Extracto
En este estudio se utilizó el perfil de heces para identificar las bacterias intestinales y metabolitos que son diferencialmente representados en los seres humanos con cáncer colorrectal (CCR) en comparación con los controles sanos para identificar qué funciones microbiana puede influir en el desarrollo de CCR. Las muestras de heces se recogieron de los adultos sanos (n = 10) y pacientes con cáncer colorrectal (n = 11) antes de la cirugía de resección de colon en el Hospital Universitario de Valle Colorado Health-Poudre en Fort Collins, CO. La región V4 del gen 16S rRNA fue pyrosequenced y ambos ácidos grasos de cadena corta y metabolitos de heces globales fueron extraídos y analizados utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). No hubo diferencias significativas en la estructura de la comunidad microbiana en general asociado con el estado de la enfermedad, pero varios géneros bacterianos, particularmente butirato especies productoras, se subrepresentados en las muestras de CRC, mientras que una mucina que degradan la especie,
Akkermansia muciniphila
, era aproximadamente 4 veces mayor en CRC (p & lt; 0,01). cantidades proporcionalmente mayores de butirato se observaron en las heces de los individuos sanos, mientras que las concentraciones relativas de etilo fueron mayores en las heces de los pacientes con CCR. GC-MS reveló perfiles de concentraciones más altas de aminoácidos en muestras de heces de pacientes con CRC y superior poli y ácidos grasos monoinsaturados y ácido ursodesoxicólico, un ácido biliar conjugado en muestras de heces de los adultos sanos (p & lt; 0,01). El análisis correlativo entre los conjuntos de datos combinados reveló algunas relaciones potenciales entre los metabolitos de heces y ciertas especies bacterianas. Estas asociaciones podrían dar una idea de las funciones microbianas que se producen en un entorno de cáncer y ayudarán estudios mecánicos directos futuras. Usando integrados "ómicas" enfoques puede resultar una herramienta útil en la identificación de grupos funcionales de bacterias gastrointestinales y sus metabolitos asociados como nuevas dianas terapéuticas y quimiopreventivos
Visto:. Weir TL, Manter DK, Sheflin AM, Barnett BA, Heuberger AL, EP Ryan (2013) heces microbioma y diferencias entre Metabolome pacientes con cáncer colorrectal y adultos sanos. PLoS ONE 8 (8): e70803. doi: 10.1371 /journal.pone.0070803
Editor: Bryan A. White, de la Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Abril 2013; Aceptado: 24 Junio 2013; Publicado: 6 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Weir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH NCI R03CA150070, estación Experimental de Agricultura de Colorado (CAES), y la Fundación Shipley. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
un sistema digestivo saludable se basa en una biota comensal equilibrada para regular los procesos tales como la cosecha de energía alimentaria [1], el metabolismo de los microbios y de acogida derivados químicos [2], y la modulación inmune [3]. La acumulación de pruebas sugiere que la presencia de patógenos microbianos o un desequilibrio en la comunidad bacteriana nativa contribuye al desarrollo de ciertos cánceres gastrointestinales. Una relación causal entre el cáncer gástrico y
Helicobacter pylori
se ha establecido [4], que conduce a la hipótesis de que otros organismos de acogida asociada están implicados en la etiología del cáncer.
Una asociación entre cáncer colorrectal ( CRC) y bacterias comensales se ha sospechado desde hace décadas. Por ejemplo,
Streptococcus infantarius
(anteriormente
S.
Bovis) se convirtió en el diagnóstico importante después se reconoció que la bacteriemia por este microorganismo fue a menudo asociada con la enfermedad neoplásica colorrectal [5], [6] . Sin embargo, los primeros estudios que asocian géneros de bacterias con el riesgo de cáncer de colon se limitan a los métodos basados en cultivos que no reflejan la complejidad de la microbiota gastrointestinal [7] - [9]. Desarrollo de secuenciación de alto rendimiento ha facilitado estudios detallados de la microbiota intestinal, y está emergiendo un cáncer colorrectal más minuciosa y compleja (CRC) -asociado microbioma. Sobhani et al. [10] encontró que el Bacteroides /
Prevotella
grupo estaba representado-over en ambas muestras de heces y la mucosa de individuos con cáncer de colon en comparación con sus homólogos libres de cáncer. También encontraron que los
Bifidobacterium longum
,
Clostridium clostridioforme
, y
La cepa de R. bromii
estaban insuficientemente representadas en las muestras de estos individuos y concluyó que la falta de correlación entre el estadio del tumor /tamaño con las poblaciones representadas sobre-sugerido un papel contributivo de las bacterias en el desarrollo tumoral. Dos estudios adicionales, publicados simultáneamente, examinaron la microbiota presente en la mucosa del tumor y el tejido sano adyacente de las personas con cáncer de colon y ambos estudios revelaron una sobrerrepresentación de
Fusobacterium spp
[11], [12], mientras que otros tienen reveló una gran cantidad de
Coriobacteria
y otras especies probióticas [13], [14].
La pregunta es si el exceso de representación de determinadas especies de microbios en las heces y muestras de la mucosa es indicativo de un contributiva papel en el desarrollo de CRC o una consecuencia del medio ambiente del tumor. Aunque un papel causal de la biota intestinal en el desarrollo CRC no se ha demostrado, no hay evidencia para sugerir que la inducción de las respuestas pro-inflamatorias por comensales contribuir a la iniciación del tumor y el desarrollo [10], [14]. La producción de genotoxinas y daña el ADN radicales superóxido son también mecanismos por los que los comensales pueden contribuir al desarrollo de CCR [15]. Como alternativa, se ha planteado la hipótesis de que ciertas bacterias probióticas actúan como recolectores tumorales, aprovechando un nicho ecológico creado por los cambios fisiológicos y metabólicos en el microentorno del tumor [14].
Para aclarar el papel de la biota intestinal en el desarrollo de la CRC, será necesario ir más allá taxonómica sobre-representación y examinar los cambios en el microbioma CRC asociado en un contexto más funcional. Un parámetro importante es la forma funcional comensal organismos contribuyen al flujo de metabolitos y la descomposición de los componentes de la dieta. Por lo tanto, la metabolómica, el estudio de los cambios globales en los metabolitos en respuesta a los estímulos biológicos [16], está siendo aplicado para identificar y caracterizar el microbioma funcional que impulsa los cambios metabólicos asociados con diferentes dietas, genotipos, y estados de enfermedad [17] - [19 ]. los perfiles de las heces de metabolitos se han validado como un medio para evaluar intestino actividad microbiana [20] y el presente estudio contribuye a la creciente lista de microbios intestinales en el microbioma CRC, pero también utiliza un enfoque metabonómica para identificar posibles interacciones microbioma-metabolome.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
consentimiento
Todos los individuos siempre informado por escrito antes de participar en el estudio. Todos los protocolos de estudio fueron aprobados por la Universidad del Estado de Colorado (números de protocolo y 10-1670H 9-1520H) y Poudre Valley Hospital-Universidad de Juntas de Revisión Institucional del Sistema de Salud de Colorado (números de protocolo 10-1038 y 10 a 1006).
Recogida de muestras y extracción de ADN
las muestras de heces se obtuvieron de individuos sanos (n = 11) y pacientes con cáncer de colon diagnosticados recientemente (n = 10) antes de la cirugía para la resección del colon (Tabla 1-nota: no todas las muestras fueron sometidos a todos los análisis. Ver Tabla 1 nota al pie). Los criterios de exclusión para todos los participantes incluyeron el uso de antibióticos dentro de los dos meses de participación en el estudio, y el uso regular de AINE, las estatinas, o probióticos. Los individuos que informaron crónica trastornos intestinales o alergias alimentarias /restricciones en la dieta también fueron excluidos del estudio. la exclusión adicional para pacientes con CRC incluye tratamientos de quimioterapia o radiación antes de la cirugía. Se proporcionaron muestras de heces para el análisis antes de la administración de antibióticos preoperatorios o preparación intestinal. Las muestras fueron transportadas al laboratorio dentro de las 24 horas después de la recogida de los participantes del estudio. Las muestras de heces se homogeneizaron, y tres sub-muestras fueron recogidas con hisopos de algodón estériles. Se extrajo ADN de todas las muestras usando kits de extracción de ADN Powersoil MoBio (Mobio, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenó a -20 ° C antes de la amplificación pasos.
Análisis pirosecuenciación
la amplificación de la región V4 del gen 16S rRNA bacteriano se realizó por triplicado usando cebadores 515F y 806R marcadas con 12 pb de corrección de errores de códigos de barras de Golay [21]. Veinte reacciones l que contenía 5 Prime Hot Master Mix (5 Prime, Inc., Gaithersburg, MD) se amplificaron a 94 ° C durante 5 minutos seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 63 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, seguido de una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Replicar reacciones de PCR de cada muestra se combinaron y se purificó en gel usando el kit de extracción de gel GenElute (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguido de una purificación adicional con perlas de AMpure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) y se cuantifica con el PicoGreen análisis de ADN (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) antes de la puesta en común de la biblioteca. Pirosecuenciación se realizó bajo contrato por parte de la Universidad de Fondo para Engencore Secuenciación de Carolina del Sur el uso de un sistema FLX Life Sciences GS 454 con la química estándar.
Todo secuencia de leer la edición y procesamiento se realizó con Mothur Ver. 1.25 [22] utilizando la configuración predeterminada a menos que se indique lo contrario. Brevemente, la secuencia lee eran (i) de recorte (bdiff = 0, pdiff = 0, qPROMEDIO = 25, minLength = 100, maxambig = 0, maxhomop = 10); (Ii) alineado con la alineación SILVA-bacteriana subconjunto disponible en la página web Mothur (http://www.mothur.org); (Iii) se filtró para eliminar espacios vacíos verticales; (Iv) se pasará por quimeras potenciales utilizando el método de uchime; (V) el uso de la base de datos clasificada Green Genes (http://www.mothur.org) y el clasificador Bayesiano ingenuo [23] incrustado en Mothur. Todas las secuencias identificadas como cloroplasto se eliminaron; (Vi) secuencias fueron seleccionadas (optimizar = minLength-end, criterios = 95) y se filtró (vertical = T, Trump =.) De manera que todas las secuencias de cubiertas el mismo espacio genética; y (vii) todas las secuencias fueron pre-agrupado (esta = 2) para eliminar el ruido potencial pirosecuenciación y agrupados (calc = onegap, coutends = F, = método más cercana) en UOT [24]. Para eliminar el efecto del tamaño de la muestra en la composición estadísticas de la comunidad, submuestras de 1250 lee fueron seleccionados al azar de cada muestra de materia fecal. Después de la agrupación secuencia lee en Otus (es decir, primeros vecinos en un 3% la distancia genética) o filotipos (es decir, secuencias que coinciden con un género común en la base de datos de Green Genes), las sub-muestras replicadas se promediaron para producir un único perfil de la comunidad para cada muestra. valores independientes del tamaño de muestra para los descriptores de la comunidad de diversidad alfa como la riqueza de especies observada (
S
obs
), las estimaciones de Chao1 riqueza total de especies (
S
Chao
), la diversidad de Shannon (
H '
) y la uniformidad (
e
H
), y la diversidad de Simpson (1-D) y equitatividad (e
D) se determinaron mediante el ajuste de una 3- parámetro de la curva exponencial [
y
=
y0
+
una gratis (1-e
-bx
)] para los parámetros enrarecidos más de una gama de 100 a 1.250 secuencia lee, donde los máximos asintótica es igual a la suma de
y0
y
a
. número efectivo de especies se calcula como S
H = exp (H ') para el índice de Shannon y el S
D = 1 /D de Simpson. Todos los datos de secuencia está disponible al público a través de la secuencia de lectura del archivo (SRA) con el número de estudio ERP002217, que está disponible en el siguiente enlace: http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP002217.
nontargeted metabolito de perfiles y métodos de procesamiento de datos
cien miligramos de muestra de heces liofilizadas se extrajeron dos veces con 1 ml de isopropanol 03:02:02: acetonitrilo: agua centrifuga a 14.000 rpm durante 5 minutos y se los sobrenadantes se combinaron. El extracto se secó utilizando un SpeedVac, se resuspendió en 50 l de piridina que contiene 15 mg /ml de hidrocloruro de metoxiamina, se incubaron a 60 ° C durante 45 min, se sonicó durante 10 min, y se incubaron durante 45 min adicionales a 60 ° C. A continuación, se añadieron 50 l de N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida con 1% trimetilclorosilano (MSTFA + 1% TMCS, Thermo Scientific) y las muestras se incubaron a 60 ° C durante 30 min, se centrifugó a 3000 xg durante 5 min, se enfriaron a temperatura ambiente, y 80 l del sobrenadante se transfirió a un inserto de vidrio de 150 l en un vial automuestreador GC-MS. Los metabolitos se detectaron utilizando una traza de GC Ultra acoplado a un Thermo DSQ II (Thermo Scientific). Las muestras se inyectaron en una relación 01:10 de división dos veces en bloques aleatorios discretos. La separación se produjo usando una columna de 30 m TG-5MS (Thermo Scientific, 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 m de espesor de película) con una tasa de flujo de gas helio 1,2 ml /min, y el programa consistía en 80 ° C durante 30 seg, una rampa de 15 ° C por minuto hasta 330 ° C, y una retención de 8 min. Masas de entre 50 a 650
m /z
fueron escaneadas a 5 lecturas /seg después de la ionización por impacto de electrones. Para cada muestra, una matriz de características moleculares como se define por el tiempo de retención y la masa (
m /z
) se generó utilizando el software XCMS [25]. Características se normalizaron a la corriente de iones total, y la cantidad relativa de cada característica molecular se determinó por el área media del pico cromatográfico entre inyecciones repetidas (n = 2). características moleculares se formaron en grupos de pico utilizando el software AMDIS [26], y los espectros se proyectarán en el Instituto Nacional de Estándares de Tecnología (www.nist.gov) y Golm (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/) bases de datos de metabolitos de identificaciones.
AGCC determinación.
Las muestras de heces se extrajeron de los ácidos grasos de cadena corta mediante la mezcla de 1 g de heces congeladas con agua acidulada (pH 2,5) y se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron y filtraron a través de filtros de nylon 0,45 M y se almacenaron a -80 ° C antes del análisis. Las muestras se analizaron mediante GC a Trace Ultra acoplado a un escaneo Thermo DSQ II de
m /z
50-300 a una velocidad de 5 lecturas /segundo en el modo de impacto electrónico. Las muestras se inyectaron en una proporción 10:01 de división, y la entrada se mantuvo a 22 ° C y la línea de transferencia se llevó a cabo a 230 ° C. La separación se consiguió en un 30 m TG-WAX-A columna (Thermo Scientific, 0,25 mm ID, 0,25 micras de espesor de película), utilizando un programa de temperatura de 100 ° C durante 1 min, rampa a 8 ° C por minuto a 180 ° C, celebrada a 180 ° C durante un minuto, incrementado a 200 ° C a 20 ° C /minuto, y se mantiene a 200 ° C durante 5 minutos. flujo portador helio se mantuvo a 1,2 ml por minuto. áreas de los picos se integraron por software Thermo Quan usando iones seleccionados para cada uno de los ácidos grasos de cadena corta, y las áreas se normalizaron a la señal total.
Análisis estadístico
Las diferencias en filotipos bacterianas y metabolitos globales entre muestras de individuos sanos y pacientes de cáncer de colon se determinaron utilizando AMOVA y el estudiante de pruebas t con un corte de significación de & lt; 0,01. Filotipos y metabolitos que fueron significativamente diferentes entre los grupos se perfeccionaron aún más mediante la eliminación de los marcadores que tenía menos de 25 totales lee (bacterias) o señales de fondo borderline (metabolitos) o que estaban presentes en menos de 3 muestras individuales. las concentraciones de ácido graso de cadena corta se determinaron en dos ciclos cromatográficos separados, por lo que una media ponderada se calculó para cada compuesto cuantificado y las diferencias estadísticas entre las muestras de heces de individuos sanos y pacientes con cáncer de colon se determinaron utilizando un modelo ANOVA mixto con el experimento que representa un efecto aleatorio y estado de la enfermedad como de efectos fijos (2011.1 XLSTAT, Addinsoft Corp, París, Francia). Las correlaciones entre los metabolitos y las bacterias se determinaron utilizando la r de Pearson con una correlación moderada e identificado por un r≥0.50 y una fuerte correlación identificado por un r≥0.70.
Resultados y Discusión
diversidad alfa y beta en las heces Biota
descriptores comunitarios típicos de diversidad alfa para los datos moleculares microbianos incluyen riqueza OTU reales y estimadas, y los índices de diversidad de la población y la uniformidad. En sistemas en los que los patógenos se introducen (por ejemplo,
Helicobacter pylori)
, existen marcadas disminuciones en las estimaciones de diversidad y equidad [27] lo que sugiere que estos índices pueden ser predictores útiles de infección. Examinamos estos parámetros en muestras de heces de individuos sanos y aquellos con CRC para ver si podían ser utilizados como predictores de la enfermedad state.We observaron diferencias significativas en la distancia genética del 3% en el promedio de la diversidad o uniformidad de las comunidades microbianas de heces saludable individuos en comparación con aquellos con CRC (Tabla S1). La cobertura promedio obtenido de 1.250 lecturas por muestra fue de 84% y 86% en muestras sanas y de cáncer de colon, respectivamente. La diversidad media efectiva de cada grupo sugirió una tendencia hacia la diversidad bacteriana más alta en las muestras de heces de los individuos sanos (S
H = 63
, S
D = 20) en comparación con los de pacientes con CRC (S
H = 46
, S
D = 15); Sin embargo, la variación interindividual era demasiado grande para alcanzar significación estadística. Sobre la base de estos datos, se sugiere que los descriptores de diversidad alfa de la microbiota fecal no son indicativas de patología en la CRC; a pesar de una limitación de este estudio es que sólo se analizaron muestras de heces y no tejido de la mucosa. Sin embargo, a pesar de las diferencias inherentes en las heces y las comunidades microbianas de la mucosa nuestros resultados son consistentes con otros informes publicados sobre el total de las estimaciones de diversidad bacteriana y la uniformidad entre el CRC y el taburete tejido sano y /mucosasamples [10].
Esta variación interindividual también era evidente en las estimaciones de la diversidad beta, donde se observó un bajo grado de similitud en la composición de la comunidad microbiana global entre los individuos como se determina utilizando la distancia de Jaccard no ponderado (J
clase) para comparar miembros de la comunidad (Figura 1A) y Yue y Clayton [28] índice (Θ
YC) para comparar las estructuras de la comunidad (Figura 1B). Debido a esta variación, no hay patrones en la composición general de la comunidad se observaron entre las muestras de heces de pacientes con CCR e individuos sanos.
Las diferencias taxonómicas entre CRC y muestras de heces saludables
El estado de la enfermedad de los participantes del estudio no expulsaron estructura general de la comunidad de la microbiota fecal, y la composición y abundancia relativa de la mayoría de especies fueron similares, aunque hubo una tendencia no significativa hacia una mayor Verrucomicrobia en muestras de pacientes con cáncer de colon (Figura 2). También hubo niveles más altos de Synergetes en el grupo de cáncer, pero esto fue impulsado por un único individuo con una proporción extremadamente alta de este filos y no era representativa de toda la población con cáncer secuenciada. Sin embargo, en el género /especie nivel hay una serie de OTU de que fueron significativamente sub-representadas en las heces de pacientes con cáncer de colon en comparación con los individuos sanos (Tabla 2). Estos incluyen varios
Bacteroides
Gram-negativas y
Prevotella spp
. que previamente han sido aislados de heces humanas, pero no están bien caracterizados con respecto a su papel en la función intestinal o la salud en general. Dos de los
Prevotella
especies identificadas no sólo estaban insuficientemente representados, pero eran completamente ausentes de las muestras de cáncer de colon analizados.
Prevotella
era una géneros dominantes reportados en las heces de los niños en una comunidad rural en Burkina Faso, pero ausente de una cohorte de niños italianos, y los autores del estudio la hipótesis de que
Prevotella
ayudaron a maximizar la obtención de energía a partir de una dieta basada en plantas [29]. Por lo tanto, es posible que los niveles más altos de
Prevotella
en la cohorte saludable pueden reflejar diferencias en la ingesta de fibra y otros compuestos de la planta en comparación con los individuos con cáncer de colon. A nivel de género, Shen et al [30] encontró que el
Bacteroides spp.
Ser enriquecido en los tejidos del colon de individuos sanos, en comparación con el tejido de adenoma. Lachnospiracae y miembros de los géneros
Dorea
y
La cepa de R.
también fueron reportados como previosly filotipos dominantes conducción diferencias entre las muestras de tejidos sanos y cancerosos [13]. El otro UOT que identificamos como el
Dialister spp.
Y
Megamonas spp
. no han sido previamente reportado en asociación con el cáncer de colon; Sin embargo, las poblaciones de disminución
Dialister invisus
han sido reportados en la enfermedad de Crohn [31].
H números de las muestras indican muestras de adultos sanos mientras que la designación C significa muestras de pacientes con cáncer de colon.
Hubo menos bacterias identificables que estaban sobrerrepresentados en la población con cáncer de colon (Tabla 3). En particular, se observó que las bacterias que degradan la mucina,
Akkermansia muciniphila
, lo que representó un porcentaje relativamente grande de las secuencias totales, estaba presente en una proporción significativamente mayor en las heces de los pacientes con cáncer de colon. Esta bacteria es un miembro común de la microbiota colónica y recientemente se demostró que ser reducido en el síndrome del intestino irritable y la enfermedad de Crohn [32]; sin embargo, un informe más reciente mostró aumentado
A. muciniphila
en la colitis ulcerosa asociada a reservoritis [33]. Hay dos tipos de mucinas, MUC1and MUC5AC, se sobreexpresa en los cánceres de colon reportedely [34], lo que sugiere que nuestro observaron aumentos relacionados con el CRC en
A. muciniphila
poblaciones pueden ser debido a un aumento de la disponibilidad de sustrato.
Citrobacter farmeri
, que puede utilizar citrato como única fuente de carbono también fue mayor en las muestras de pacientes con cáncer de colon, pero representó una proporción mucho más pequeña de las secuencias bacterianas totales.
Citrobacter farmeri
se encuentra entre un grupo de bacterias del intestino que incluye varias especies patógenas como
Salmonella
y
Shigella, España y que tiene arilamina
N-acetiltransferasa
actividad que puede estar involucrado en la activación de carcinógenos y el metabolismo de xenobióticos [35].
la edad y el IMC representan otros factores que desempeñan un papel en la formación de las comunidades microbianas intestinales. Varios informes han demostrado una correlación entre la proporción de Bacteroidetes a Firmicutes y la obesidad [1]. Hemos llevado a cabo regresiones lineales entre la abundancia relativa de cada uno de los taxones que significativamente diferente entre CRC y taburetes sanos (véanse los cuadros 2 y 3) y el IMC y vio correlaciones significativas (Tabla S2). Además, el envejecimiento se ha asociado con una disminución en los anaerobios comensales de protección, como
Feacalibacterium prausnitzii, España y un aumento en
E. coli
[
36
]. Nos encontramos una correlación negativa entre la edad de los participantes y
Dorea formicagens gratis (R
2 = 0,354; p = 0,041) y
La cepa de R. obeum gratis (R
2 = 0,434 ; p = 0,020), ambos miembros del grupo Clostridium XIVa, lo que sugiere que las diferencias entre cohortes con respecto a estas dos especies pueden ser el resultado de diferencias en la edad media de los participantes en cada grupo en lugar de CRC estado de la enfermedad. Para nuestro conocimiento, una disminución de la población de miembros del grupo Clostridium XIVa no se ha asociado anteriormente con el envejecimiento, pero se ha asociado con disbiosis relacionada con las condiciones inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn [37]. Ninguno de los otros taxones bacterianos identificados se correlacionaron con la edad (Tabla S3). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la mayoría de los taxones que difería significativamente en muestras de heces entre las cohortes sanas y CRC fue el resultado de estado de la enfermedad y no de las diferencias en la edad o el índice de masa corporal.
grasos de cadena corta análisis de ácidos
metabolitos microbianos ácidos grasos de cadena corta (AGCC), especialmente butirato, son ampliamente estudiados informado que tienen efectos anti-tumorigénicos [38]. SCFA de son fácilmente absorbidos y utilizados en los tejidos del huésped lo que la detección en las heces se considera típicamente una indicación de la producción en exceso de la que puede ser utilizado por el anfitrión [29]. Nosotros y otros [10], [13] hemos observado que las especies de bacterias productoras de butirato, como
La cepa de R. spp
. y
Pseudobutyrivibrio ruminis
, fueron más bajos en las muestras de heces de pacientes con CCR en comparación con los controles sanos. Por lo tanto, hemos cuantificado varios ácidos grasos de cadena corta a partir de muestras de heces congeladas. Los tres principales SCFA producidos como metabolitos microbianos, acetato, propionato, y butirato, fueron detectados como eran valérico, isobutírico, isovalérico, caproico, heptanoico y ácidos. Entre estos, los ácidos acético y valérico fueron significativamente mayores en muestras de heces de pacientes con CRC (p & lt; 0,0001 y p = 0,024, respectivamente) mientras que el ácido butírico fue significativamente mayor en las heces de individuos sanos (P & lt; 0,0001; Figura 3). No se detectaron diferencias en ácido propiónico entre los dos grupos. El butirato es considerado como uno de los nutrientes más importantes para los colonocitos normales, y solo o en combinación con propionato de que se ha demostrado para reducir la proliferación e inducir la apoptosis en carcinomas de colon humano [39]. Aunque el acetato es un importante SCFA para mantener la salud del colon y como una molécula de precursor para la producción endógena de colesterol, los niveles elevados de este metabolito han sido previamente asociado con la CRC en los seres humanos [40]. Acetato se puede utilizar para producir butirato y diferencias proporcionales en estos metabolitos entre CRC y muestras sanas puede reflejar un agotamiento de microbios colónicos que se puede llevar a cabo esta reacción en las muestras de CRC o puede ser un resultado de la degradación de butirato de etilo con bajo pH del colon asociado con el CRC. También observamos concentraciones relativas significativamente más altos de isobutírico (p & lt; 0,0001) y el ácido isovalérico (p = 0,002) en las muestras de individuos con CRC (Figura 3). Estos dos resultado de SCFA de metabolismo bacteriano de la cadena de aminoácidos valina y leucina ramificado, que también fueron superiores en las muestras de heces CRC (Tabla 4), y puede tener en cuenta los aumentos significativos observados en estos dos AGCC en la población CRC.
el ácido acético, ácido valérico, ácido isobutírico, y las concentraciones de ácido isovalérico eran proporcionalmente más elevado, mientras que el anti-proliferativa AGCC, ácido butírico fue significativamente menor.
globales de heces metabolitos
las muestras de heces permitir efectuar una evaluación de las bacterias que residen en el lumen intestinal, y por lo tanto, se consideran moléculas pequeñas de heces como resultado de co-metabolismo o intercambio metabólico entre los microbios y células huésped [13]. metabolito de perfiles mundial realizado en el presente documento en muestras de heces liofilizadas proporcionó información sobre la relación entre las poblaciones microbianas y metabolitos, y se presta a la identificación de nuevos biomarcadores metabólicos CRC. La técnica de análisis multivariante supervisada, proyección ortogonal de Estructuras-discriminante latentes Análisis (OPLS-DA), lo que facilita la interpretación mediante el modelado por separado variables predictoras y ortogonales (no predictivas), se utilizó para determinar si los perfiles que no son objeto de GC-MS fueron predictivos de estado de la enfermedad del donante. El OPLS-DA demostró modelado satisfactorio y capacidad de predicción para este conjunto de datos (R2Y = 0,986; QY2 = 0,927), revelando una clara separación entre las características heces metabólicas de los dos grupos (Figura 4), lo que sugiere que la presencia o ausencia de CRC es un importante factor que impulsa la variabilidad de los metabolitos de heces.
en comparación con los controles sanos, análisis de heces metaboloma reveló 11 aminoácidos que mostraron un aumento del 41-80% en las muestras de heces de los individuos con CRC (Tabla 4). Las razones que podrían explicar este aumento asociado a la CRC en amino concentraciones de ácido pueden incluir, pero no limitarse a las diferencias en los patrones de consumo de proteínas, la reducción de la inflamación inducida por la absorción de nutrientes, y el aumento de la autofagia asocian con las células tumorales que resulta en la acumulación de aminoácidos libres piscinas [41]. La degradación microbiana de proteínas de la dieta en el colon distal es un proceso putreficative que resulta en la producción de aminas tóxicas, y puede tener en cuenta el aumento de los aminoácidos libres que observamos en las muestras de heces de CRC. Un aumento de la concentración de todos los aminoácidos excepto la glutamina se había informado anteriormente en los tejidos del estómago y de tumor de colon en comparación con tejido sano [42]. Los autores plantearon la hipótesis de que las células tumorales pueden exhibir una mayor actividad glutaminasa que resulta en la conversión de glutamina en glutamato. De acuerdo con estos resultados, también hemos visto un gran incremento, aproximadamente el 76%, en glutamato sin un aumento correspondiente en la glutamina en muestras de heces de pacientes con cáncer de colon. Otro estudio reciente usando RMN para identificar y detectar metabolitos a partir de extractos de agua de heces de muestras sanas y CRC mostró que las muestras de CRC tenían aproximadamente 1,5 veces mayores niveles de cisteína, prolina, leucina y [43]. El aumento de las concentraciones de prolina, serina y treonina que se observaron en las muestras de CRC también podrían ser el resultado de la degradación de las mucinas intestinales, que se componen principalmente de las glicoproteínas ricas en estos aminoácidos [44]. Esto es consistente con el enriquecimiento de
Akkermansia muciniphila
, una mucina de degradación de bacterias, observada en las muestras de heces de CRC; aunque no vimos fuertes correlaciones entre la proporción relativa de estas bacterias y las concentraciones de aminoácidos específicos.
Hubo niveles más altos de glicerol, así como varios ácidos grasos insaturados detectados en las muestras de heces de los individuos sanos. células de cáncer de humanos tienen un sistema de transporte conocido para la captación de glicerol, lo que sugiere glicerol heces puede ser menor en CRC porque está siendo absorbido por las células tumorales. Alternativamente, las lipasas bacterianas presentes en individuos sanos pueden facilitar el metabolismo de los triglicéridos de la dieta y producido endógenamente, lo que resulta en los productos de degradación finales de glicerol y ácidos grasos libres. Además de glicerol, ácidos grasos más adaptada a las firmas metabolómicos para el ácido linoleico, y estereoisómeros de ácido oleico también fueron más altos en los controles (Tabla 4). Por último, el ácido ursodesoxicólico (UDCA), un ácido biliar secundaria producida por las bacterias intestinales fue de aproximadamente 63% mayor en individuos sanos en comparación con CRC. Mientras que varios ácidos biliares tales como ácido lithicolic y ácido desoxicólico se han asociado con la tumorigénesis, el AUDC ha mostrado efectos quimiopreventivos en modelos preclínicos y animales de CRC [45].
El análisis de correlación de los datos microbioma y metabolome reveló fuertes asociaciones entre algunos miembros de los metabolitos de la microbiota fecal y candidatos.