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PLoS ONE: PSMA específicas Las células T CAR-Engineered Erradicar diseminada cáncer de próstata en preclínicos Models

2016/4/20


Extracto

intervenciones basadas en la inmunología se han propuesto como una posibilidad curativa prometedor para atacar eficazmente la enfermedad mínima residual postoperatoria y metastásica distante localizaciones de los tumores de próstata. Hemos desarrollado un receptor de antígeno quimérico (CAR) constructo de reconocimiento del antígeno humano específico de la próstata membrana (hPSMA), basada en una novela y mAb específicos de alta afinidad. Como un método de transferencia, se emplearon vectores de lentivirus de última generación (LV) que llevan un promotor bidireccional sintética capaz de robusta y coordinada expresión de la molécula de coche, y un gen informador de bioluminiscencia para permitir el seguimiento de las células T transgénicas después de
in vivo
transferencia adoptiva. En general, hemos demostrado que la expresión de CAR-LV transducidas de manera eficiente a corto plazo activado PBMC, que a su vez fueron estimulados fácilmente para producir citoquinas y ejercer una actividad citotóxica relevante por acoplamiento con PSMA
+ células de tumor de próstata. Tras
in vivo
transferencia en ratones portadores de tumores, las células T CAR transducidas fueron capaces de erradicar por completo una neoplasia diseminada en la mayoría de los animales tratados, lo que apoya la traducción de este enfoque en el ámbito clínico.

Visto: Zuccolotto G, G Fracasso, Merlo A, IM Montagner, Rondina M, Bobisse S, et al. CAR-Engineered (2014) PSMA específica las células T Erradicar diseminada cáncer de próstata en modelos preclínicos. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10.1371 /journal.pone.0109427

Editor: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América

Recibido: 27 de mayo de 2014; Aceptado: 1 de septiembre de 2014; Publicado: 3 Octubre 2014

Derechos de Autor © 2014 Zuccolotto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC, IG-13121; y el Programa Especial Molecular Oncología Clínica 5 por mille ID 10016 a AR) y la Universidad de Padua, "Progetti Strategici di Ateneo 2011" a AR. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

terapia celular adoptiva con sin modificar y
ex vivo
células T expandidas ha demostrado ser eficaz contra diferentes entidades tumorales, en particular, el melanoma y tumores asociados a EBV [1]. Hoy en día, la modificación genética de las células T puede conferir nuevas propiedades de metas tumorales para los linfocitos de origen natural, superando así la dependencia de los componentes del sistema inmune endógeno.

Mientras que la transducción con TCR Ag-específica sólo puede redirigir las células T la actividad en función de las mismas características de reconocimiento, la tecnología quimérico receptor de antígeno (CAR) tiene la potencialidad de dotar a las células T con las características ventajosas de un anticuerpo, es decir, la especificidad, la afinidad y la posibilidad de apuntar a los antígenos no proteicos [2]. Por otra parte, en un coche molécula única proporciona algunas medidas para contrarrestar las estrategias de evasión inmune del tumor: alivia el reconocimiento y la actividad de restricción de MHC y la expresión de las células T, y puede retransmitir señales coestimuladoras a través de sus dominios intracelulares

La eficacia terapéutica de la CAR. Las células T ya han sido reportados en pacientes, en particular contra la leucemia linfocítica crónica (CLL) y la leucemia linfoblástica aguda (LLA) [3] - [6] con resultados muy prometedores en términos de supervivencia libre de enfermedad y hematológica completa y respuestas moleculares incluso en sujetos que no todos los tratamientos estándares anteriores. Sin embargo, neoplasias hematológicas, en particular los de origen de células B, se pueden considerar como un objetivo ideal para los enfoques inmunoterapéuticos [7]. De hecho, estas células malignas naturalmente proporcionan ligandos del receptor coestimuladoras y comparten los mismos compartimentos fisiológicos con células T adoptiva transferidos. Finalmente, la eliminación de las células B normales se asocia con efectos adversos potencialmente mortales no, que pueden ser clínicamente administrados con la administración de inmunoglobulina intravenosa.

A la inversa, el tratamiento de tumores sólidos sigue siendo un reto importante y debe ser mejorado tanto en términos de la eficacia clínica y la seguridad. éxitos parciales se experimentaron en contra neuroblastoma utilizando células T CAR-GD2 específicas sin régimen de acondicionamiento previo, en la práctica ausencia de efectos secundarios [8], [9]. Por el contrario, no hay respuestas clínicas se registraron con la infusión de células T redirigidas contra el receptor de folato en pacientes con carcinoma de ovario [10], ni contra carboxi-anhidrasa IX (CAIX) en pacientes con carcinoma de células renales [11], a pesar de la relevante "en la -target, fuera de tumor "toxicidad evidente en el último caso. Las lecciones aprendidas de estas experiencias indican que la definición del antígeno diana en cuestiones de seguridad, y la capacidad de persistencia y la localización tumoral de células infundidas son especialmente críticos para el éxito del tratamiento.

Hemos abordado algunas de estas preguntas por la orientación de próstata las células cancerosas del tumor con las células T modificadas para expresar una determinada CAR para el antígeno de membrana específico de la próstata humano (hPSMA).

tumor de próstata representa una entidad clínica grave, estimando 233.000 nuevos casos y 29.480 muertes en los Estados Unidos en 2014 [12], en la actualidad sólo con tratamientos paliativos para refractario hormonal y formas metastásicas [13]. Para estos pacientes, la inmunoterapia ha demostrado ser una opción válida basada en la vacunación con células tumorales prostáticas modificadas enteros (GVAX [14]) o PBMC que presentan un antígeno prostático relevante (Sipuleucel-T [15]). Con respecto a los enfoques de terapia celular adoptiva, los estudios preclínicos han reportado resultados alentadores [13], [16], [17] y la evaluación clínica está experimentando (número de ensayos clínicos NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196; www.clinicaltrials.gov). En este escenario, PSMA puede representar una diana adecuada y de hecho es actualmente explotado tanto para fines terapéuticos y de formación de imágenes. En particular, los niveles de expresión de PSMA diferencian tejidos prostáticos normales y cancerosas, y en paralelo la puntuación de Gleason de cáncer de próstata [18]. Curiosamente, la expresión de PSMA implica neovasculatura de varias entidades tumorales, previendo así un efecto antiangiogénico adicional.

A continuación, se presenta el diseño del coche contra hPSMA basada en una novela y una alta afinidad específica mAb [19], y la fenotípica y caracterización funcional de T-cuerpo-hPSMA tanto
in vitro
y
in vivo
. Para la transducción, se utilizó un vector lentiviral que lleva un promotor bidireccional que impulsa la expresión simultánea de la molécula de CAR y un gen informador de bioluminiscencia. Esto permitió que el seguimiento de las células T infundidas y por lo tanto la correlación directa de los resultados terapéuticos con la capacidad de persistencia y homing de las células T. En general, las células T CAR transducidas no sólo ejercen una actividad terapéutica loco-regional relevante, pero también erradicado por completo una neoplasia diseminada, en la mayoría de los animales tratados. Estos resultados apoyan firmemente la traducción de este enfoque en el ámbito clínico

Materiales y Métodos

Las líneas celulares

Las siguientes líneas celulares se utilizaron en este estudio:. LNCaP y PC3 , próstata humano líneas celulares de carcinoma; Jurkat, leucemia linfoblástica T humana y 293 T, línea de células de riñón embrionario humano [20]. La línea celular PC3-PIP, que expresan establemente PSMA humano (hPSMA) [21] fue proporcionado generosamente por el Dr. Warren Heston; LNCaP línea celular se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). LNCaP, las células PC3, PC3-PIP y Jurkat se mantuvieron en medio RPMI 1640 (EuroClone, Milán, Italia), mientras que el medio DMEM (Biochrom AG, Berlín, Alemania) se utilizó para 293 células T; ambos medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco BRL Paisley, Reino Unido), 2 mM L-glutamina, HEPES 10 mM, 100 U /ml de penicilina, y 100 U /ml de estreptomicina (todos de Lonza, BioWhittaker, Basilea , Suiza), a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera.

generación CAR anti-hPSMA

el coche contra el antígeno hPSMA contiene la secuencia completa de la lucha contra la hPSMA scFv derivado del hibridoma anti-hPSMA D2B [19]. Esta secuencia se clonó en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pSecTag2A (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milán, Italia). El MCS del plásmido pSecTag2A está comprendido entre dos secuencias: en 5 ', la Ig kappa murino secuencia líder de la cadena ligera V-J2-C, y en el 3' de la secuencia de etiqueta Myc. Por lo tanto, se utilizó la secuencia líder-ScFv-myc para la generación de CAR. El fragmento de Leader-ScFv-myc se amplificó por PCR y se insertó en el constructo pBS SKII (Invitrogen). Una parte de la CD28 (bases 438-759) y el dominio intracelular CD3 (227-563 región), ambos obtenidos a partir de ADNc de VEB específicos CD4
+ T células [22], se fusionaron mediante PCR y a continuación, inserta en el vector pBS SKII, aguas abajo del fragmento de Leader-ScFv-myc. Este vector fue secuenciado en el Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie innovador (CRIBI) de la Universidad de Padua, Italia. La secuencia CAR anti-hPSMA finalmente se subclonó en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Para comprobar la capacidad para conducir la expresión de la molécula de CAR en la membrana, se utilizó este vector para transfectar células 293 T utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

LV plásmidos y preparación lentiviral

se utilizaron los siguientes vectores de empaquetamiento lentiviral: pMDLg /pRRE, pRSV- Rev, pMD2.VSVG y pADVANTAGE, todo proporcionado amablemente por el Dr. L. Naldini (San Raffaele, Milán, Italia). El vector de transferencia#945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre es un (SIN) del VIH derivado de vector de auto-inactivación [23], que lleva una minCMVPGK divergente promotor bidireccional dirige la expresión simultánea de dos genes en la orientación antisentido. Los vectores de transferencia utilizados en este estudio llevan a la secuencia CAR anti-hPSMA (obtenido de vector PMA-T-cuerpo) bajo el control del promotor hPGK, y la eGFP (mejorado proteína verde fluorescente) o luciferasa de luciérnaga (Fluc) genes indicadores bajo el control de minCMV. vector PMA-T-cuerpo y la secuencia de Fluc se sintetizaron por GeneArt, Life Technologies (Regensburg, Alemania). producción Lentiviral en 293 células T se ha descrito anteriormente [23]. Un vector lentiviral que codifica sólo para Fluc [24] se utilizó para la transducción de células PC3-PIP.

Análisis de transferencia Western

293 células T, no transfectadas o transfectadas con pcDNA3.1-CAR, se lisaron en tampón que contiene 50 mM Tris HCl pH 6,8, 2% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, y 0,1 hasta 0,05% azul de bromofenol (al de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU. ) Las proteínas se separaron sobre 10% de geles de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilion-P, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La membrana se bloqueó en 5% de leche desnatada (Sigma-Aldrich) en TBS y 0,05% de Tween 20, seguido de incubación con el anticuerpo primario (mAb de ratón, 1:1000, Sigma-Aldrich Myc anti-c-) durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres a 10 minutos lavados en PBS-Tween, cabra conjugado con HRP anti-IgG de ratón anticuerpo secundario (diluido 1:10000, Amersham, Milán, Italia) se añadió durante una hora a temperatura ambiente en la leche. La membrana se desarrolló utilizando la SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) y se visualizó mediante quimioluminiscencia. intensidad de la señal se midió utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia Bio-Rad XRS (Grupo de Ciencias de la Vida, Milán, Italia).

Jurkat transducción de células

Para evaluar la funcionalidad de los vectores de LV, se incubaron células Jurkat con el sobrenadante viral (CAR hPSMA /eGFP LV o hPSMA /luciferasa LV CAR) durante 15 horas en presencia de 8 mg /ml sulfato de protamina (Sigma-Aldrich). La citometría de flujo y la bioluminiscencia (BLI) análisis se llevaron a cabo en diferentes puntos de tiempo después de transducción para evaluar la expresión CAR y eGFP o actividad luciferasa.

generación T-cuerpos

Para generar T-organismos, las PBMC de donantes sanos fueron activados 48 horas con OKT-3 (50 ng /ml; Ortho Biotech Inc, Raritan, NJ, EE.UU.) y la IL-2 (hIL-2, 300 U /ml; Proleukin; Novartis Pharmaceuticals, Horsham, Reino Unido ). Las células T fueron infectadas con el sobrenadante viral durante 18 horas a 37 ° C y 5% de CO
2, en presencia de sulfato de protamina (40 mg /ml; Sigma-Aldrich) y hIL-2 (500 U /ml ). El sobrenadante entonces fue cambiado con medio completo fresco que contiene hIL-2 (100 U /ml). Setenta y dos horas más tarde, las PBMC se analizaron para el coche y la expresión de eGFP, y la actividad de luciferasa. PBMC se conoce como T-cuerpo-hPSMA /eGFP y T-cuerpo-hPSMA /Fluc cuando transducidas con hPSMA /eGFP LV automóvil o en hPSMA /luciferasa LV, respectivamente. T-cuerpos fueron re-estimularon una vez a la semana con irradiado (60 Gy) PC3-PIP a una relación de 10:01. medio completo con IL-2 fresca se reponía dos veces por semana

Los anticuerpos

células que expresan CAR se marcaron con el (9E10 clon; Sigma-Aldrich) anti-c-myc mAb. o la control de isotipo (IgG1 de ratón, Southern Biotech, Milán, Italia), seguido de un anticuerpo secundario (de cabra conjugado con PE anti-IgG de ratón; Southern Biotech). marcadores de la superficie celular se marcaron usando APC-FITC o anticuerpos conjugados con PE a CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) y los controles de isotipo relativos adquiridos de las mismas empresas.

ensayo de citotoxicidad

La actividad citotóxica de T-cuerpo-hPSMA /eGFP y T-cuerpo-hPSMA /Fluc se evaluó en una norma 4 h
ensayo de liberación de 51Cr como se informó anteriormente [25], en diferentes puntos de tiempo después de la transducción. PC3, PC3 y LNCaP-PIP se utilizaron como células diana.

ensayos de liberación de citoquinas

Para evaluar la producción de IFN-γ, IFN-γ un Conjunto de detección ELISA (Thermo Scientific, Rockford, IL, se utilizó EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 × 10
6 T Las células fueron sembradas con 1 x 10
6 células diana (PC3 o PC3-PIP) en pocillos por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo redondo. la secreción de citocinas se midió después de 12 horas de incubación con t-cuerpos en diferentes etapas de la diferenciación. Controles positivos y negativos estuvieron representados por transducido PBMC y T-cuerpos sin estimular o se trataron con 40 ng /ml de PMA y 4 mg /ml de ionomicina (Sigma-Aldrich), respectivamente. Los sobrenadantes se analizaron entonces en un X4 VICTOR (PerkinElmer, Zaventem, Bélgica).

Ratones y
in vivo
experimentos


En vivo
experimentos incluyeron 6 a 8 semanas de edad, machos SCID, Rag2
- /- /? c
- /- y ratones NOD /SCID (Charles River Laboratories, Calco, Como, Italia), que se encuentra en el animal libre de patógenos específicos las instalaciones del Departamento de Cirugía, Oncología y Gastroenterología, Universidad de Padua (Italia). Los animales se alojaron con un ciclo de luz de 12 horas /oscuro, de la temperatura (22 +/- 1 ° C) y humedad (55 +/- 5%) ambiente controlada. Todos los ratones se les permitió libre acceso a agua y una dieta de mantenimiento. Todas las jaulas alojan hasta 6 animales y virutas de madera contenidos y con un tubo de cartón para el enriquecimiento ambiental. Los procedimientos que implican animales y su cuidado estaban en conformidad con las directrices institucionales que cumplen con las leyes nacionales e internacionales y las políticas (DL 116/92 y circulares de aplicación posteriores), y el protocolo experimental (n ° 7/2012) fue aprobado por el comité de ética local de la Universidad de Padua (CEASA). Durante
in vivo
experimentos, los animales en todos los grupos experimentales fueron examinados diariamente para que una disminución de la actividad física y otros signos de la enfermedad; animales gravemente enfermos (pérdida de peso inferior o igual a 15%, letargo, pelo rizado, baja temperatura) fueron sacrificados por sobredosis de dióxido de carbono.

Winn ensayo.

Winn ensayo se llevó a cabo mediante la inyección por vía subcutánea los ratones SCID con 5 × 10
6 PC3 o células tumorales PC3-PIP por animal, mezclado con cualquiera de las células T-cuerpo-hPSMA /eGFP RPMI o (5 × 10
6 /ratón; 6 ratones /grupo). El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: V (mm
3) = (d
2 * D) /2, donde d (mm) y D (mm) son las y los mayores diámetros tumorales perpendiculares más pequeños, respectivamente, según la evaluación de medición del calibre.

tratamiento locorregional.
sc
Para evaluar el potencial terapéutico del tratamiento loco-regional, se inyectó a los ratones SCID con 5 × 10
6 células PC3-PIP. Cuando los tumores se vuelven palpables sobre cuatro días más tarde, los ratones fueron asignados al azar al grupo de control (que se dejaron sin tratar) o el grupo experimental (se les inyectó por vía intralesional con las células T CAR transducidas a las 72 horas después de la transducción; 6 ratones /grupo). Se analizaron dos resultados primarios: el crecimiento tumoral se controló con el tiempo por medición del calibre y la supervivencia global fue grabado

El tratamiento sistémico de los tumores de próstata subcutáneos

Para evaluar la actividad terapéutica de la T sistémica.. sc-cuerpo administración, se inyectó a los ratones SCID con 5 × 10
6 células PC3-PIP y 4 días después recibieron i.v. T-cuerpo-hPSMA /Fluc (10 × 10
6 /ratón) a las 72 horas o 5-6 semanas después de transducción (n = 6); animales no tratados sirvieron como grupo de control (n = 6). biodistribución de células T se evaluó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) en las mismas condiciones, excepto que los ratones fueron inyectados con células PC3-PIP o tumorales PC3 en el flanco derecho e izquierdo, respectivamente.

modelo de tumor de próstata diseminado.

Para configurar un modelo de tumor de próstata diseminado, SCID, Rag2
- /- /? c
- /- y ratones NOD /IV se inyectaron ratones SCID con diferentes números (que va de 1 × 10
5 a 5 × 10
6) de las células PC3-PIP-Fluc transducidas (6 ratones /grupo). prendimiento y crecimiento del tumor fueron evaluados por BLI. Por otra parte, SCID libre de tumor, Rag2
- /- /? C
- /- y ratones NOD /SCID se inyectaron con 20 × 10
6 T-cuerpo-hPSMA /Fluc, para evaluar su suerte por iv BLI (6 ratones /grupo).

experimentos de inmunoterapia adoptiva.

En los experimentos de inmunoterapia adoptiva, se inyectaron bioluminiscente PC3-PIP en ratones NOD /SCID y Rag2
- /- /? c
- /- ratones (1 x 10
5 /ratón). Cuatro días más tarde, los animales fueron asignados al azar al grupo de control (que se dejaron sin tratar) o el grupo experimental, en el que recibieron i.v. 20 × 10
6 T-cuerpo-hPSMA /eGFP por 3 veces en una semana (6 ratones /grupo). El crecimiento tumoral se controló semanalmente por BLI, y se registró la supervivencia.

Quantitative bioluminiscencia

Quantitative BLI es una poderosa tecnología que permite obtener varias imágenes longitudinalmente y, al mismo tiempo, para reducir los animales números. imágenes de bioluminiscencia se recogieron con el sistema de imágenes IVIS Lumina II (PerkinElmer). De diez a 15 minutos antes de formación de imágenes, los animales fueron anestesiados con isoflurano /oxígeno y i.p. administrado con 150 mg /kg de D-luciferina (PerkinElmer) en PBS. Tres ratones fueron imágenes simultáneamente con tiempos de exposición de 0,5 a 3 min. Un campo de 12 cm × 12 de vista y bajo, medio, o altos niveles de agrupación se aplicaron para maximizar la sensibilidad y resolución espacial. imágenes ventrales se obtuvieron para cada animal y se cuantificaron a través de la región de interés (ROI). Living Software Image (PerkinElmer) se utilizó para adquirir y cuantificar los conjuntos de datos de imágenes de bioluminiscencia.

evaluación citofluorimétrico de expresión hPSMA en el crecimiento de tumores

células tumorales suspensiones se obtuvieron por digestión enzimática con 270 unidades /ml de DNasa, 35 U /ml de hialuronidasa, y /tampón de colagenasa ml 200 U (todos de Sigma-Aldrich). Después de una incubación de 30 min a 37 ° C, se pasaron las células a través de un filtro de células de 70 micras (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Las muestras fueron teñidas a 4 ° C con un ratón anti-hPSMA mAb [19] seguido de un anti-IgG1 de ratón anticuerpo secundario conjugado con PE (BioLegend) y se analizaron en un citómetro de (BD) citómetro de flujo. Los datos se evaluaron con el software FlowJo (TreeStar Inc., Olten, Suiza).

El análisis estadístico

método de Kaplan-Meier de productos límite se realizó para estimar las curvas de supervivencia, y la comparación de la supervivencia entre grupos se realizó mediante la prueba de log-rank. Los análisis estadísticos se realizaron con el Sigmaplot (versión 12.3) paquete estadístico.

Resultados

Construcción y desarrollo de un LV bidireccional eficiente para la expresión del coche anti-hPSMA

A CAR secuencia fue diseñado que codifica los siguientes componentes en-marco de 5 'a 3' extremos (Fig 1A.): una secuencia líder, el anticuerpo de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo IgGD2B nuevo anti-hPSMA [19], la secuencia de la etiqueta c-myc, y la molécula CD28 coestimuladora a la secuencia de CD3. Decidimos explotar este nuevo anti-PSMA scFv (scFvD2B) para la construcción de nuestro coche, debido a sus características muy atractivas, en particular, la afinidad nanomolar para el objetivo que es similar a la que se evidencia por todo el anticuerpo J591 [19] . Además, nuestra scFvD2B muestra alta especificidad y identifica un epítopo diferente del reconocido por el anticuerpo J591, según la evaluación de los experimentos de competición realizadas con radio-inmunoligandos o anticuerpos marcados con biotina ([19] y datos no presentados).

(A) anti-hPSMA mapa CAR. CE: dominio extracelular; TM: dominio transmembrana; IC: dominio intracelular. (B) cytofluorimetric perfil de expresión CAR en transfectadas las células T 293. 293 T células fueron transfectadas con secuencia CAR teniendo pcDNA3.1 vector y se analizaron por citometría de flujo después de 24 horas (línea oscura). Las células no transfectadas (trama gris) sirvieron como control. (C) la expresión del coche según lo evaluado por Western Blot a las 24 horas (línea 1) y 7 días (línea 2) publicar 293 transfección de células T. Los controles negativos fueron el medio solo (línea 3) y 293 no transfectadas las células T (línea 4). Línea 5, marcadores de peso molecular. mapa (D) lineal del vector viral recombinante que contiene el promotor bidireccional minCMVPGK (22). En particular, el gen informador (eGFP o luciferasa) está bajo el control del promotor minCMV, mientras que el gen CAR está bajo control del promotor hPGK. (E) Transducción de células Jurkat con LV CAR anti-hPSMA /eGFP. Co-expresión de c-myc y eGFP en células Jurkat transducidas-LV, como se evaluó por citometría de flujo. gráfico de puntos informa de los eventos cerrados en las células viables totales; más de 90% de las células co-expresan tanto c-myc y eGFP. (F) Transducción de células Jurkat con LV CAR anti-hPSMA /luciferasa.
Panel izquierdo
, la expresión de c-myc (negro) en las células Jurkat a 72 h después de transducción, según lo evaluado por citometría de flujo. parcela gris representa el control de isotipo. Las células Jurkat
Panel derecho
, transducidas-LV Evaluación de la actividad luciferasa en (2 × 10
5 /pocillo) por BLI.

Para evaluar la capacidad de la construcción de conducir la expresión de un receptor que se monta correctamente en la membrana de la célula, la secuencia CAR anti-hPSMA se clonó en el vector pcDNA3.1 y se usó el plásmido resultante para la transfección transitoria de células 293 T. En diferentes puntos de tiempo a partir de entonces, la expresión del receptor quimérico se evaluó por análisis de transferencia Western y cytofluorimetric (Fig. 1B y 1C, respectivamente), utilizando el mAb anti-c-myc. Resultados revelaron que el coche fue montado correctamente en la membrana y tenía el peso molecular esperado (aproximadamente 60 kDa); expresión CAR ya era detectable 24 horas después de la transfección, a desaparecer rápidamente los próximos días debido a la falta de una etapa de selección (Fig. 1C). Posteriormente, la secuencia CAR se insertó en un LV que lleva un promotor bidireccional que permite la transcripción de un gen indicador (eGFP o Fluc) desde el promotor mínimo aguas arriba minCMV, sin afectar a la expresión aguas abajo de la CAR anti-hPSMA a partir del promotor hPGK eficiente (Fig . 1D). Para evaluar la funcionalidad de los vectores de lentivirus, las células Jurkat fueron transducidas con LV CAR hPSMA /eGFP y LV CAR hPSMA /Fluc. CAR resultó ser altamente expresado ya 72 horas después de la transducción, como se demuestra por el alto porcentaje de c-myc
+ células detectadas por citometría de flujo análisis (Fig. 1E y 1F). En particular, las células que expresan CAR-eran más de 90% cuando transducidas con LV CAR hPSMA /eGFP (Fig. 1E) y más de 60% cuando se utiliza LV CAR hPSMA /Fluc (Fig. 1F,
panel izquierdo
). En particular, los vectores de LV bidireccional aparecieron para conducir la expresión de cualquiera de los CAR y los genes indicadores con una eficiencia muy equilibrado, como se demuestra por la alta intensidad de señal de eGFP (Fig. 1E) y la actividad de la luciferasa relevante (Fig. 1F,
panel de la derecha
).

caracterización fenotípica de las poblaciones de células T transducidas CAR

Para la generación de las poblaciones de células T que expresan CAR anti-hPSMA, se desarrolló un protocolo de rápida expansión . La hora óptima infección se estableció después de 48 horas de la activación con OKT3, ya que en este punto de tiempo se obtuvo el mayor porcentaje de células T que expresan CAR (Fig. 2A,
panel izquierdo
), y un fenotipo menos diferenciadas , según la evaluación de la alta expresión de CD27, CD28 y CD62L marcadores (Fig. 2A,
panel central
). Posteriormente, el protocolo de expansión implicó la re-estimulación semanal con células PC3-PIP que permitió una proliferación rápida y sostenida de las poblaciones Fluc tanto T-cuerpo-hPSMA /eGFP y T-cuerpo-hPSMA /(Fig. 2A,
panel de la derecha
).

(A) Puesta en marcha de protocolo de transducción y la cinética de crecimiento.
Panel
izquierda, las PBMC se activaron con OKT3 en el tiempo 0 y transducidas de forma concomitante (TD0), o después de 48 h (Td2) o 72 horas (h) Td3. Citometría de flujo análisis de la expresión etiqueta c-myc se realizó 72 horas después de la infección.
El panel central y los informes de la expresión de CD27, CD28 y CD62L en las tres condiciones diferentes de activación /infección reportados en el panel

izquierdo.
Panel derecho, España Expansión de T-cuerpo-hPSMA /Fluc y T-cuerpo-hPSMA /eGFP transducidas después de la activación de 48 horas en respuesta a la re-estimulación semanal con células PC3-PIP. No transducidas PBMC se utilizaron como control. (B) y la expresión del fenotipo CAR en las células T transducidas a la estimulación.
panel izquierdo
, la expresión de marcadores de superficie en T-cuerpo anti-hPSMA /Fluc en diferentes puntos de tiempo (3, 11 y 18 días) después de transducción, tal como se evaluó mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. La superposición de los resultados se obtuvieron en T-cuerpo anti-hPSMA /eGFP.
Panel derecho, España porcentaje de c-myc
+ células en poblaciones de células T transducidas-eGFP LV CAR hPSMA /Fluc y LV CAR hPSMA /en diferentes puntos temporales después de transducción. La Figura muestra la media +/- SD de al menos tres experimentos independientes. (C) Cinética de subconjuntos CD4 y CD8 en poblaciones de células T transducidas. La expresión de los marcadores CD4 y CD8 en c-myc
+ - cerrada T-cuerpo-hPSMA /eGFP
(panel izquierdo)
y T-cuerpo-hPSMA /Fluc (
panel de la derecha)
poblaciones en diferentes puntos de tiempo después de transducción, según lo evaluado por citometría de flujo. Los datos provienen de un experimento representativo de tres que produjo resultados similares.

Para definir mejor el estado de diferenciación de los linfocitos T CAR transducidas en el período posterior a la infección durante la re-estimulaciones antigénicas, expresión de diferentes marcadores de superficie (CD62L, CD27, CD28, CCR7, CD57) se evaluó mediante análisis cytofluorimetric. Setenta y dos horas después de la transducción, el perfil emergente fue esencialmente de células T temprano efectoras, como se muestra por la alta expresión de CD62L, CD27 y CD28, la presencia de células CCR7 positivos y la baja expresión de CD57 (Fig. 2B,
panel de la izquierda
). Después de re-estimulaciones con el antígeno, las células T de memoria adquirieron un fenotipo efector intermedio con la baja modulación progresiva de CD62L, CD28 y CCR7 y un ligero aumento en la expresión de CD57 (Fig. 2B,
panel izquierdo
). Curiosamente, mientras que el encuentro posterior con el antígeno condujo a la expansión de la población CAR-expresión (Fig. 2B,
panel derecho
), una dicotomía se pudo observar entre la expansión subconjuntos de células T. De hecho, mientras que la expresión CAR era casi igual dentro de la CD4
+ y CD8
+ T poblaciones de células inmediatamente después de la infección, la re-estimulación antigénica determinó la acumulación progresiva de la CD8
+ solamente subconjunto de células T, que casi completamente sobrepuso CD4
+ T células por mes uno después de la transducción (Fig. 2C).

caracterización funcional de las células T que expresan CAR

expresión CAR proporcionado la población transducida con la capacidad de reconocer el antígeno hPSMA en la superficie de líneas de células de tumor de próstata, y para mediar una citotoxicidad alta y específica (Fig. 3A). De hecho, tanto el T-cuerpo-hPSMA /Fluc y poblaciones T-cuerpo-hPSMA /eGFP lisaron las células PC3 transfectadas con hPSMA sin dañar la contraparte antígeno-negativas; que es más importante, sino que también eran capaces de reconocer las células diana LNCaP que albergan el antígeno natural hPSMA. La citotoxicidad fue ya evidente, aunque a niveles bajos, 3 días después de la transducción y el aumento en los niveles máximos justo después de una sola ronda de reestimulación antígeno, que se mantiene constante a partir de entonces hasta 2 meses después de la infección. Aparte de ejercer una actividad citotóxica relevante, las células T CAR transducidas en diferentes etapas de la diferenciación también producen altos niveles de IFN-γ en respuesta a las células tumorales hPSMA que expresan (Fig. 3B y 3C), pero no contra las células de control negativo hPSMA. Como control negativo, las células T no infectadas no produjeron IFN-γ cuando se co-cultivaron con células PC3 ingeniería genética para expresar el antígeno hPSMA superficie.

(A) actividad lítica de T-cuerpo-hPSMA /eGFP y T -cuerpo-hPSMA /Fluc. La citotoxicidad se analizó a las 3, 11 y 60 días después de la transducción; Se han usado PC3, PC3-PIP y LNCaP células como células diana. Untransduced PBMC sirvió como control negativo. En la esquina superior izquierda de cada panel de los porcentajes de c-myc
se reportan + células T. La figura muestra la media +/- SD de 4 experimentos independientes. (B) la secreción de IFN-γ a la estimulación de antígeno. la producción de IFN-γ se analizó en diferentes puntos de tiempo después de la transducción de PBMC mediante la estimulación de T-cuerpo-hPSMA /Fluc con PC3-PIP hPSMA
+ o PC3 hPSMA
- líneas celulares de cáncer. T-organismos no estimuladas o tratadas con PMA /ionomicina representados los controles negativo y positivo, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares con T-cuerpo-hPSMA /eGFP. (C) la expresión de c-myc en T-cuerpo-hPSMA /poblaciones Fluc probado para la producción de IFN-γ.

Análisis de la eficacia terapéutica de la administración de anti-hPSMA T-cuerpo contra los tumores de próstata locales


En vivo
eficacia terapéutica de las células T CAR transducidas en las diferentes etapas de diferenciación (72 horas o 5 semanas después de la transducción) se evaluó inicialmente utilizando un ensayo de Winn (Fig. 4A). En particular, cuando eran células tumorales PC3-PIP co-inyectados con T-cuerpo-hPSMA /eGFP no se observó crecimiento tumoral (Fig. 4A,
panel izquierdo
), independientemente de la etapa de diferenciación de T-cuerpos . Por otro lado, la transferencia de células T no impactó significativamente el crecimiento de las células tumorales negativas hPSMA-PC3 (Fig. 4A,
panel de la derecha
).

(A) Ensayo de Winn. PC3-PIP (
panel izquierdo
) y PC3 (
Tarjetas telefónicas panel derecho) se inocularon por vía subcutánea células tumorales en ratones SCID, solo o mezclado 01:01 con T-cuerpo-hPSMA /eGFP en flancos opuestos del mismo animal. El crecimiento tumoral se controló con el tiempo por la medición de la pinza.

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