAR4 (147 producto bp) fueron 5'-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 '(hacia delante) y 5'-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3' (inverso ); para TFF2 (74 bp producto) fueron 5'CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 '(hacia delante) y 5'-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3' (hacia atrás); y para el control interno de gliceraldehído deshidrogenasa 3-fosfato (GAPDH, 107 bp producto), fueron 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 '(hacia delante) y 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3' (hacia atrás). Después de RT-PCR, los amplicones de PAR4, TFF2 y GAPDH se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%, se tiñeron con bromuro de etidio y se observa bajo la iluminación ultravioleta.

Quantitative PCR se realizó con un detector de fluorescencia continua (Opticon monitor, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las reacciones de PCR para PAR4, TFF2 y GAPDH se realizaron con un verde en tiempo real kit PCR SYBR (Takara, Dalian, China) con la condición de: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C para 15 s, 60ºC durante 15 s, y 72 ° C durante 20 s. Cada muestra se realizó por triplicado. No hay controles de plantilla (sin cDNA en la PCR) se llevaron a cabo para detectar la amplificación no específica o genómica y la dimerización de cebador. análisis de la curva de fluorescencia se llevó a cabo utilizando software Opticon Monitor. Relativa evaluación cuantitativa de PAR4 y los niveles de expresión TFF2 se realizaron por E-método y se expresa como una proporción de la transcripción de PAR4 (TFF2) para GAPDH en el tejido tumoral. Las identidades de RT-PCR y los productos de PCR en tiempo real fueron confirmados por secuenciación del ADN.

Se realizó inmunohistoquímica de tejidos

inmunohistoquímica de tejidos como se describe anteriormente [12]. En resumen, la recuperación de antígeno se llevó a cabo por calentamiento en un autoclave a 121 ° C durante 5 min. Dewaxed secciones se preincubaron con suero de bloqueo y después se incubaron a 4 ° C durante la noche con el anticuerpo PAR4 anti-humana (C-20, 1: 1200; Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) y el anticuerpo TFF2 anti-humano (P -19, 1: 800; Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.), respectivamente. La unión específica se detecta mediante un kit de ensayo de estreptavidina-biotina-peroxidasa (Maxim, Fujian, China). La sección se counterstained con hematoxilina de Harris. micrografías microscópico directo se capturaron usando una cámara Leica DFC320 controlado por software Leica IM50 (Leica, Alemania). Secciones incubadas con IgG de cabra normal se sirvieron como control negativo. La especificidad de los anticuerpos para PAR4 y TFF2 se confirmó por pre-incubación durante la noche a 4 ° C con sus respectivos antígenos (Santa Cruz) en un exceso molar de 20 veces de antígeno a los anticuerpos. Pre-incubación con antígeno PAR4 y TFF2 dio lugar a una ausencia de immunolabeling
.
La tinción inmunohistoquímica se evaluó semi-cuantitativamente midiendo tanto la intensidad de la tinción (0, 1, 2, o 3) y el grado de tinción (0, 0%; 1, 0 a 10%; 2, 10 a 50%; 3, 50 a 100%). Las calificaciones de la intensidad y extensión de la tinción se multiplicaron para dar una puntuación ponderada para cada caso (máximo posible, 9). Para el análisis estadístico, las puntuaciones ponderadas se agruparon en dos categorías en las puntuaciones de 0-3 se consideraron negativos y positivos 4-9 [20].

Western blot

Las muestras de tejido se homogeneizaron en Radioimmunoprecipitaion tampón de ensayo (Sigma) que contenía cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma). La concentración de proteína se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad). Las muestras (que contienen 30 g de proteína) se cargaron en un SDS-poliacrilamida electroforesis en gel de gel (SDS-PAGE) y después se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas se bloquearon a continuación con albúmina de suero bovino 3% (BSA) y se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios apropiados PAR4 y TFF2, respectivamente. Las proteínas se visualizaron con reactivos Súper Señal (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).

secuenciación de bisulfito

El ADN genómico de los cánceres colorrectales y tejidos no neoplásicos se aisló con el kit universal Extracción de ADN genómico (Takara) y bisulfito convierte-usando el kit de modificación de ADN rápida CpGenome (Chemicon). secuencias promotoras PAR4 se amplificaron a partir de ADN con bisulfito convertido por PCR, se purificaron a partir de geles de agarosa y se subclonó en el pMD19-T Vector (Takara). Para cada muestra, se secuenciaron 19 clones individuales para identificar los residuos de citosina metilados. secuencias de los cebadores de PCR (avance y retroceso) para PAR4 fueron 5'-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 'y 5'-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3'.

Cultivo de células

líneas celulares de cáncer colorrectal humano LoVo y HT- 29 eran de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las células LoVo que sobreexpresan PAR4 (LoVo-PAR4) y las células transfectadas con un plásmido mock (LoVo-mock) fueron seleccionados por 800ug /ml de G418 de acuerdo con nuestros estudios previamente [17]. células LoVo se cultivaron en medio F12 de Ham suplementado con 10% de suero (v /v) fetal bovino, 100 U /ml de penicilina y 100 U /ml de estreptomicina y se cultivaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 a 37 DO. Para el tratamiento con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC; Sigma, 95 St. Louis, MO, EE.UU.), las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
6 en una placa de 60-mm . Después de 24 h, las células se trataron con 10 mM de 5-Aza-dC. DMSO se trató en paralelo como control. Se recogieron las células totales después de 72 horas de la adición de 5-aza-DC y se sometieron a RT-PCR y análisis de Western Blot.

Desmontables de PAR4 en células HT-29

lentivirus expresar shRNA fueron generados por co-transfección de plásmidos PAR4 shRNA con dvpr pCMV-dR8.2 y pCMV-VSVG envasado de plásmidos en 293FT células. Se seleccionaron las células HT-29 transfectadas con vector vacío pGIPZ pGIPZ-shPAR4 o con 5 mg /ml de puromicina para generar HT-29-shPAR4 y HT-29-pGIPZ, respectivamente. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero (v /v) fetal bovino, 100 U /ml de penicilina y 100 U ml de estreptomicina

invasión de células

actividades /. Invasión de LoVo- células simuladas y LoVo-PAR4, y HT-29-pGIPZ y células HT-29-shPAR4 in vitro se midieron usando el ensayo de invasión Matrigel [21]. La célula InnoCyte Invasion Assay Kit (8 micras de poro, Calbiochem, MERCK) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 5 × 10
4 células de LoVo-maqueta, LoVo-PAR4, HT-29-pGIPZ y HT-29-shPAR4 se añadieron respectivamente a la cámara superior, y se añadió medio que contenía TFF2 recombinante a la cámara inferior. Después de la incubación de 24 horas a 37 ° C, la suspensión de células se desecharon y los insertos de cámara superior se colocaron suavemente en una solución de tinción de las células durante 30 min. Después de las células de la cámara inferior que contienen las células desprendidas se incubaron 30 minutos más en las mismas condiciones. Finalmente 200μL las células desprendidas se transfirieron doblemente a los pocillos de una placa de 96 pocillos, y se midió la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 ± 10 nm y una longitud de onda de emisión de 520 ± 10 nm. Mientras tanto, las células fueron fotografiados cámara inferior a través de la microscopía de fluorescencia láser confocal.

El análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) . La prueba de ji cuadrado (Tablas 1 y 2) y Mann-Whitney U texto se utiliza para la significación de las correlaciones entre PAR4 y expresión TFF2 y los parámetros clínicos patológicos. Las diferencias en los datos numéricos entre los pares de grupos se evaluaron mediante la prueba de Student pareada. El nivel de significación estadística se fijó en el nivel de
p
. & Lt; 0,05

Resultados

Los niveles de expresión de ARNm y PAR4 TFF2 aumentó en tejidos de cáncer colorrectal

La expresión de PAR4 y TFF2 mRNA en tejidos colorrectales fueron examinados por RT-PCR. Como se muestra en la figura 1A, RT-PCR se realizó en las muestras normales y cancerosas emparejados seleccionados al azar a partir de cuatro pacientes y los resultados mostraron niveles de PAR4 y ARNm TFF2 aumentó significativamente en los cánceres de los tejidos en comparación con los tejidos normales emparejados.

(A) Las normales (normales) y cancerosas (cáncer) tejidos coincidentes de cada pacientes seleccionados al azar fueron analizados por RT-PCR utilizando PAR4- y GAPDH- cebadores específicos (n = 4). Después las muestras se normalizaron a los niveles de GAPDH, los niveles de mRNA de PAR4 y TFF2 se incrementaron significativamente en cáncer en comparación con los tejidos normales; (B) transferencia de Western de lisados ​​de tejido de cuatro casos de cáncer colorrectal (cáncer) y mucosa no neoplásico adyacente relevante (normal). La expresión de actina se sirvió como control. La expresión de la regulación significativa de PAR4 se observó en los tejidos cancerosos en contraste con sus tejidos normales emparejados (n = 4).

A continuación, se examinaron los niveles de PAR4 y TFF2 mRNA en 38 colorrectal muestras de cáncer por PCR en tiempo real. El hasta reguladas de PAR4 y TFF2 en tumores colorrectales fueron 58% (22 de 38) en comparación con la mucosa no neoplásica emparejado. Además, examinó la importancia clínica de expresión hasta reguladas en los datos patológicos de la clínica. No hubo diferencias significativas de expresión PAR4 y TFF2 ARNm en tumores invasivos en los ganglios linfáticos en comparación con los tumores no invasivos (
p = 0,016
y el texto
p = 0,002
, chi al cuadrado). La diferencia también se observó en el tumor poco diferenciado frente al bienestar /moderated- tumores diferenciados (
p = 0,002
y
p = 0,020
, chi al cuadrado de texto) (Tabla 1). En detalles, PAR4 ARNm se incrementó en 2.2 (1.8, 4.7) (cuartil 25, cuartil 75) se pliega en 14 tumores invasivos en los ganglios linfáticos y el 1,0 (0,4, 2,0) Se pliega en 24 tumores no invasivos (
p
= 0,008, Mann-Whitney U texto); TFF2 ARNm se incrementó en 3.2 (2.2, 7.6) se pliega en los tumores invasivos 14 ganglios linfáticos y 0,8 (0,3, 1,5) Se pliega en 24 tumores no invasivos (
p = 0,001
, U de Mann-Whitney texto) (Fig 2A). Por otra parte, PAR4 ARNm se incrementó en 2.3 (2.0, 3.8) se pliega en 16 tumores diferenciados de los pobres y 0,9 (0,5, 1,2) Se pliega en 22 bienestar /moderated- cánceres diferenciados (
p = 0,001
, Mann -Whitney texto de U); TFF2 ARNm se incrementó en 2.2 (1.8, 5.8) se pliega en 16 tumores diferenciados más pobre y el 0,8 (0,3, 1,5) Se pliega en 22 de pozos /cánceres diferenciados moderadas-(
p = 0,002
, Mann-Whitney U texto) (figura 2B).

La expresión de PAR4 y TFF2 se midió en 38 pacientes con cáncer colorrectal mediante PCR en tiempo real. (A) PAR4 ARNm se incrementó en 86% (12 de 14) los tumores invasivos de los ganglios linfáticos y el 42% (10 de 24) tumores no invasivos. TFF2 ARNm se incrementó en 93% (13 de 14) los tumores invasivos de los ganglios linfáticos y el 38% (9 de 24) tumores no invasivos. No hubo diferencia significativa de PAR4 (p = 0,008) y TFF2 (p = 0,001) la expresión del ARNm entre los tumores invasivos de los ganglios linfáticos y los tumores no invasivos; (B) PAR4 ARNm se incrementó en un 88% (14 de 16) de cáncer diferenciado de los pobres y el 36% (8 de 22) bien /cánceres diferenciados moderado. TFF2 ARNm se incrementó en un 81% (13 de 16) de cáncer diferenciado de los pobres y el 46% (9 de 22) bien /cánceres diferenciados moderado. Además, hay una diferencia significativa de PAR4 (p = 0,001) y TFF2 (p = 0,002) de expresión de ARNm entre pobres-diferenciada y bien /cánceres diferenciados moderado; veces de incremento en el tejido tumoral en relación con el tejido colorrectal no neoplásico media fue de muestra. La mediana (cuartil 25, cuartil 75) se utilizó para comparar pliegues de PAR4 aumento (TFF2) en los tumores invasivos de los ganglios linfáticos y los tumores no invasivos, y los cánceres de los pobres diferenciada y /cánceres de pozos diferenciados moderado. El aumento de los pliegues de "& gt; 1" se definen como "aumento", mientras que el aumento de pliegues de "≤1" fueron definidos como "no aumentaron"

Los niveles de proteína de PAR4 y TFF2 se incrementaron en. los tejidos de cáncer colorrectal

PAR4 y TFF2 proteínas fueron bajos o no se detectan en la mucosa colorrectal normal mediante análisis de Western Blot (figura 1B). Sin embargo, en los tejidos de pacientes con cáncer colorrectal, después de que las muestras se normalizaron a los niveles de ß-actina, un incremento en la expresión significativa de PAR4 y TFF2 se observó en los tejidos de cáncer colorrectal en comparación con los tejidos no malignos emparejados (Fig 1B).

a continuación, se realizó la tinción inmunohistoquímica para analizar los niveles de expresión de proteínas de PAR4 y TFF2
in vivo
. No había casi ninguna expresión de PAR4 y TFF2 en las células epiteliales no neoplásicas colorrectales, pero la expresión fue significativamente mayor en las células epiteliales malignos colorrectales. Además, la mayoría de PAR4 y TFF2 tinción en malignas muestras de cáncer colorrectal se localiza en el citoplasma (Fig 3). En 66 muestras analizadas, la expresión PAR4 es regulada hasta en 57 (86,1%) muestras de cáncer colorrectal en comparación con la mucosa normal correspondiente. TFF2 expresión es regulada hasta en 46 (69,7%) muestras de cáncer colorrectal. Además, las diferencias en la expresión de la proteína PAR4 y TFF2 entre los pobres diferenciada y bien /moderated- tumores diferenciados fueron significativas (
p = 0,017
y
p = 0,022
, chi al cuadrado de texto) (Tabla 2).

(a) tinción inmunohistoquímica para PAR4. (A) mucosa colorrectal normal, (B) el tejido de cáncer colorrectal del número uno del paciente. (C) el tejido de cáncer colorrectal del número dos del paciente; (B) tinción inmunohistoquímica para TFF2. (D) mucosa colorrectal normal, (E) el tejido de cáncer colorrectal del número uno del paciente; (F) el tejido de cáncer colorrectal del número dos del paciente. Bar, 100 micras para cada panel, y 50 micras para inserciones.

La sobreexpresión de PAR4 aumento de la actividad de las células LoVo invasión inducidos por TFF2

Nuestros resultados previos han mostrado que promueve TFF2 celular la migración a través de PAR4 [17]. Para investigar el papel de PAR4 en la invasión de células TFF2 inducida, se analizó el efecto de TFF2 sobre las actividades de las células LoVo invasión de forma simulada y LoVo-PAR4. Como se muestra en la figura 4A, 200 nM de TFF2 no indujo la actividad de invasión en células LoVo de forma simulada mediante el ensayo de Matrigel. Sin embargo, aumentó significativamente la actividad de invasión en células LoVo-PAR4. La microscopía confocal también mostró que la actividad de invasión de las células LoVo-PAR4 era 2 pliegues mayor que las células LoVo de forma simulada cuando son estimuladas por TFF2 (Fig 4B).

(A) la invasión de la célula estimulada por TFF2 se ensayó usando una ensayo de invasión de células InnoCyte. La invasión de LoVo-maqueta y LoVo-PAR4 células estimuladas por 200 nM TFF2 se puso a prueba, con BSA y 10 nM EGF como controles. Los resultados mostraron diferencias significativas de 200 nM TFF2 sobre la actividad de las células LoVo-invasión PAR4 LoVo-maqueta y. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05; (B) La invasión de LoVo-maqueta y las células LoVo-PAR4 estimulada por 200 nM TFF2 fueron investigados por Confnocal microscopía de fluorescencia láser.

PAR4 caída en células HT-29 disminución de la actividad en la invasión de células responden a TFF2

Se determinó el efecto de la próxima TFF2 sobre la actividad de las células de la invasión en el PAR4- knockdowned células HT-29. Como se muestra en la figura 5A, 200 nM TFF2 aumentado significativamente la actividad invasión de células HT-29-pGIPZ por ensayo de Matrigel, pero no tuvo efecto sobre las células knockdowned-PAR4. resultados de microscopía confocal también demostraron que la invasión de HT-29-pGIPZ es más de 3-4 pliegues de las células HT-29-shPAR4 cuando las células son estimuladas por TFF2 (Fig 5B). Los resultados sugieren que la invasión TFF2 inducida era PAR4-dependiente.

(A) la invasión de la célula estimulada por TFF2 se ensayó usando un ensayo de invasión de células InnoCyte. actividad invasión de células HT-29-shPAR4 HT-29-pGIPZ y se trataron con 200 nM TFF2 para evaluar la actividad invasión, BSA y 10 nM EGF se utilizaron como controles. No hubo diferencias significativas de 200 nM TFF2 sobre HT-29-pGIPZ y HT-29-shPAR4 células invasión. Los datos se presentan como medias ± SD de tres experimentos independientes, * p & lt; 0,05; (B) células invasión de HT-29-pGIPZ y HT-29-shPAR4 estimulada por 200 nM TFF2 fueron investigados por Confnocal microscopía de fluorescencia láser.

Restauración de expresión PAR4 por tratamiento de 5-Aza-doxy en las células LoVo colorrectales

Como se informó en el documento de investigación de Zhang, PAR4 no se expresa en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo de [17]. Para dilucidar el mecanismo molecular que subyace a la expresión potencial PAR4 hasta reguladas en tejidos de cáncer colorrectal, las células LoVo fueron tratados con 5-aza-DC, un agente de desmetilación. En la figura 6A y 6B, RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western mostraron que el nivel de expresión de PAR4 fue restaurada después de 3 días de tratamiento con 5-Aza-dC, y líneas celulares de cáncer colorrectal humano HT-29 que expresa PAR4 se utilizó como control.

LoVo, un no PAR4 células que expresan, se incubaron con 5-Aza-dC (10 mM) o DMSO durante 72 horas, y se utilizaron las células para extraer mRNA y proteína. (A) El nivel de expresión de PAR4 mRNA fue examinado por RT-PCR; (B) El nivel de expresión de la proteína PAR4 fue examinado por Western blot. La línea celular de cáncer colorrectal HT-29 expresó PAR4 se utilizó como control positivo.

Nivel de Análisis de metilación de la región promotora de PAR4 en tejidos de cáncer colorrectal

Debido a la desmetilación con 5- aza-dC conduce a la restauración de la expresión en células LoVo PAR4, se comparó el nivel de metilación del promotor PAR4 entre el cáncer colorrectal y los tejidos normales emparejados. Usando el método de secuenciación de bisulfito genómico, se examinaron 19 sitios CpG en una región 380 pb del promotor de PAR4. Tres muestras de cáncer colorrectal con alta expresión de PAR4 muestran hypomethylations pronunciadas, y sus tasas medias de metilación de 19 sitios CpG es del 22,1%. Sin embargo, la hipermetilación se encontró en tejidos no cancerosos emparejados que tenían baja expresión de PAR4, y sus tasas de metilación promedio fue de 41,6% (figura 7A). células de alta expresión PAR4-HT-29 muestran hipometilación en su promoción mientras que las células LoVo expresión no aparece PAR4 hipermetilación (Figura 7B).

(A) PAR4 la metilación del promotor se analizó en el ADN de tres cáncer colorrectal y su igualada tejidos no neoplásicos. (B) PAR4 promotor de la metilación en el ADN de las líneas de células de cáncer colorrectal LoVo, y HT-29. metilación promedio en cada analizó sitio CpG en el promotor PAR4 se indica basado en la secuenciación de bisulfito de 19 clones individuales.

Discusión

La expresión diferencia de PAR4 y TFF2 se detectó en varios tumores , tales como el cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y cáncer gástrico, y esta expresión diferencia se asoció con el crecimiento de células tumorales, migración, invasión y la angiogénesis [11,22-24]. Debido a PARs juegan papeles importantes en varios tipos de cáncer y se han convertido en atractivo para el desarrollo de terapias nuevas dianas [25]. En el estudio, presentamos algunos datos fundamentales que los niveles de expresión de PAR4 y TFF2 se incrementaron significativamente en los tejidos de cáncer colorrectal en comparación con los tejidos no cancerosos coincidentes, especialmente en los ganglios linfáticos metastásicos positivos y tumores mal diferenciados. La mayoría de PAR4 y TFF2 en tejidos de cáncer colorrectal se localizan en el citoplasma como se muestra mediante inmunotinción. El aumento de la expresión de PAR4 en el cáncer colorrectal fue consistente con los resultados de GRATIO de investigación [12], en el que PAR4 estaba ausente en mucosa colónica normal y las células epiteliales, pero alta en tejidos de adenocarcinoma de colon, y líneas de células colorrectales humanos 71% muestran una fuerte inmunotinción de PAR4 [12]. Por el contrario, la expresión de PAR4 se redujo en el cáncer gástrico, esofágico escamosas de cáncer y de adenocarcinoma de pulmón en comparación con tejidos la mucosa normal relativo [17,26,27]. Los resultados indicaron que la función de PAR4 era diferente en progresiones tumorales. Dado que los factores desconocidos podrían estar implicados en la expresión aberrante de PAR4, hay mucho las obras tienen que entender el mecanismo de regulación PAR4 antes de que pueda ser un fármaco diana potencial para la terapia del cáncer.

TFF2, como citoprotector director factor trébol, se expresó principalmente en el estómago, y la expresión se dysregulated durante la progresión del cáncer gástrico [16,23,28]. En el estudio de Jiang, expresión TFF2 se redujo marcadamente en el cáncer gástrico, lo que sugiere el papel de TFF2 como un supresor de tumor en la carcinogénesis gástrica y metástasis [29]. En la mucosa del colon, TFF2 se expresó con baja intensidad, pero la expresión de TFF2 en el progreso de cáncer colorrectal no estaba claro [30]. En nuestra investigación, fue interesante para encontrar la expresión TFF2 también se incrementó en tejidos de cáncer en comparación con la mucosa colorrectal normal de relación. Furthermor, nuestros resultados revelaron que el TFF2 recombinante humano podría activar PAR4 para promover la actividad invasión de células HT-29-pGIPZ LoVo-PAR4 y, pero no tuvo efecto significativo en la invasión de células LoVo-mock y HT-29-shPAR4. Los resultados consisten con nuestra anterior conclusión de que TFF2 activa PAR4 para promover la migración de células epiteliales a través de ERK1 /2 fosforilación [17]. Se requiere la fosforilación de ERK1 /2 para la migración celular y es esencial para la señalización mediada por TFF [14,31]. De ahí el hecho de que la expresión de la regulación de PAR4 y TFF2 en el cáncer colorrectal, sus co-localizada patrones de expresión citoplasma, y ​​TFF2 promoción de la migración celular y la invasión a través de PAR4, lo que sugiere la interacción de PAR4 y TFF2
in vivo
y
in vitro
a través del mecanismo desconocido para investigarse más a fondo.

silenciamiento transcripcional por el promotor hipermetilación ha surgido recientemente como uno de los mecanismos importantes en el desarrollo del cáncer gástrico [32]. En este estudio, se encontró que el 5-aza-DC, un agente de desmetilación, restauró la expresión en células LoVo PAR4. Además, se analizó el estado de metilación de la citosina en CpG dinucleotide situado dentro de islas CpG no en la región promotora PAR4 mediante el uso de tejidos de cáncer de colon y líneas celulares con diferente nivel de expresión PAR4. hipermetilación promotor se confirmó en la mucosa colorrectal normal con baja expresión de PAR4. Sin embargo, el promotor de la hipometilación se encontró en tejidos de cáncer colorrectal con alta expresión de PAR4. Los resultados indicaron que el promotor hipometilación puede promover la transcripción de PAR4. Zhang et al encontró que la pérdida de la expresión de PAR4 en los cánceres gástricos puede ser resultado de la hipermetilación del promotor de PAR4 [33]. Pero PAR4 disminución de la expresión de adenocarcinoma de pulmón no estaba relacionada con la metilación del promotor [2727]. Estos hechos sugieren que el nivel de metilación del promotor era sólo un factor que conduce a la diferencia de expresión PAR4, y su expresión se regula por múltiples factores.

En conclusión, la investigación demostró que PAR4 y expresión TFF2 eran con frecuencia reguladas arriba en el cáncer colorrectal y el aumento de la expresión se asoció con el fenotipo clínico agresivo. hipometilación del ADN conduce a la expresión regulada-up de PAR4 en tejidos de cáncer colorrectal. También puso de manifiesto PAR4 promovió la invasión de células de cáncer colorrectal en 'responden a TFF2. Estos resultados nos ayudarán a comprender el mecanismo molecular de factorías francas y PAR en la carcinogénesis y la progresión de los cánceres colorrectales.

Reconocimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81160302, 31270835 ), la Academia de Ciencias de china (KJZD-EW-L03), la provincia de Yunnan Ciencia y Tecnología Departamento de la Fundación de Investigación básica (2011FZ109) y el Laboratorio Estatal de recursos de genética y Evolución (GREKF11-13).

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