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PLoS ONE: Firmas de proteínas de suero de diferenciar la pancreatitis autoinmune frente pancreático Cancer

2016/9/17


Extracto

La pancreatitis autoinmune (AIP) se define por características infiltrado linfoplasmocítica, estenosis ductales y un agrandamiento de páncreas o masa que puede imitar el cáncer de páncreas (PACA) . La distinción entre esta enfermedad benigna y cáncer de páncreas puede ser un reto. Sin embargo, un diagnóstico preciso puede adelantarse al diagnóstico erróneo de cáncer, lo que permite el tratamiento médico adecuado de AIP y, en consecuencia, disminuir el número de resecciones pancreáticas innecesarios.

La espectrometría de masas (MS) y gel diferencial de dos dimensiones electroforesis (2D-DIGE) se han aplicado para analizar las alteraciones de proteínas séricas asociadas con AIP y Paca, y para identificar las firmas de proteínas indicativas de las enfermedades. los sueros de los pacientes fueron immunodepleted de las 20 proteínas séricas más prominentes antes de continuar el 2D-DIGE y análisis de imágenes. La identidad de las proteínas más discriminatorios detectados, se llevó a cabo por MS y se aplicaron las pruebas ELISA para confirmar su expresión. Suero de perfiles de análisis de datos con 2D-DIGE reveló 39 picos de proteína capaz de discriminar entre AIP y PACA. Las proteínas se purificaron y se analizaron adicionalmente por MALDI-TOF-MS. Huellas másicas de péptidos condujo a la identificación de once proteínas. Entre ellos apolipoproteína AI, apolipoproteína A-II, transtiretina, y se identificaron tetranectina y encontró como 3.0-, 3.5-, 2-, y 1,6 veces la disminución en PaCa sueros, respectivamente, mientras que la haptoglobina y la apolipoproteína E resultaron ser 3.8- y 1,6 veces elevados en sueros Paca. Con la excepción de la haptoglobina los resultados de ELISA de las proteínas identificadas confirmado las características de análisis de imagen 2D-DIGE. Integración de las proteínas del suero identificados como marcadores AIP puede tener un potencial considerable para proporcionar información adicional para el diagnóstico de la AIP para elegir el tratamiento adecuado

Visto:. Felix K, O Hauck, Fritz S, T Hinz, Schnölzer M , Kempf T, et al. (2013) Las firmas de proteína de suero de diferenciar la pancreatitis autoinmune frente al cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (12): e82755. doi: 10.1371 /journal.pone.0082755

Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemania |
Recibido: 2 Enero, 2013; Aceptado: 4 de noviembre de 2013; Publicado: 9 de diciembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Felix et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación alemana de Investigación (DFG) FE 940 /2-1. No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la pancreatitis autoinmune (PAI) es una entidad clínica distinta, que se describe como un proceso inflamatorio crónico del páncreas con mecanismos autoinmunes. Clínica e histológicamente, dos subconjuntos de pancreatitis autoinmune (tipo 1 y tipo 2 AIP) existen y deben distinguirse [1] - [4]. El tipo 1 AIP, una pancreatitis esclerosante linfoplasmocítica (LPSP), muestra algunas de las características típicas: periconductal linfoplasmocítica infiltrado, fibrosis, venulitis obliterante, y la infiltración de células plasmáticas IgG4 positivo. El tipo 2 AIP pancreatitis conducto centrada idiopática (PICD) se caracteriza por la infiltración masiva de granulocitos en el parénquima pancreático y lesiones epiteliales ductales (gel). Estas características se describen en los criterios de Mayo HISORt, que utilizamos en nuestra clínica [5]. Tipo 1 AIP afecta predominantemente a hombres adultos con & gt; 90% de los pacientes que son más de 40 años de edad [6]. La presentación clínica más común de tipo 1 AIP es la ictericia obstructiva aguda, que se registra en hasta el 75% de los pacientes [7]. Además, una ampliación de páncreas o masa pueden imitar el cáncer de páncreas en hasta el 80% de los pacientes [1]. En presencia de una nueva aparición de la diabetes y la pérdida de peso, la distinción entre AIP y el cáncer pancreático puede ser un reto. Además, en una tomografía computarizada o resonancia magnética (MRI), una cierta "forma de salchicha" la ampliación del páncreas con realce periférico retardada (realce en anillo) se describe [8] - [10]. Colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) revela estrechamiento segmentario típica y múltiples restricciones, que pueden ayudar a diferenciar entre cáncer de páncreas y colangitis esclerosante primaria [11] - [13]. Tipo 1 AIP presenta varias características serológicas. El más destacado de ellos se eleva los niveles séricos de IgG4, que es crucial para el diagnóstico en ausencia de la histología de acuerdo con los criterios de Mayo HISORt [5]. Además, los anticuerpos antinucleares, la anhidrasa anticarbonic, y antilactoferrin pueden incrementarse también. AIP a menudo puede ser difícil de distinguir de la Paca como datos demográficos de los pacientes, así como las características clínicas y de imagen (por ejemplo, la ampliación de páncreas, ictericia obstructiva en el 76%, la pérdida de peso en el 35% de los pacientes), son similares. Por lo tanto, es deseable reconocer AIP desde 2,5 hasta 11% de todos los pacientes sometidos a cirugía por sospecha de PaCa están teniendo una enfermedad inflamatoria benigna del páncreas [14] - [16]. AIP puede ser tratada por los esteroides, y la alta respuesta a este tratamiento es un criterio de diagnóstico importante. Por lo tanto, es extremadamente importante para el diagnóstico de AIP a elegir el tratamiento adecuado y evitar la cirugía innecesaria
.
El objetivo de este estudio inicial fue identificar las proteínas del suero (biomarcadores séricos) que permiten discriminar AIP de PACA. Para ello se aplicó una estrategia proteómica como se indica en la figura 1. La identidad de las proteínas detectadas se determinó mediante una combinación de varias técnicas, incluyendo fraccionamiento de proteínas de suero por sustracción de inmunoafinidad de proteínas prominentes, electroforesis en gel 2D y espectrometría de masas y finalmente confirmó y evaluó los niveles de proteína de suero por la enzima ensayos de inmunoabsorción ligados (ELISA).

seis sueros de cada grupo (AIP, PACA y Ctr) se sometieron primero a una reducción de la complejidad de suero por eliminación del 20 más abundante proteínas de suero por columnas immunodepletion. Los sueros de inmunoafinidad-procesado se somete de forma paralela a 2D-DIGE y 2 PÁGINA D, y diferencialmente expresado proteínas identificadas mediante análisis de imágenes DIGE fueron emparejados con el gel preparativa, Los puntos de proteínas fueron extirpados como los tapones de gel, preparado para la digestión con tripsina y se identifica por SRA. La validación de conformación y piloto de las proteínas identificadas se realizó mediante ELISA.

Materiales y Métodos

Muestra recogida

Muestras de tejido pancreático se recogen de forma prospectiva entre enero de 2003 y marzo 2010 en el Departamento de Cirugía de la Universidad de Heidelberg. El diagnóstico de pancreatitis crónica (PC), PACA o AIP fue confirmado por histopatología. En caso de AIP, se utilizaron los criterios de la Clínica Mayo (HISORt) [5]. El examen histológico de los incluidos en parafina y H & amp fijado en formol; secciones de tejido pancreático E-manchado fue realizada por un patólogo en el Instituto de Patología de la Universidad de Heidelberg

se recogió sangre preoperatoria de los pacientes con diagnóstico de adenocarcinoma de. el páncreas (PACA, 270 muestras), la pancreatitis crónica alcohólica (CP, 290 muestras), pancreatitis autoinmune (AIP, 32 muestras), un grupo control de voluntarios sanos (Co, 127 muestras), y otros cánceres gastrointestinales (GICA, 165 muestras ). A su ingreso características específicas del paciente (edad, sexo, índice de masa corporal (IMC) síntomas clínicos, pérdida de peso, afectación de otros órganos, complicaciones, análisis de sangre y tratamientos, etc.) fueron documentados. Todos los sueros se obtuvieron de acuerdo con un muestreo estandarizado y protocolo [17] de codificación

Declaración de Ética:. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Heidelberg, y un consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes.

Detección de anticuerpos de IgG total e IgG4

Un rasgo característico de AIP es la presencia de altos niveles de IgG en suero, particularmente la subclase IgG4. A fin de evaluar el valor diagnóstico del total de los niveles de IgG e IgG4 en AIP, se realizó la detección de los anticuerpos. El IgG total y los niveles en suero IgG4 de subconjuntos se determinaron en el momento del diagnóstico por nefelometría, usando un nefelómetro BNII (Dade Behring) como una prueba de ensayo estándar para cuantificar las inmunoglobulinas séricas. Se consideraron los niveles totales de IgG e IgG4 en suero para ser elevado cuando la concentración de valores de ≥ 16,0 g /l, y ≥ 1,4 g /l, respectivamente [18].

Respuesta Inmune a 15
H alcanzó. pylori
proteínas

Al igual que en el desarrollo del cáncer gástrico, un papel patogénico de
H. pylori
la infección se ha discutido durante la enfermedad pancreática [19]. Hemos investigado la asociación de anticuerpos al 15
H diferente. pylori
proteínas y la enfermedad pancreática en comparación con
H. pylori
enfermedad gástrica -asociado. Se analizaron sueros de pacientes con pancreatitis autoinmune (AIP, n = 32), pancreatitis crónica (CP, n = 290) y el cáncer de páncreas (PACA, n = 269), y comparación con los controles sanos (Co, n = 127) y otra cánceres del tracto digestivo (GICA, n = 165) con
H. pylori
serología múltiplex [20] que permite la detección simultánea de anticuerpos a 15
H. pylori
antígenos específicos de (urea, catalasa, GroEL, Napa, CagA, CAGM, Cagδ, HP0231, VacA, hpaA, Cad, HyuA, OMP, HCPC, HP0305). El método multiplex se basa en una glutatión S-transferasa de captura de ensayo de inmunoabsorción unida a la tecnología fluorescente-talón [21], [22]. Recombinante GST-
H. pylori
proteínas de fusión se utilizaron como antígenos, cargados y purificado por afinidad en espectralmente distinta glutatión-caseína acoplada (GC) perlas de poliestireno marcados con fluorescencia (SeroMap, Luminex, Austin, Texas). Los anticuerpos unidos a las perlas a través de la GST-
H. pylori
proteínas de fusión fueron teñidas con biotina de cabra anti-IgA humana, IgM, IgG (Dianova, Hamburgo, Alemania) y la estreptavidina marcada con R-ficoeritrina conjugado reportero. A Luminex 100 analizador identificó el color interno del talón y, por lo tanto, el antígeno transportado por la perla. La cantidad de anticuerpos unidos se determinó como la intensidad de la fluorescencia reportero mediana (MFI) de al menos 100 cuentas por perla fijado por suero.

En los 15 antígenos, los valores de corte específicos del antígeno determinado en un estudio de validación [20] se aplicaron a partir de los valores de MFI de 20 sueros negativos adicionales en Helicobacter-R-Biopharm ELISA como media más 3 desviaciones estándar con exclusión de los valores atípicos positivos. Los datos del estudio se normalizó a este estudio de validación previo dividiendo las reactividades de anticuerpos específicos de antígeno por las pendientes de las rectas de regresión de los pares de datos de un panel de sueros de control de calidad con un 77
H definido. pylori
el estado de marcha en esto y el estudio de validación anterior. Todos los sueros se analizaron una vez a una dilución 1:100 dentro de un solo día de ensayo.
H. pylori
sero-positividad se definió como sero-positividad a & gt;. 3 proteínas, que ha mostrado una excelente concordancia (kappa = 0,70) con la clasificación ensayo serológico comercial [20]

análisis del proteoma

2D-DIGE Antes del análisis diferenciación de dos dimensiones de la AIP, PACA y sueros de control, una etapa de separación para eliminar las 20 proteínas de suero más prominentes se realizó para obtener un mejor acceso a las proteínas del suero menos prominentes. Para este propósito, los sueros de los pacientes fueron sometidos a una etapa de immunodepletion utilizando el kit ProteoPrep 20 y guía de usuario (Sigma, Deisenhofen, Alemania). Los sueros agotados y diluida se ajustaron posteriormente a las concentraciones de proteínas requeridas de 1,0 mg /ml por el protocolo de precipitación de proteínas de Wessel y Flügge, y los precipitados de proteína se reconstituyó en tampón de lisis (8 M de urea, Tris 20 mM, 4% de CHAPS, pH 8,5) [23]. Las muestras utilizadas para el análisis 2D-DIGE se marcaron con CyDye DIGE Fluor colorantes mínimas (GE-Healthcare GmbH, Freiburg, Alemania) antes del análisis en gel de 2D. Para este propósito, 50 g de proteína se mezclaron con 400 pmol CyDye disuelto en DMF, se agitaron, se centrifugaron, y se incubaron en la oscuridad en hielo durante 30 min. El exceso de colorante se une mediante la adición de 1 l de 10 mM de lisina a la mezcla. Un protocolo detallado se describe en el Manual del usuario del sistema Ettan DIGE (GE Healthcare-2005) y [24].

Immobiline DryStrips de 24 cm y pH 3-10 NL (GE Healthcare) fueron cargados de forma pasiva con 300 mg de muestras de proteínas se resuspendieron en 350 l en una mezcla de 150 l de tampón de lisis (7 M urea, tiourea 2 M, 4% w /v CHAPS) y solución destreak l 200 (2% w /v IPG-anfolito, 2% w /v dithiotreitol TDT). IEF se realizó con un sistema Ettan IPGphor IEF unidad (GE Healthcare) y un gradiente de tensión de hasta 8 kV (total de 35,5 KVH). Antes de la segunda carrera dimensión en una página de 15%, las tiras de IPG se equilibraron por etapas durante 15 minutos en un /HCl tampón Tris (pH 8,8, 6 M urea, 30% de glicerol, 2% SDS) con 1% de DTT, seguido un 2,5% yodoacetamida. Se utilizó un marcador de peso molecular (SM0671 Sigma), y la electroforesis se ejecuta durante la noche a constante de 12 W. Los geles fueron escaneados utilizando un escáner Typhoon 9410 (GE Healthcare). cuantificación de proteínas en todas las muestras se realizó utilizando el software 2D DeCyder 6.5 (GE Healthcare). La aplicación de un módulo de DIA, la Cy2 etiquetado estándar interno permite la normalización de las manchas de proteínas a través de todos los geles. Con el módulo de BVA, la prueba t de Student (no pareada, dos colas) se utilizó para calcular significativa (p & lt; 0,05) en una relativa cantidad de proteína /punto en sueros de seis AIP en comparación con los seis sueros PACA. Las manchas no resultaron ser estadísticamente significativos fueron asignadas y aislado para una mayor investigación como se describe a continuación.

Identificación de proteínas a partir de geles 2D por MALDI-TOF MS.

Después de alinear los geles teñidos con plata con los geles preparativos correspondientes, los puntos que se repiten y que emparejan fueron marcados con un número de identificación. Las manchas de proteínas seleccionadas fueron perforados a cabo a partir de los geles 2D, se colocaron en tubos de 200 l de identificación marcado individuales, y se lavaron dos veces con 70% de acetonitrilo (ACN), 40 mM NH
4HCO
3. Después de la reducción con DTT 10 mM durante 1 hora a 56 ° C y la alquilación con yodoacetamida 55 mM durante 30 min a TA, los tapones de gel se lavaron tres veces alternativamente con NH 40 mM
4HCO
3 y etanol. Después de secar con acetonitrilo, una digestión con tripsina en gel se realizó mediante la adición de tripsina 100 ng en 40 mM NH
4HCO
3 durante la noche a 37 ° C. Los péptidos resultantes se extrajeron de los tapones de gel mediante la adición de 15 l solución de extracción (1% de ACN, 1% de ácido fórmico).

Para la identificación por espectrometría de masas de los digestos trípticos de huellas másicas de péptidos, se prepararon muestras en objetivos PrespottedAnchorChip (PAC) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (Bruker-Daltonik, Bremen, Alemania). alfa-ciano-4-hidroxicinámico se usó ácido como una matriz [25]. Los espectros de masas se registraron en el modo reflector de ion positivo con extracción retrasada en un Ultraflex I instrumento de tiempo de vuelo (Bruker-Daltonik, Bremen, Alemania). Ion aceleración se fijó a 25,0 kV, el reflector a 26,3 kV, y la primera placa de extracción a 21.75 kV. Los espectros de masas se obtuvieron sumando 500-1500 disparos de láser individuales. Calibración de los espectros se llevó a cabo externamente por un ajuste cuadrático utilizando una mezcla estándar de calibración péptido que contiene la bradicinina (1-7) en m /z 757,399, la angiotensina II a m /z 1046.542, la angiotensina I a m /z 1296.685, neurotensina en m /z 1672.917, la renina sustrato a m /z 1758.933, clip de ACTH (1-17) a m /z 2093.086, clip de ACTH (18-39) a m /z 2465.198, clip de ACTH (1-24) a m /z 2932.588, y clip de ACTH (7-38) a m /z 3657.929. Una sola carga péptido masas monoisotopic fueron utilizados como insumos para la búsqueda de base de datos. Se realizaron búsquedas en contra de la base de datos de NCBInr (lanzado 2009-09-09) utilizando la versión de la mascota del algoritmo de búsqueda v2.2 (Matrix Science, Londres, Reino Unido). Taxonomía fue mamíferos, la masa de proteínas se limita a 100 kDa, y se dejó que los puntos isoeléctricos en un rango de 0 a 14. Carbamidomethylation de cisteína se incluyó como modificación fija, y la oxidación de metionina se dejó como modificación variable. Hasta un sitio de escisión se perdió tríptico fue considerada, y la tolerancia de masa para las masas peptídicas monoisotopic se estableció a +/- 75 ppm.

ligado a enzimas (ELISA)

en fase sólida sandwich ELISA de captura se realizaron utilizando kits disponibles en el mercado para la apolipoproteína AI (ALerCHEK Inc., Portland, Maine). La apolipoproteína A-II, la apolipoproteína E y haptoglobina eran de AssayPro (AssayPro, St. Charles, MO), a partir de la tetranectina USCN Life Science Inc. (Wuhan, China), y transtiretina de Immundiagnostik AG (Bensheim, Alemania). La haptoglobina ELISA de AssayPro es también un ELISA sándwich pero con una técnica de inmunoensayo enzimático competitivo. Los seis ensayos ELISA utilizados cuantificar la suma de todos los antígenos que se unen al anticuerpo y, por lo tanto, no revelar la contribución relativa de las isoformas o formas modificadas después de la traducción. Todos los sueros se diluyeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con tampones proporcionados o tampón TBS, y los ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Carbohidratos antígeno 19-9 (CA 19-9) se determinó en el suero por un sándwich de inmunoensayo con el uso de un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

análisis biométrico

El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prism 5 (GraphPad software, Inc., San Diego, California, EE.UU.) y SAS versión de software 9.1 (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte, EE.UU.).

biométrico análisis se realizó para examinar la fuerza de correlación entre los parámetros clínicos de masa corporal-index (BMI) y el marcador tumoral CA 19-9 con niveles de validaciones basadas en ELISA de los seis marcadores de proteínas. Dependiendo del carácter de las distribuciones de los parámetros cuantitativos de cada grupo el coeficiente de correlación r con su correspondiente valor de p de Pearson y Spearman se utilizaron para analizar las correlaciones. El carácter de las distribuciones de los parámetros cuantitativos se determinó mediante el uso de la prueba de Shapiro-Wilk y un gráfico de probabilidad normal.

Resultados

se distinguen LIF

Dos patrones clínicos en pacientes diagnosticados con AIP: clasificadas como de tipo 1 y tipo 2. Se analizaron nuestra cohorte de pacientes en consecuencia. Una característica distintiva de AIP tipo 1 es la elevación de la gamma globulina y su subconjunto, el G4 inmunoglobulina (IgG4) los niveles séricos; Por lo tanto, se analizaron las muestras de estas anomalías. De las muestras analizadas (n = 32), tres pacientes se caracterizaron con IgG anormal total de & gt; 16 g /l, y 18 muestras (59%) mostraron niveles elevados de IgG4 (límite superior 1,4 g /L), que oscilan entre 1,8 y 16,6 g /L (Fig. 2).

Los niveles séricos de IgG e IgG4 se determinaron por inmunonefelometría automatizado, y se considera elevada cuando ≥16.0 g /l y ≥1.4 g /l, respectivamente (líneas de puntos).

H. pylori y AIP

Desde
infección por Helicobacter pylori
se ha asociado con la patogénesis de la AIP, se investigó la asociación de anticuerpos para 15 diferentes
H. pylori
proteínas en el suero de 32 AIP y en comparación con otras enfermedades pancreáticas y controles. análisis de anticuerpos se realizaron con
H purificado por afinidad serología multiplex basado en expresado de forma recombinante y. pylori
proteínas en combinación con la tecnología de bolas fluorescentes (Luminex).
H. pylori
seroprevalencia fue del 43,8% en el AIP y el 56,9% en CP en comparación con 64,7% en Paca, 69,7% en diferentes cánceres gastrointestinales y un 50,4% en los controles (que se resumen en la Tabla 1).
H. pylori
pacientes seropositivos con AIP mostraron respuestas de anticuerpos significativamente inferiores a 3 antígenos (Cagδ, CagA, HP0231) y los pacientes con pancreatitis crónica al 9 (Cad, Cagδ, CagA, CAGM, HP0305, HPAA, HyuA, OMP y VacA) en comparación con
H. pylori
pacientes seropositivos con otros cánceres del tracto gastrointestinal como una referencia, con la existencia de un aumento significativo de la reactividad de anticuerpos de VacA en
H. pylori
pacientes seropositivos con AIP y Napa en los pacientes con cáncer de páncreas. Entre los pacientes de enfermedades pancreáticas, nuestros datos no apoyan una asociación significativa de
H. pylori
la infección con AIP

expresión de la proteína de suero de perfiles de aplicación de immunodepletion y 2D-DIGE:. Para encontrar e identificar potenciales biomarcadores de diagnóstico para el diagnóstico diferencial de la AIP y Paca, que analizó el suero de seis AIP y seis pacientes paca según la estrategia presentada en la Figura 1. Para este propósito los sueros se immunodepleted primero de proteínas de alta abundancia, a continuación, marcados con colorantes de fluorescencia y se separaron por electroforesis en gel de 2 dimensiones. El análisis estadístico de las imágenes de gel obtenidos con un paquete de software DeCyder reveló 39 cambiado de manera significativa (p & lt; 0,05) entre las proteínas y los grupos AIP PACA. Las manchas de proteínas a juego con la regulación diferencial más alta (n = 14) fueron extirpados de geles 2D-PAGE preparativa y se sometieron a digestión tríptica en gel. mezclas de péptidos trípticos se analizaron con MALDI-TOF-MS y se identificaron mediante una búsqueda de base de datos utilizando el algoritmo MASCOTA. Una lista de las proteínas, regulados diferencialmente identificados en AIP y Paca se resume en la Tabla 2. Un punto se perdió durante la preparación, pero más tarde identificado como apolipoproteína A-II. Para su identificación el gel teñido con plata Cy2 fue posteriormente manchados, la mancha fue cortada, se digirió con tripsina y se sometió a análisis de espectrometría de masas.

identificado apolipoproteína AI, apolipoproteína A-II y transtiretina con una relación de /paca AIP de 3, 3,5 y 2, respectivamente. En AIP también encontramos niveles séricos elevados de tetranectina e inmunoglobulinas, mientras que en los sueros Paca, la apolipoproteína E y haptoglobina (PACA relación /AIP de 1,6 y 3,8 respectivamente) fueron encontrados elevada.

Conformación de la expresión diferencial de biomarcador candidato proteínas

Para evaluar la precisión diagnóstica de los candidatos biomarcadores encontrados por 2D-DIGE y MS, que mide los niveles séricos de apolipoproteína AI-, la apolipoproteína A-II, la apolipoproteína-e, los niveles de transtiretina, tetranectina, y haptoglobina por ELISA disponibles comercialmente en una cohorte de 32 AIP, 30 Paca, y 30 controles sanos de muestras escogidas al azar. Con estos ensayos hemos sido capaces de discriminar los sueros del grupo AIP Paca, y confirmó los resultados de espectrometría de masas. Con la excepción de haptoglobina (p = 0,1), todos los marcadores de la prueba aquí revelaron diferencias significativas (p & lt; 0,05). Figura 3 muestra los gráficos de los resultados de proteína para cada grupo. Los valores se muestran como una media con SEM. Parcelas

Dot de la apolipoproteína A-I, apolipoproteína A-II, la apolipoproteína E, transtiretina, tetranectina, y haptoglobina para cada grupo. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism5 la aplicación de la prueba de Mann-Whitney (dos colas). Los valores se muestran como una media con SEM.

análisis biométrico

Los datos de CA 19-9 y el índice de masa corporal por categorías de los tres grupos se presentan en la Tabla 3 y la Tabla 4 y la distribución del rango se muestra como diagrama de caja y bigotes en la figura 4A. Para evaluar la fuerza de la asociación lineal entre los niveles de validaciones basados ​​en ELISA con el índice de masa corporal (IMC) y los niveles de CA 19-9 coeficientes de correlación para los seis marcadores de proteínas se determinaron

A:. Índice de masa corporal y CA 19-9 en la AIP-, PaCa- y grupo de control utilizados en las validaciones basados ​​en ELISA. El los valores de CA 19-9 de tres grupos AIP, Paca y Control de IMC y se presentan como diagramas de caja y bigotes. Las comparaciones entre los tres grupos se realizaron mediante el test de Kruskal-Wallis como prueba general seguida de la U de Mann-Whitney U test de comparaciones por pares. B: La reevaluación de las pruebas ELISA para los seis marcadores de la aplicación de un CA 19-9 corte de & lt; 37 U /ml. Con respecto a los marcadores proteicos 6 los subgrupos de AIP y Paca definidos por una CA 19-9 valor & lt; se compararon 37 U /ml con el de un solo lado de Mann-Whitney U test. Importancia fue aceptada por el nivel del 95%. Los diagramas de caja con un máximo, Q3, la mediana, Q1 y min.

En el análisis de asociación de los seis marcadores y el IMC única tetranectina reveló por los tres grupos en su conjunto un negativo coeficiente de correlación con un valor de r = -0,374 y p = 0,01. Esta correlación negativa fue aún más pronunciada cuando el grupo Paca solo se analizó con r = -0,588 yp = 0,006
.
El análisis de asociación de los seis marcadores y niveles de CA 19-9 para los tres grupos en su conjunto puesto de manifiesto una correlación negativa para la apolipoproteína AI y transtiretina con los coeficientes de correlación r = -0,388 (p = 0,012) y r = -0,372 (p = 0,0235), respectivamente. El análisis de Paca solo se encontró un coeficiente de correlación negativa sólo para la apolipoproteína A-II con un valor de r = -0,439; pero no logró el nivel de significación de p = 0,08.

Debido a que todas las muestras mostraron AIP CA 19.9 niveles séricos por debajo de 37 U /ml se compararon sus datos de ELISA con el correspondiente subgrupo lapa (n = 21) con CA 19-9 niveles por debajo de 37 U /ml. El análisis estadístico reveló todavía diferencias significativas para la apolipoproteína A-I, tetranectina y thransthyretin. La apolipoproteína A-II (p = 0,053) y la apolipoproteína E (p = 0,061) fallaron ligeramente el nivel de significación (Fig. 4B).

Discusión

Distinción punto desde Paca a través de procedimientos no invasivos tales como biomarcadores séricos, o de imágenes es importante ya que hasta un 11% de los pacientes sometidos a cirugía para el cáncer de páncreas son diagnosticados de tener una condición inflamatoria benigna. marcadores serológicos tales como gamma-globulinas elevados, en particular IgG4, se sugirieron como buenos candidatos para el diagnóstico diferencial. Los niveles elevados de IgG4 son considerados como el suero marcador más sensible para el diagnóstico de AIP [18]. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que IgG4 también se puede elevar hasta en el 10% de los pacientes PACA y es, por lo tanto, no siempre específico para distinguir AIP de PaCa [26]. Además, los casos de AIP seronegativos fueron descritos por Ghazale [27].

Nuestra aquí investigados AIP cohorte del estudio mostró que sólo el 58% de las muestras con valores por encima de IgG4 1,4 g /l. Una variedad de autoanticuerpos entre ellos contra el antígeno nuclear, la lactoferrina o la anhidrasa carbónica II (CAII) se registraron en AIP sueros de pacientes, pero ninguno de ellos se sabe que es de la subclase IgG4. Todavía no está claro si la formación de estos autoanticuerpos y aumento de los niveles de IgG4 juegan un papel patogénico o son epifenómenos de AIP [28], [29]. Un equipo de investigación en Japón tuvo éxito en la inducción de AIP en ratones atímicos recién nacido inmunizando con la lactoferrina y la CAII [30]. Otro grupo de investigación detecta anticuerpos contra α2 amilasa en AIP [31]. Ninguno de los marcadores reportados son tan específicas que pueden discriminar de manera segura entre el AIP y PACA.

Una posible interconexión entre los
Helicobacter pylori
infección y AIP ha informado [19]. Varios laboratorios sugieren un mimetismo molecular como causa, en el que los anticuerpos dirigidos hacia
H. pylori
proteínas también se unen a secuencias de péptidos de cuerpo propio e inducen una respuesta inmune en el páncreas [32] - [36]. Cabe destacar que, en un trabajo reciente, se demostró que en 19 de los 20 pacientes seleccionados AIP, los autoanticuerpos frente a proteínas de unión a plasminógeno de
H. pylori
se encontró, que eran probablemente un marcador serológico útil distinguir AIP de Paca y CP [19]. Sin embargo, el examen de todos nuestros pacientes de PAI reveló un
H. pylori
seroprevalencia del 43,8% y fue el más bajo de todos los grupos analizados. Una explicación de la discrepancia entre los resultados de los estudios puede ser el origen geográfico y el medio ambiente diferente de los pacientes. Nuestros resultados también confirman un estudio anterior, donde en el páncreas de 11 pacientes de PAI sin
H pylori
ureasa A y 16S rDNA fueron detectados por PCR anidada [37].

Perfiles de sueros igualado y subfraccionó de AIP y los pacientes Paca en ProteinChip en uno de nuestros estudios anteriores que aplican la técnica SELDI-TOF-MS reveló 38 posibles marcadores de proteínas que oscilan entre 3.14 y 42.23 kDa [38]. A fin de analizar los resultados de descripción obtenidos por SELDI-TOF-MS, se realizó un estudio aquí en 2D-DIGE en suero agotado de inmunoafinidad para identificar candidatos marcadores para el diagnóstico diferencial de las dos enfermedades. La comparación de la PaCa 2D-DIGE de expresión de proteínas de datos utilizando el análisis de imágenes DeCyder AIP y, encontramos en el suero de pacientes de PAI-tres veces mayores niveles de apolipoproteína AI, los niveles de 3,5-veces mayor de la apolipoproteína A-II y dos veces mayores niveles de transtiretina (TTH). En AIP también encontramos tetranectina elevada e inmunoglobulinas, mientras que en Paca, la apolipoproteína E y haptoglobina eran más altos. Observaciones sobre disminución de los niveles de apo AI, apo A-II y TTH en Paca y CP en comparación con individuos normales se hicieron en nuestros estudios anteriores [17], [38], [39].

Debido al hecho que las observaciones aquí descritas pueden contribuir a un mejor diagnóstico diferencial de la AIP y Paca, se realizó un ELISA para los seis proteínas para confirmar los datos 2D-DIGE /MS y evaluar su rendimiento general. Con la excepción de la haptoglobina, para los que no se encontró ninguna diferencia significativa, las proporciones entre los dos grupos revelaron características similares, pero las proporciones eran menos prominentes. Los elevados niveles de apolipoproteína E en suero en pacientes Paca evaluados en este estudio inicial realizado por 2D-DIGE y ELISA están en concordancia con un estudio reciente que Chen et al. Appling diferentes enfoques, incluyendo ELISA se encontraron con una regulación de la apolipoproteína E en Paca-tejidos y los niveles de apolipoproteína E elevados en suero de pacientes Paca [40].

El grupo de AIP y el control de sueros mostraron un rango de distribución similar para las apolipoproteínas, lo que indica que el contenido en suero de estas proteínas es comparable. El siguiente paso sería probar si la combinación de los marcadores identificados nos permite hacer una predicción fiable en muestras de suero desconocidas. También otra aquí en las proteínas estudio identificó podrían integrarse en este tipo de pruebas. La razón de la disminución de los niveles de las proteínas mencionadas en Paca y sueros CP, en comparación con voluntarios sanos o AIP, está claro, pero existen algunas explicaciones. Tanto el PP y Paca pacientes sufren de desnutrición y caquexia estimular la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado, pero la síntesis de apolipoproteínas, transtiretina, y las gotas de la proteína de unión al retinol. Sin embargo, la identificación de la caquexia no era posible, sin pérdida de peso dramático de la historia médica del paciente se registraron, la mayoría de los pacientes aquí analizados mostraron normal o ligeramente elevado índice de masa corporal y sólo un paciente Paca tenían un IMC por debajo de 19, como se muestra en la Tabla 4. La diferencias significativas de las proteínas individuales observadas en nuestro estudio indican una etiología completamente diferente de AIP en un sitio y CP y PaCa en el otro.

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