Extracto
130 B microARN (miR-130b) se desregula significativamente en diversos tipos de tumores humanos. En este estudio, el uso de un ensayo de microarrays, se caracterizó la regulación positiva de la expresión de miR-130b en muestras de cáncer colorrectal (CRC). Sin embargo, existe un conocimiento limitado acerca de las funciones de la expresión de miR-130b aberrante en el CCR. Nuestros estudios en células CRC demostraron que miR-130b disminuye significativamente la migración celular y la invasión, pero tiene efectos no evidentemente sobre la proliferación celular y la apoptosis. En la sobreexpresión células miR-130b CRC y los especímenes de CRC, se observó una disminución del nivel de la integrina β1 proteína, que se considera como una molécula clave implicada en la motilidad celular. La focalización de la región 3'-UTR del gen de la integrina β1 por miR-130b se reveló utilizando un ensayo indicador de luciferasa. La regulación de la integrina β1 por miR-130b se muestra además el uso de los imitadores de miR-130b y el inhibidor de miR-130b. La motilidad alterada de las células de sobreexpresión de miR-130b se recupera en parte por la expresión de la integrina β1 que carecen de la 3'-UTR. Además, la caída de β1 integrina también da lugar a una disminución en la migración celular y la invasión, que es similar a la motilidad impedido debido a la sobreexpresión de miR-130b en las células de CRC. Además, se observaron las expresiones inversas de miR-130b y β1 integrina en muestras de CRC. En resumen, estos datos demuestran que el miR-130b regula a la baja su objetivo β1-integrina, lo que lleva a la migración alterada y la invasión de las células CRC
Visto:. Zhao Y, Miao G, Li Y, Isaji T, J Gu , Li J, et al. (2014) microARN 130b suprime la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal a través de la regulación a la baja de la integrina β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10.1371 /journal.pone.0087938
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 7 de noviembre de 2013; Aceptado: 3 de diciembre de 2013; Publicado: 3 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 81101859, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 81270379, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 81070231 y la Fundación de Ciencias Naturales Beijing 5102039. Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miARN) son cortos no ARN de codificación de 24 a 25 nucleótidos que median el silenciamiento de genes a través de la hibridación imperfecta a 3 'región no traducida (3'-UTR) en ARNm diana [1]. MiRNAs juegan un papel importante en las actividades de prácticamente todos los biológicos en mamíferos y otros organismos multicelulares [2]. Por otra parte, se ha informado de que miRNAs influyen numerosos procesos cáncer relevante como la migración, proliferación. Más importante aún, las moléculas de microARN ya están entrando en la clínica como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico para la estratificación del paciente y también como dianas y agentes terapéuticos [3]. Recientemente, el miR-130b se revela como uno de los nuevos miRNAs relacionados con el tumor y ha desregulado de manera significativa en los tumores por un metanálisis integral de miARN expresión de microarrays de datos, que consta de 33 comparaciones y cerca de 4.000 nontumors tumorales y las correspondientes muestras [4]. En consecuencia, el miR-130b se ha encontrado aumentada en varios tipos de cáncer: cáncer gástrico [5], [6], el melanoma maligno cutáneo [7], carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas [8] y el cáncer de vejiga [9]. En conjunto, se ha estimado que el miR-130b juega un papel clave durante la oncogénesis.
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda en mujeres en todo el mundo. Aproximadamente 608.000 muertes por cáncer colorrectal se estima que en todo el mundo, por lo que es la cuarta causa principal de muerte por cáncer [10]. En la actualidad, uno de los obstáculos en el tratamiento del cáncer es la alta tasa de metástasis tumoral. El proceso metastásico sigue de una serie de pasos: primero, las células cancerosas dentro del tumor primario se desprenden de las células vecinas e invaden la membrana basal. Esta invasión local puede con frecuencia ser activado por señales contextuales que causan que las células cancerosas se someten a una transición epitelio-mesenquimal (EMT) [11]. Después de intravasación, las células podrían extravasación de la circulación en el tejido circundante, en los que pueden permanecer latentes o iniciar y mantener el crecimiento de formar metástasis angiogénicos [12], [13]. La metástasis es la principal causa de muerte en muchos tipos de cáncer, incluyendo CRC [14] - [16]. Por lo tanto, se requiere una mejor comprensión de los mecanismos moleculares metástasis subyacente para facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas eficaces para los pacientes con CCR.
En nuestro estudio, se compararon los genes miARN expresión en muestras de pacientes con CRC utilizando un microarray y microARN observado la regulación al alza significativa de miR-130b expresado en las muestras de CRC. Para ganar la penetración en la piel de miR-130b en el CCR, se investigaron los efectos de miR-130b en las células y las muestras de CRC CRC. Nuestros datos sugieren que la integrina β1 es un gen diana de miR-130b y la regulación a la baja de la integrina β1 por miR-130b conduce a la migración alterada y la invasión de células de CRC.
Procedimientos Experimentales
Clínica especímenes
El cáncer colorrectal y muestras de tejido de control adyacentes se obtuvieron de 33 pacientes en el hospital de Pekín, Ministerio de Salud (Pekín, china) después de la resección quirúrgica. Los tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes fueron congelados en nitrógeno líquido después de la resección. Ningún paciente en el estudio actual recibido quimioterapia o terapia de radiación antes de la cirugía. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para el uso de sus tejidos, de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Geriatría Beijing, Ministerio de Salud.
Análisis de Micro RNA microarrays
Los pequeños ARN fueron aisladas de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes. Los procedimientos de control de calidad, etiquetado, la hibridación y la digitalización se realizaron por CapitalBio (Pekín, China), usando GeneChip miARN V1.0 chip de gama de la Affymetrix. Genes expresados diferencialmente entre los tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes fueron analizados utilizando el software SAM 3,02. MiRNAs que cumplieron con los criterios de valor q (%) ≤5 y doble cambio ≥2 o doble cambio ≤0.05 entre grupos se consideraron significativamente diferentes. mapa de calor se realizó utilizando el paquete de software Cluster 3.0. Los datos presentados en este estudio se han depositado en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) y son accesibles a través de la serie GEO adhesión GSE53592.
Cultivo de células
La líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW-480 y SW-620 se adquirieron de la célula Centro de recursos, IBMS, CAMS /PUMS y pasaron en menos de 6 meses. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibco, Paisley, Reino Unido) con 10% de FBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) y 2 mmol /L de L-glutamina (Gibco, Paisley, UK), 100 U /ml de penicilina (Gibco, Paisley, Reino Unido), y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina (Gibco, Paisley, Reino Unido).
clonación Pri-miR-130b, la producción y la transducción de lentivirus
El gen 130b microARN primaria humana (pri-miR-130b) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico humano usando los siguientes cebadores: 5'-Forward ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 'y 5'-Reverse ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3', y luego se subclonó en el vector pLVX-IRES-Hyg ( Takara, Dalian, china) para generar pLVX-miR-130b. Las partículas virales se cosecharon 48 h después de la transfección de pLVX-miR-130b en células HEK-293T utilizando el mix de envases Lenti-HT (Takara, Dalian, China). Las células SW480 se infectaron con el lentivirus recombinante cosechado en presencia de 6 g /ml polibreno (Sigma, St Louis, EE.UU.). Las células SW480 se mantuvieron en medio de crecimiento completo en presencia de 1 mg /ml de higromicina (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). La amplificación por PCR del pri-miR-130b también se subclonó en el vector lentiviral pWPI (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.) para generar pWPI-miR-130b. El vector pWPI vacío, que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), se utilizó como control. Las partículas de virus se cosecharon como se describe anteriormente. Las células SW620 de forma estable que expresan GFP fueron seleccionados por fluorescente de células activadas-(FACS), con el uso de un clasificador de células Vantage SE Diva (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).
ARN invertido transcripción y cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR)
El ARN total, incluyendo los pequeños RNAs, fue extraído de las muestras clínicas o de las células de CRC con un kit de aislamiento mirVana microARN (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y se sometió a transcripción inversa. QRT-PCR se realizó utilizando con la mezcla SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Dalian, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las muestras se corrieron en un Sistema de PCR de detección (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) iQ5 Multicolor en tiempo real . Se utilizaron ciclos de reacción térmica de 95 ° C durante 30 s, y 45 repeticiones de 95 ° C durante 5 s y 60ºC durante 20 s. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: hsa-miR-130b adelante 5'-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 'hsa-miR-130b inverso 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'; U6 adelante 5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 '; U6 inverso 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 '
reportero de luciferasa ensayo
La larga duración región 3' no traducida (3'-UTR) fragmentos del gen de la integrina β1 se amplificaron por PCR a partir ADN usando cebadores genómicos humanos adelante 5'-GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 'y revertir 5'-TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, y se clonaron en un vector pMD18-T (Takara, Dalian, china). El
Sac
I-
Sal
productos digeridos-I fueron clonados en un pmirGlo luciferasa Dual-expresión de miRNA Target vector (Promega, Madison, EE.UU.) para formar 3'-UTR-luciferasa reportero de vectores . Las células SW480 se cotransfectaron en placas de 24 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) con el vector reportero 3'-UTR-luciferasa y los miRNAs indicados. Veinticuatro horas después de la transfección, las actividades de luciferasa de Renilla luciérnaga y se midieron consecutivamente usando el ensayo de luciferasa dual (Promega, Madison, EE.UU.), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Negativo vector de control se generaron clonando el mismo 3'-UTR de la integrina β1 gen en orientación inversa. La actividad de las muestras se midió en un luminómetro GloMax 20/20 (Promega, Madison, EE.UU.). La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó por la actividad de luciferasa de Renilla para eficiencia de transfección.
Transfección de células
El plásmido usado para la expresión de la integrina β1 que carecen de la 3'-UTR (β1-ORF) se describió anteriormente [17]. Utilizamos pWPI vector como control. Los miméticos de hsa-miR-130b, inhibidor de hsa-miR-130b (anti-miR-130b), imita control y siRNA contra β1 integrina [18] fueron sintetizados por Ribobio (Guangzhou, China). Las secuencias utilizadas fueron las siguientes: imita hsa-miR-130b, 5'-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 '; hsa-miR-130b inhibidor, 5'-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 '; integrina β1 siRNA, (sentido) 5 'GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3' [18]; Las células SW480 se transfectaron usando RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
ensayo de migración celular y la invasión de ensayo
La migración celular ensayo se evaluó utilizando cámaras transwell (8-M, BD Bioscience, San José, EE.UU.). 5 × 10
5 células se colocaron en la cámara superior de cada inserto, y se añadieron 500 l de medio completo a la parte inferior también. Las células que no migraron se retiraron de las superficies superiores de los filtros utilizando hisopos de algodón, y las células que habían migrado a las superficies inferiores de los filtros se fijaron con solución de paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Imágenes de tres campos aleatorios fueron capturados de cada membrana, y se contó el número de células migratorias. Se han usado insertos similares recubiertos con matrigel para determinar el potencial invasivo.
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se determinó usando un compuesto de tetrazolio [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio, sal interna (MTS) (CellTiter Cell 96 acuosa no radiactivos Ensayo de proliferación) (Promega, Madison, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante . Brevemente, en los tiempos indicados, los ensayos se llevan a cabo mediante la adición de la CellTiter 96 acuoso Una solución de reactivo directamente a los pocillos de cultivo, incubación durante 2 h y a continuación, el registro de la absorbancia a 490 nm con un lector de placas de 96 pocillos.
Western Blot
Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Billerica, EE.UU.). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% y se incubaron con el ratón anti-β1 integrina (1/2500, BD Biosciences, San José, EE.UU.), de ratón anti-E-cadherina (1/2000, BD Biosciences, San Jose, EE.UU.), de conejo anti-caspasa 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.), de conejo anti-caspasa 8 (1/800, Millipore, Billerica, EE.UU.) o el ratón anti-GAPDH (1/10000, Sigma , St Louis, EE.UU.) anticuerpos.
el análisis estadístico
los datos se presentan como la media ± SD La significación estadística entre los grupos fue evaluada por el estudiante de
t-test
. Un valor de
P
. & Lt; 0,05 se consideró como significación estadística
Resultados
La detección del aumento de los niveles de miARN-130b en el CCR especímenes
El uso de un ensayo de microarrays, hemos caracterizado los genes miARN expresión en tejidos de cáncer colorrectal (CRC) y marchó tejidos normales adyacentes cosechadas a partir de 3 pacientes (P1, P2, y P3). La caracterización de los pacientes con CRC se describe en la Tabla 1. Hemos probado miRNA diferenciales que expresan utilizando el paquete de SAM. Las 31 miRNAs upregulated significativamente (fig. 1A) sonda fija (fold≥2) fueron identificados en los especímenes de CRC. Y los 17 miRNAs regulación a la baja de manera significativa se muestran en la Tabla S1. En las lecturas de microarrays, nos dimos cuenta de que el miR-130b es uno de los miRNAs upregulated significativamente. Un creciente número de estudios han informado de miR-130b como miARN relacionada con el tumor y miR-130b juega un papel importante durante la oncogénesis [4]. Para entender mejor sus funciones potenciales en el CCR, en primer lugar, que utilizamos QRT-PCR para confirmar la expresión de miR-130b en los 3 pacientes con CRC (fig. 1B). De acuerdo con las lecturas de microarrays en la fig. 1A, los resultados QRT-PCR reveló la mayor expresión de miR-130b en los 3 tejidos tumorales CRC (Fig. 1B). a continuación, generamos vector lentiviral que expresa 130b microARN primaria (Lenti-pri-miR-130b) (Fig. 1C panel superior), y construimos las células SW-480 con sobreexpresión estable de miR-130b (células Lenti-miR-130b) y la respectiva control (células Lenti-vector). Se encontró que los niveles de la madurez de miR-130b se incrementan significativamente en las cuatro colonias de células Lenti-miR-130b, en comparación con las células Lenti-vector (Fig. 1C panel inferior).
, diagrama de mapa de calor de los 31 miRNAs significativamente elevados en tejidos de cáncer colorrectal en comparación con los tejidos adyacentes emparejados de control a partir de 3 pacientes (P1, P2 y P3). Los tejidos de control adyacentes se denominan N1, N2 y N3. Los tumores se denominan T1, T2 y T3. MiRNAs se muestran en las filas. Las muestras se muestran en columnas. Rojo en la barra de color indica una mayor expresión y azul indica una menor expresión. MiR-130b (
Red Arrow
) es uno de los miRNAs upregulated significativamente.
B Opiniones, expresiones relativas de miR-130b (normalizado a U6) en los tumores de más de tejidos de control adyacentes (T /N) de P1, P2 y P3, determinados por QRT-PCR (media ± SD, n = 3).
C
,
Panel superior
: Diagrama esquemático de un vector lentiviral pLVX-IRES-Hyg que contiene el microARN 130b primaria (Lenti-miR-130b).
Panel inferior
: expresiones relativas de miR-130b (normalizado a U6) en las células SW480, que expresa de forma estable el miR-130b (Lenti-miR-130b) o control (Lenti-control), examinado por QRT-PCR ( Media SD ±; n = 3). Los cuatro colonias de células Lenti-miR-130b se denominan 1,2,3,4.
miR-130b disminuye la migración y la invasión de las células CRC
A continuación examinó cómo miR-130b podría funcionar dentro de las células de cáncer colorrectal. Se utilizaron las células Lenti en vectores y células Lenti-miR-130b para analizar los efectos de miR-130b en las células de CRC. Las células se sometieron en primer lugar a ensayo de migración y ensayo de invasión, respectivamente. Hemos observado que miR-130 B inhibe de manera significativa la migración de las células Lenti-miR-130b (Fig. 2A). A continuación, examinó el efecto de miR-130b en la invasividad de las células utilizando el sistema de ensayo de invasión de Matrigel. De acuerdo con el resultado del ensayo de migración, la invasividad se reduce significativamente en las células Lenti-miR-130b (Fig. 2B). Interesante, no hay diferencia significativa en la proliferación entre las células Lenti en vectores y células Lenti-miR-130b (Fig. 2C). Por otra parte, no se observan las obvias diferentes niveles de expresión de apoptosis caspasa 3 y caspasa caspases- 8 entre las células Lenti en vectores y células Lenti-miR-130b (Fig. 2D). Todos estos resultados sugieren que la sobreexpresión de los resultados de miR-130b en la alteración de la motilidad celular de las células de CRC, pero no tiene ningún efecto sobre la proliferación y la apoptosis de las células de CRC.
A, B
, Transwell la migración (
Un
) y la invasión (
B Opiniones) ensayos de células de control y las células Lenti Lenti-miR-130b (barra de escala = 100 micras, con una media ± SD, n = 4; * ,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01). Imágenes representativas de células migradas (
Un
) y células invadidas (
B Opiniones) se muestran.
C
, la proliferación de las células de control y las células Lenti Lenti-miR-130b medido por el ensayo de MTS durante el transcurso de tiempo de tres días (media ± S.D. .; n = 4).
D
, análisis de Western blot de la caspasa-3 y caspasa-8 expresión en células de control y las células Lenti Lenti-miR-130b de tres experimentos independientes. GAPDH utilizado como control de carga.
miR-130b suprime la integrina β1 expresión a través de su extremo 3 'UTR
Además, investigó el mecanismo por el que el miR-130b afecta a la movilidad de las células CRC . Nuestros estudios previos habían demostrado que la modificación post-traduccional juega un papel importante en la migración mediada por la integrina [17], [19], [20]. Las integrinas son una familia de moléculas de adhesión celular que comprende 18α y 8β subunidades que se combinan en al menos 24 heterodímeros. Más importante aún, el dominio citoplásmico de integrina β1 transduce señales bidireccionales desde el interior de la célula mediante la regulación de la conformación y el ligando afinidades del dominio extracelular (señalización de dentro a fuera), mientras que la mediación de señalización corriente abajo y la interacción con el citoesqueleto (fuera-en la señalización) [ ,,,0],21] - [23]. Por lo tanto, la integrina β1 es un regulador clave implicada en la metástasis
in vitro
y
in vivo
[24] - [27]. En este estudio, se encontró que la expresión ectópica de miR-130b en las celdas SW480 resultado en una disminución de la integrina endógeno β1 nivel de proteína de cuatro colonias Lenti-miR-130b por aproximada 50%, en comparación con la de las células Lenti-vector ( Fig. 3A). El resultado consistente se observó en células SW-620 con sobreexpresión de miR-130b (Fig. 3B). Sin embargo, no hay ningún cambio en el nivel de expresión de E-cadherina (Fig. 3C), que es un molecular clave involucrada en EMT. Y como se mencionó antes, la EMT es el paso inicial en la metástasis. También se examinó la expresión de la integrina β1 en los 3 pares de muestras sometidas a la micromatriz se muestra en la Fig. 1A. Consistente con los datos de la figura. 3A y la fig. 3C, la integrina β1 expresión de la proteína se disminuye en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales adyacentes correspondientes (Fig. 3D (a)), mientras que no se detectó ningún cambio obvio de la expresión de E-cadherina (Fig. 3D (b)) . Es notable que se ha detectado la disminución del nivel de la integrina β1 proteína en la sobreexpresión células miR-130b CRC (células Lenti-miR-130b) y las muestras de CRC también. Por lo tanto, hemos tratado de investigar si el miR-130b puede regular β1 integrina
Un
,
Panel superior
:. Análisis de Western blot de la expresión de la integrina β1 proteína en Lenti-Control células y células Lenti-miR-130b (SW480 células) de tres experimentos independientes.
Panel inferior
: Densitometría análisis de los datos de Western blot normalizados con GAPDH (media ± S.D. .; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05).
B Opiniones (
a
), las expresiones relativas de miR-130b (normalizado a U6) en las células SW620 infectados con el virus de control de Lenti o lentivirus-miR-130b, examinado por QRT-PCR (media ± DE, n = 3). (
b
),
Panel superior
: análisis de Western blot de la integrina β1 expresión en Lenti-control y células Lenti-miR-130b (SW620 células) de tres experimentos independientes.
Panel inferior
: Densitometría análisis de los datos de Western blot normalizados con GAPDH (media ± S.D. .; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05).
C
, expresión de la proteína de la E-cadherina analizado por inmunoblot en las células de control y las células Lenti Lenti-miR-130b de tres experimentos independientes. Las cuatro colonias de células Lenti-miR-130b (SW480 células) se denominan 1,2,3,4. GAPDH utilizado como control de carga.
D
, los niveles de expresión de la integrina β1 (
a
) y E-cadherina (
b
) se determinaron mediante análisis de Western blot usando los emparejados los tejidos de control adyacentes ( N) los tumores (T) de los pacientes con cáncer colorrectal (3 paciente 1 paciente 2, y el paciente 3). Cada ensayo se repitió tres veces de forma independiente. GAPDH utilizado como control de carga.
En primer lugar, examinar si el miR-130b fue capaz de interactuar con la 3'-UTR de la integrina β1, se realizó un reportero ensayos de luciferasa en las células SW480. La completa 3'-UTR de la integrina β1 gen se clonó en el Dual-Luciferase reportero vector pmirGlo. Las células SW-480 fueron co-transfectadas con el vector que contiene el pmirGlo 3'-UTR de la integrina beta 1 y miR-130b imita (Fig. 4A), el resultado mostró significativamente menor expresión de la luciferasa en comparación con las células transfectadas con el mismo reportero imita control de vectores y de microARN (NC) (Fig. 4A). El efecto de miR-130b en la expresión de luciferasa fue eliminado cuando el 3'-UTR de β1 integrina se clonó en orientación inversa (3 'ITGB1-rev) (Fig. 4A). A continuación, para confirmar la regulación de miR-130b a la integrina β1 en las células CRC, hemos probado el nivel de la proteína integrina β1 en las células transfectadas con imita el miR-130b y inhibidor de miR-130b (anti-miR-130b), respectivamente (Fig. 4B ). Los resultados mostraron que la expresión de la integrina β1 se suprime después de la transfección con imita miR-130b (Fig. 4B (a)). Desmontables endógeno miR-130b con el inhibidor de miR-130b aumenta la integrina β1 expresión (Fig. 4B (b)). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la integrina β1 es un gen diana de miR-130b.
Un
, La completa 3'-UTR del gen de la integrina β1 (3'-ITGB1) eran clonó en el vector reportero pmirGlo Dual-luciferasa y co-transfectadas con miR-130b imita (miR-130b) y controlar imita miR (NC) en las células SW480, respectivamente. Un vector de control fue generado clonando el mismo 3'-UTR de la integrina β1 gen en orientación inversa (3 'ITGB1-rev). La actividad de luciferasa de luciérnaga se midió y se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla (media ± S.D. .; n = 3; *, P & lt; 0,05).
B Opiniones, análisis de transferencia Western de la integrina β1 expresión en las células SW480 transfectadas con NC, imita el miR-130b (
panel de un
) y el control inhibidor de miR (Anti-NC) o miR-130b inhibidor (anti-miR-130b) (
Panel b
) de tres experimentos independientes. Densitometría análisis de los datos de Western blot normalizados con GAPDH (media ± SD, n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05) guía empresas
miR-130b inhibe la migración celular y la invasión. a través de la regulación por disminución de la expresión de la integrina β1
Para investigar más a fondo que la supresión de la integrina β1 por los resultados de miR-130b en la motilidad alterada de las células Lenti-miR-130b, se realizó un experimento de rescate integrina β1 utilizando el Lenti- células de miR-130b. Empleamos una construcción de expresión que codifica el marco de la integrina β1 de lectura abierto (β1-ORF) que carecen de la 3'-UTR [17], que produce un ARNm que es resistente a la supresión mediada por miRNA. Hemos observado un claro aumento en la expresión de la integrina β1 en las células Lenti-miR-130b transfectadas con β1-ORF, en comparación con las células con vector de control (Fig. 5A). Además, los ensayos de migración de células mostraron que la expresión ectópica de la integrina β1-ORF fue capaz de recuperar en parte la motilidad de las células Lenti-miR-130b por 76% (Fig. 5B y 5C).
Un
,
panel de la izquierda
: análisis de Western blot de la integrina β1 expresión en células de control de Lenti, células Lenti-miR-130b, las células Lenti-miR-130b transfectadas con el vector de control vectorial o β1-ORF de tres experimentos independientes.
Panel derecho
: Densitometría análisis de los datos de Western blot normalizados con GAPDH (media ± S.D. .; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05).
B, C
, ensayos de migración Transwell de las células (barra de escala = 100 micras, con una media ± S.D. .; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05). se muestran imágenes representativas de células migradas. Lenti-miR-130b + control de vectores: las células Lenti-miR-130b transfectadas con el vector de control. Lenti-miR-130b + β1-ORF: las células Lenti-miR-130b-β1 transfectadas con vectores ORF. ORF:. Marco de lectura abierto
integrina β1 posteriormente inhibe la expresión utilizando un siRNA [18] en las células SW-480 (Fig. 6A). Hemos encontrado que la migración de células (Fig. 6B) y la invasión (Fig. 6C) se reducen notablemente a través de la inhibición de la integrina β1 expresión con un siRNA específico. Por lo tanto, la disminución de la motilidad celular se logra a través de la supresión de la expresión de la integrina β1. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el miR-130b suprime la migración celular y la invasión, al menos en parte, a través de la regulación a la baja de la integrina β1 en las células de CRC.
Un
, análisis de Western blot evaluó la proteína nivel de la integrina β1 en las células SW480 transfectadas con un siRNA contra β1 integrina beta 1 (siRNA) o control negativo siRNA (Scramble) a 20 nM y 50 nM, respectivamente. Cada ensayo se repitió tres veces de forma independiente.
B, C
, la migración Transwell (
B Opiniones) y la invasión (
C
) ensayos de células SW480 transfectadas con siRNA β1 o Scramble a 50 nM (barra de escala = 100 micras, con una media ± SD, n = 3; **,
P Hotel & lt; 0,01). Imágenes representativas de células migradas (
B Opiniones) y células invadidas (
C
) son mostradas.
correlación inversa entre el miR-130b y la expresión de la integrina β1 en el CCR especímenes
a fin de probar la correlación entre la integrina β1 y miR-130b, que amplió el análisis de una cohorte de 33 pares emparejados de los tejidos tumorales normales (N) y colorrectal adyacentes clínicos (T). Se analizó la expresión de miR-130b por QRT-PCR y el nivel de expresión de la integrina β1 por Western blot. Como se muestra en la Fig. 7, mediante la comparación de los tumores a los tejidos normales, una correlación inversa entre miR-130 B y la expresión de integrina β1 se encontró en 23 de 33 (69,7%) pares de muestras clínicas. De los 23 pares, 12 pares mostraron que el aumento de miR-130b y la disminución de la integrina β1; 11 pares demostraron la disminución de miR-130b y la integrina β1 elevado.
La expresión de miR-130b se midió mediante QRT-PCR, la expresión de la integrina β1 se midió por análisis de Western blot en una cohorte de 33 igualada -pairs de normal adyacente (N) y los tejidos tumorales (T). La proporción relativa de la expresión de miR-130b (normalizado a U6) en T más de N (N /T) fue representada como una diferencia de pliegue (columnas en gris oscuro). La proporción relativa de la expresión de la integrina β1 (normalizado a GAPDH) en T más de N (N /T) fue representada como una diferencia de pliegue (columnas en gris claro). media ± S.D.. Cada ensayo se repitió tres veces de forma independiente.
Discusión
130 B microARN (miR-130b) se desregula significativamente en muchos tipos de tumores humanos. Sin embargo, el papel de miR-130b en CRC no se entiende bien. En este estudio, se determinó la expresión de microARN en el cáncer colorrectal (CCR), utilizando microarrays de perfiles de microARN de tumores y muestras de tejidos normales adyacentes. Se identificaron 48 miRNAs expresados diferencialmente significativamente asociados con el CRC. MiR-130b es uno de los miRNAs upregulated. Estos datos se confirmó además por QRT-PCR. Para probar la posible función de la mayor expresión de miR-130b en el CCR, hemos realizado ensayos funcionales después de la construcción de la línea celular estable CRC con sobreexpresión de miR-130b. Nuestros datos muestran que miR-130 B ejerce un efecto inhibidor significativo sobre la motilidad de las células de CRC (Fig. 2), pero no tiene efectos sobre la proliferación celular y la apoptosis. Se ha informado de que en el
TAp63
modelo de ratón knockout, regulación a la baja de miR-130b por la pérdida de los resultados TAp63 en un aumento de la metástasis del tumor [28]. La represión de miR-130b por un mutante p53 resultados en la mejora de la EMT ZEB1-dependiente y la invasión de células en células de cáncer de endometrio [29]. Todos estos datos sugieren que el papel de anti-metastásico de miR-130b. Además, la regulación a la baja de miR-130b confiere un fenotipo resistente a múltiples fármacos en células de cáncer de ovario [30]. Sin embargo, otro informe ha sugerido que la sobreexpresión de miR-130b en las células iniciadoras de tumores hepáticos CD133 (+) aumenta su capacidad de auto-renovación y la quimio-resistencia [31]. Estos resultados sugieren que el miR-130b puede tener una doble función como un supresor de tumores o un oncogén, que depende del tipo de cáncer y el contexto celular.
En este estudio, hemos identificado que la integrina β1 es una nueva diana de miR-130b. Una disminución del nivel de la integrina β1 proteína se observó debido a la sobreexpresión de miR-130b en las muestras de CRC (Fig. 3D) y en células de CRC (Fig. 3A y 3B) también. El ensayo indicador de luciferasa mostró que miR-130 B se une al extremo 3 'UTR de β1 integrina y suprime su expresión (Fig. 4). Un aumento en el miR-130b por imita el miR-130b transfección conduce a la reducción de la expresión de la integrina β1, mientras que desmontables miR-130b con miR-130b resultados inhibidor en el aumento de la integrina β1 expresión. Además, la motilidad alterada de células de sobreexpresión de miR-130b es rescatado en parte por la expresión de la integrina β1 que carecen de la 3'-UTR (Fig. 5). Además, la caída de β1 integrina también da lugar a una disminución en la migración celular y la invasión (Fig. 6). Estos datos indicaron que miR-130 B suprime la migración celular y la invasión de las células de CRC, al menos en parte, a través de regulación a la baja de la integrina β1. Por otra parte, la correlación inversa entre la expresión de miR-130 B y la expresión de integrina β1 se encontró en 23 de 33 pares (69,7%) de muestras clínicas de CRC. La inhibición de la migración y la invasión de las células CRC través de la orientación directa de la integrina β1 es consistente con la función anti-metastásico propuesta de miR-130b [28], [29]. Una gran cantidad de evidencia experimental apoya un papel esencial para la integrina β1 durante la inducción de tumores y la invasión [32] - [36].