: PLOS ONE
Extracto
de tipo lipocalina prostaglandina D sintasa (L-PGDS) es un miembro de la superfamilia de lipocalina, que se compone de proteínas transportadoras de secreción, y se une una amplia variedad de moléculas hidrófobas pequeñas. Utilizando esta función, hemos reportado la viabilidad de utilizar L-PGDS como nuevo vehículo de suministro de fármacos para fármacos poco solubles en agua. En este estudio, mostramos el desarrollo de un sistema de administración de fármacos utilizando L-PGDS, uno que permite el uso clínico directo de 7-etil-10-hidroxi-camptotecina (SN-38), un fármaco anti-cáncer poco soluble en agua . En presencia de 2 mM L-PGDS, la concentración de SN-38 en PBS aumento de 1130 veces en comparación con la de PBS. experimentos revelaron que calorimétricas L-PGDS obligado SN-38 en una relación molecular de 1: 3 con un valor de constante de disociación de 60 micras. Los resultados de un
vitro
ensayo de inhibición de crecimiento en revelaron que los SN-38 complejos /L-PGDS mostraron alta actividad anti-tumor contra 3 líneas celulares de cáncer humano, es decir, COLO201, MDA-MB-231, y PC-3 con una potencia similar a la de SN-38 se utiliza solo. La administración intravenosa de SN-38 complejos /L-PGDS a ratones con tumores COLO201 mostró un efecto antitumoral pronunciada. mucositis intestinal, que es uno de los efectos secundarios de este medicamento, no se observó en ratones administrados complejos de SN-38 /L-PGDS. Tomados en conjunto, L-PGDS permite el uso directo de SN-38 con efectos secundarios reducidos
Visto:. Nakatsuji M, Inoue H, Kohno M, Saito M, Tsuge S, Shimizu S, et al. (2015) En base-sintasa humana lipocalina-Tipo prostaglandina D Sistema de administración de fármacos para pobremente soluble en agua Anti-Cancer Drug SN-38. PLoS ONE 10 (11): e0142206. doi: 10.1371 /journal.pone.0142206
Editor: Han-Wu Chung, Academia Sinica, TAIWAN
Recibido: 10 Agosto, 2015; Aceptado: 19 Octubre 2015; Publicado: 3 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Nakatsuji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 25242046 (a TI) y 21200076 (a TI) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (http: //www .jsps.go.jp /Inglés /)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los compuestos que exhiben antitumoral actividades son conocidos por ser insoluble en agua y que tienen efectos secundarios graves en tejidos y órganos normales, lo que limita su eficacia y uso clínico de ellos [1]. Algunos enfoques comunes para mejorar la solubilidad de los fármacos contra el cáncer son la modificación química de las drogas y el uso de inductores de disolución, tales como disolventes orgánicos, agentes tensioactivos, lípidos, ciclodextrina, y modificadores de pH. Sin embargo, la modificación química de los medicamentos disminuye su potencia en muchos casos. El uso de solubilizantes es limitado debido a su toxicidad y tendencia a causar inestabilidad de drogas. Por lo tanto, los sistemas de administración de fármacos (DDS) para fármacos contra el cáncer poco solubles en agua que hacen uso efectivo de los diferentes tipos de vehículo de reparto de tamaño nanométrico, tales como liposomas, micelas poliméricas y dendrímeros, se han investigado intensamente [2-5]. Estos DDS establecido, sin embargo, también se han encontrado algunos problemas asociados con la toxicidad, la inmunogenicidad, la hemólisis, y trombogenicidad [6, 7]. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para el desarrollo de un nuevo DDS para fármacos contra el cáncer poco solubles en agua; y por lo tanto mucho esfuerzo se ha centrado en la mejora de la potencia, mejorar la seguridad y aumentar la solubilidad de estos fármacos.
Hemos informado anteriormente de que una novela DDS utilizando de tipo lipocalina prostaglandina D sintasa (L-PGDS, la figura 1A), un miembro de la familia de proteínas de lipocalina y una molécula no tóxica y no inmunogénica, podría facilitar la desarrollos clínicos de compuestos poco solubles en agua, tales como el diazepam y el 6-nitro-7-sulfamoilbenzo [f] quinoxalina farmacéutica y -2,3-diona, para su uso por administración oral o intravenosa [8]. L-PGDS es una proteína que actúa multi-funcional como PGD
2 de producción de la enzima [9], un eliminador de especies de oxígeno reactivas [10], y una proteína transportadora secretora para varias pequeñas moléculas lipofílicas [11]. Además, recientemente hemos informado de que L-PGDS actúa como un agente de barrido de la biliverdina, cuyos productos de degradación están involucrados en subaracnoidea por aneurisma vasoespasmo hemorragia inducida y la muerte celular neuronal [12]. L-PGDS tiene un pliegue lipocalina típica que consiste en una β-barril antiparalelo de ocho hebras, y el interior de este cilindro forma una cavidad hidrófoba [13-15] que se puede unir una gran variedad de ligandos lipófilos dentro de ella [11, 16 ]
(A) estructura cristalina de L-PGDS humana. (masa molecular: 18777.7, AP ID: 3O2Y). (B, C) las estructuras químicas de 38-SN (masa molecular relativa: 392,4) y CPT-11 (masa molecular relativa: 677,2)
SN-38, 7-etil-10-hidroxi. camptotecina (Fig 1B), es un análogo semisintético de la camptotecina alcaloide anti-cáncer que se dirige a la ADN topoisomerasa I [17]. Sin embargo, a pesar de su actividad anti-tumor potente, SN-38 no se ha utilizado directamente en la práctica clínica debido a su escasa solubilidad en agua [18]. Además, el anillo de lactona de SN-38 muestra la hidrólisis dependiente del pH reversible, y a un pH por debajo de 5,0, SN-38 existe en una forma activa con un anillo de lactona cerca en su estructura, mientras que puede ser convertido a una forma carboxilado inactivo a pH fisiológico por apertura del anillo [19]. Por lo tanto, es difícil de utilizar SN-38 bajo una condición fisiológica. Por el contrario, el clorhidrato de irinotecan (CPT-11, Fig 1C), que es un profármaco soluble en agua de SN-38, se utiliza en combinación con fluoropirimidinas como terapia de primera línea para los pacientes con cáncer colorrectal avanzado [20]. Sin embargo, la modificación química de SN-38 disminuye su actividad anti-tumor, dando lugar a 1.000 veces menos actividad citotóxica de CPT-11 en comparación con la de SN-38 contra varias líneas celulares de cáncer
in vitro
[21 , 22]. Por lo tanto, el uso directo de SN-38 como una forma activa usando DDS podría ser una gran ventaja para el tratamiento del cáncer
Aquí., Detallamos el desarrollo de un DDS utilizando humana L-PGDS, que permitió la utilización directa de SN-38. Se investigó el efecto de la L-PGDS en la solubilidad de SN-38, y examinamos la interacción entre L-PGDS y SN-38 mediante el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y de ángulo pequeño de dispersión de rayos X (SAXS). La actividad citotóxica de SN-38 complejos /L-PGDS se evaluó mediante el uso de colorrectal humano, de mama, y líneas celulares de cáncer de próstata. Su actividad anti-tumor se examinó en el modelo de xenoinjerto de tumor colorrectal humano COLO201. Para estimar los efectos secundarios de estos complejos, se realizó un análisis histopatológico y medimos los niveles de expresión de citoquinas inflamatorias en el intestino delgado. Por último, se realizó un ensayo de anafilaxis para evaluar el poder inmunógeno de L-PGDS. Los resultados, tomados en conjunto, demostraron ser humano L-PGDS ser un vehículo de administración de fármacos potentes para el SN-38.
Materiales y Métodos
Materiales
SN-38 fue comprado de Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokio, Japón); y CPT-11, de Yakult Honsha Co., Ltd. (Tokio, Japón).
La purificación del recombinante humano L-PGDS
C65A /C167A (ε
280 = 25.900 M
-1 cm
-1) sustituido con L-PGDS se expresó como el glutatión
S
transferasa proteína de fusión en
Escherichia coli BL21
(DE3; TOYOBO, Osaka, Japón) como se describe anteriormente [16]. La proteína de fusión se une a glutatión Sepharose 4B (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) y se incubaron durante la noche con 165 unidades de trombina para liberar la L-PGDS. La proteína recombinante se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel con HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Bio-Sciences) en tampón 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y después se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS).
solubilidad
se añadió una cantidad en exceso de SN-38 a tampón PBS (pH 7,4). La suspensión /PBS SN-38 se pre-incubó a 37 ° C durante 30 min, y luego se mezcla con una solución de L-PGDS. Esta solución se agitó a continuación a 37 ° C durante 6 h y después se concentró utilizando un dispositivo de filtro Amicon Ultra centrífuga (Millipore Corporation, Bedford, MA). El espectro de absorción del filtrado se obtuvo mediante el uso de una cubeta de cuarzo de 1,0 cm-light-ruta y el espectrómetro DU800 (Beckman Coulter, Pasadena, CA). Las concentraciones de SN-38 se determinaron por espectroscopia basada en el coeficiente de absorción molar de ε
380 en DMSO para SN-38 = 20.985 M
-1 cm
-1.
isotérmica de titulación calorimetría (ITC) mediciones
calorimétricas experimentos se realizaron con un instrumento MicroCal VP-ITC (GE Healthcare Bio-Sciences), con la muestra en tampón PBS (pH 7,4) que contiene 5% de DMSO (v /v) en 37 ° C. L-PGDS (840 mM) en la jeringa de inyección fue inverso-tituló en mM SN-38 en la celda 50. experimentos de titulación consistieron en 50 inyecciones separadas a intervalos de 300 seg. El volumen de inyección fue de 2 o 5 l para cada inyección, y la célula se agitó continuamente a 286 rpm. Se utilizó el correspondiente calor de dilución de L-PGDS tituladas en la memoria intermedia para corregir los datos. Los parámetros termodinámicos se evaluaron mediante el uso de un conjunto de-independiente modelo de sitios de unión suministrada por el software MicroCal Origen 7.0.
dispersión de ángulo pequeño de rayos X (SAXS) mediciones
SN-38 /complejos de L-PGDS en tampón PBS se hicieron pasar a través de un filtro para eliminar los compuestos insolubles. La concentración de proteínas de cada muestra se ajustó para adaptarse a los experimentos de SAXS (3,0 mg /ml a 12,0 mg /ml). SAXS datos fueron recolectados en la línea de haz BL40B2 en el resorte-8 (la instalación de radiación de sincrotrón, Hyogo, Japón), y todos los procedimientos experimentales fueron iguales a los descritos anteriormente [23]. Dos-dimensionalmente patrones de dispersión grabadas se convirtieron a los perfiles de una sola dimensión por promediado circular. Las contribuciones a la dispersión de las intensidades de disolvente se eliminaron de los datos en bruto restando la curva de intensidad obtenida para la solución tampón. Con el fin de calcular el radio de giro para cada proteína, el perfil de dispersión se analizó mediante la aproximación de Guinier como se describe en la literatura y en nuestro informe anterior [23]. En cada paso, la interferencia entre partículas y el efecto de la agregación en la muestra fueron cuidadosamente eliminados.
Cultivo de células
línea celular de cáncer de colon humano COLO201 fue adquirido de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos del Banco (Osaka, Japón); y línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231, de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). línea celular de cáncer de próstata humano PC-3 fue proporcionado amablemente por el Prof. R. Yamaji (Universidad de Osaka Prefecture, Osaka, Japón). COLO201 y PC-3 células fueron cultivadas en RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japón) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico (Life Technologies, Carlsbad, CA), mientras que MDA-MB-231 células fueron cultivaron en D-MEM (Wako) que contiene 10% de SFB.
in vitro
ensayo de inhibición del crecimiento
Los efectos de SN-38 /L-complejos PGDS, SN- 38, y CPT-11 en el crecimiento de células tumorales fueron examinados por la realización del ensayo WST-8 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). Colon adenocarcinoma derivado de COLO201, derivada de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231, y se usaron células PC-3 adenocarcinoma derivado de próstata en este ensayo. Estas células se sembraron en placas de 96 pocillos a densidades de 5 x 10
3 células /pocillo de 8 × 10
3 células /pocillo. Después de un cultivo de 24 h, las células se trataron con varias concentraciones de SN-38 complejos /L-PGDS, SN-38 o CPT-11 durante 48 h, y después la solución WST-8 se añadió el medio de cultivo. A partir de entonces, las células se incubaron durante 3 horas a 37 ° C. La absorbancia de formazán producido a partir de WST-8 se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas, Modelo 680 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Animal estudio
Todos los ratones utilizados en este estudio fueron adquiridos de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japón). Los animales fueron alojados en un /12-h horario de luz-oscuridad de 12 horas con comida y agua disponible
ad libitum
durante 1 semana para permitir la recuperación del estrés de transporte. Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Permiso Número: 21-135) Osaka Prefecture. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
En vivo
ensayo de inhibición del crecimiento
Cinco semanas de edad BALB /c desnudos los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en el flanco derecho con 5 × 10
6 COLO201 células. Cuando el volumen del tumor había alcanzado 150 mm
3, estos ratones fueron divididos aleatoriamente en 6 grupos de ensayo. SN-38 /complejos de L-PGDS a una dosis de 1,0, 2,0 o 2,8 mg /kg /d, CPT-11 a una dosis de 4,0 o 20 mg /kg /d, o PBS solo se administró por vía intravenosa cada dos días durante 2 semanas. La longitud (a) y anchura (b) del tumor y el peso corporal se midieron todos los días, y el volumen del tumor se calculó como 1/2 (a × b
2).
Los estudios patológicos en mucosa del intestino delgado
PBS o SN-38 /complejos de L-PGDS a una dosis de 2,8 mg /kg /d se les administró por vía intravenosa a 5 semanas de edad ratones ddY macho al mismo programa de dosis como las que se utilizan en el ensayo de inhibición del crecimiento
in vivo
. En el día 15 después de la primera administración, se sacrificaron los ratones; y luego se aislaron sus intestinos delgados. Las muestras fueron fijadas en formol al 10%, se deshidrataron, y embebidos en parafina, después de lo cual las secciones de espesor de 5 micras, se prepararon y se tiñeron con hematoxilina-eosina.
En tiempo real RT-PCR análisis
ARN total fue extraído de los intestinos delgados mediante el uso de RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se transcribe inversa con los reactivos de un kit de reactivos PrimeScript RT (Takara). El análisis de PCR en tiempo real se llevó a cabo mediante el uso de THUNDERBIRD
® qPCR Mix (Toyobo), y la amplificación se monitorizó con un termociclador dados
® Sistema de Tiempo Real II (Takara). Los cebadores utilizados para este análisis se muestran en la Tabla S1.
prueba de anafilaxia
Seis semanas de edad, los ratones machos ddY se sensibilizaron con cualquiera de ovoalbúmina de pollo (OVA, Sigma, Tokio, Japón) o L -PGDS. OVA (2 mg /ml) o L-PGDS (2 mg /ml) se suspendió en una cantidad equivalente de 13 mg de hidróxido de aluminio /ml (Sigma) como un adyuvante, y la suspensión (100 l) se administró por vía subcutánea en cada ratón . Después de 14 días, ya sea OVA o L-PGDS (1 mg /ml) se administró por vía intravenosa y después la temperatura corporal se monitorizó mediante el uso de un termómetro de infrarrojos Thermofocus sin contacto, Thermofocus (TECNIMED srl, Varese, Italia).
el análisis estadístico
los datos fueron analizados mediante el uso de
t de Student
cuando los grupos mostraron variaciones iguales (prueba F) o con el test de Welch cuando mostraron desigualdad de las diferencias (F) de la prueba. Los resultados se consideraron significativos al nivel de significación del 5% (
P Hotel & lt; 0,05). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
Mejora de la solubilidad del SN-38 por la L-PGDS
Para examinar el efecto de L-PGDS de la solubilidad de SN-38, que mide la concentración de SN-38 en PBS con o sin L-PGDS. SN-38 podría ser disuelto en PBS sólo hasta 1,5 M sin L-PGDS. Sin embargo, cuando se añadió 2 mM L-PGDS a PBS, la solubilidad de SN-38 aumentó hasta 1,700 M, que era 1130 veces en comparación con la de PBS. Además, llevamos a cabo mediciones de ITC y SAXS para investigar el modo de unión detallado de SN-38 a L-PGDS. En las mediciones de ITC, por valoración de L-PGDS a SN-38, que hemos detectado reacciones exotérmicas, lo que indica cambios de entalpía favorables después de la unión (Fig 2A, panel superior). Después de la integración de cada área de pico, el calor integrada obtenida por la unión a SN-38 se representó frente a la relación molar ([L-PGDS] /[SN-38]) (Fig 2A, panel inferior). La isoterma de unión se monta con la de un conjunto de sitios de unión independiente del modelo y los resultados revelaron que la L-PGDS formó un complejo 1: 3 con SN-38 con una constante de disociación (
K
d ) valor de SN-38 para L-PGDS de 60 ± 4,0 mM. Los valores de cambio de entalpía y entropía plazo para la unión SN-38 a L-PGDS eran -17 ± 0,13 y 0,22 ± -8.5 kJ /mol, respectivamente. Estos resultados mostraron que la interacción entre la L-PGDS y SN-38 era-entalpía conducido. A continuación, en las mediciones de SAXS, las curvas de intensidad de dispersión de L-PGDS y SN-38 complejos /L-PGDS revelaron que los complejos de L-PGDS y SN-38 /L-PGDS eran monodisperso sin mostrar ninguna agregación hasta la concentración de proteína de 640 M (Fig 2B). Estas curvas fueron similares, pero obviamente diferente sólo en la región de ángulo pequeño (un vector recíproco (
S
) & lt; 0,02 Å
-1, figura 2b, recuadro). Los valores de radio de giro de L-PGDS y SN-38 /complejo de L-PGDS se calcularon para ser 18,1 ± 0,09 y 16,5 ± 0,20 Å, respectivamente. Estos resultados demostraron que la estructura de L-PGDS se redujo cuando la proteína SN-38 atado.
(A) calorimétrico titulación de SN-38 con L-PGDS. L-PGDS en la jeringa de inyección se tituló en sentido inverso a SN-38 en la célula. El panel superior muestra el cambio en el calor con el tiempo como L-PGDS se tituló en SN-38. El panel inferior muestra el cambio normalizado en calor después de restar los datos de referencia de las inyecciones de L-PGDS en PBS. Se utilizó el conjunto de un modelo independiente de sitios de unión para adaptarse a las isotermas de unión. (B) Los perfiles de SAXS de SN-38 /complejo de L-PGDS (línea azul) L-PGDS (línea roja) y. Estos perfiles se obtuvieron por extrapolación de todos los datos a diferentes concentraciones (12, 9,0, 6,0, y 3,0 mg /ml) a la concentración cero. El logaritmo de la intensidad de dispersión se muestra como una función del vector recíproco (
S
). El recuadro muestra el logaritmo de la intensidad de dispersión en el pequeño
S
región.
in vitro
ensayo de inhibición del crecimiento
Con el fin de investigar el efecto inhibidor de la SN-38 /complejo de L-PGDS sobre el crecimiento celular
in vitro
, se midió la actividad anti-tumor de SN-38 complejos /L-PGDS contra 3 líneas celulares de cáncer humano, COLO201, MDA-MB-231, y PC-3, mediante la realización de WST-8 ensayos. SN-38 complejos /L-PGDS, SN-38, y CPT-11 se disolvieron por separado en PBS y se diluyeron con medio de cultivo a las concentraciones apropiadas. Todas las muestras redujeron la viabilidad de las células de todas las líneas celulares del cáncer de 3 de una manera dependiente de la concentración (Fig 3). El IC calculado
50 valores se resumen en la Tabla 1. El IC
50 valores de SN 38-complejos /L-PGDS sobre el crecimiento de COLO201, MDA-MB-231, y PC-3 células fueron 35 ± 6.5, 900 ± 190 y 10 ± 1,5 nM, respectivamente, lo que indica que el complejo fue más potente contra las células PC-3. Por el contrario, los de CPT-11 en el crecimiento de COLO201, MDA-MB-231, y las células PC-3 fueron 26 ± 4,1, 35 ± 5,2, y 9,8 ± 0,75 mM, respectivamente. Por lo tanto, los efectos inhibidores de estas SN-38 /L-PGDS complejos sobre el crecimiento de las células eran 39- a 980 veces más potente que los de CPT-11. Además, el IC
50 valores de SN-38 para la inhibición del crecimiento de COLO201 y las células PC-3 fueron 15 ± 0,66 y 18 ± 2,4 nM, respectivamente, similares a los de la SN-38 /L-PGDS complejo. Por lo tanto, SN-38 mostró alta actividad citotóxica cuando era posible para ser solubilizado en agua. En el caso de células MDA-MB-231, SN-38 en 1 M, su concentración máxima en PBS, disminución de la viabilidad celular sólo para aproximadamente 80%, y por lo tanto la IC
50 valor de SN-38 no podría ser obtenido (Fig 3B). Estos resultados demostraron que el complejo /L-PGDS SN-38 tenía una potencia del fármaco similar a la de SN-38 solo.
Los datos se expresan como la media ± SE. (
n
= 6).
En vivo
ensayo de inhibición del crecimiento
Se evaluó la actividad antitumoral de la SN-38 complejos de L-PGDS en ratones portadores de tumores COLO201 /. Fig 4A muestra el efecto de administraciones intravenosas de SN-38 /complejos de L-PGDS en el tumor en ratones BALB /c desnudos portadores de tumor en el flanco derecho. El grupo administrado con PBS mostró un aumento progresivo en el volumen del tumor, llegando a 572 ± 62,8 mm
3 en el día 15 después de la primera administración de PBS. En el grupo administrado por el CPT-11 (4,0 mg /kg /d), el volumen del tumor aumentó rápidamente de una manera dependiente del día y llegó a 555 ± 31,3 mm
3 en el día 15 después de la primera administración de CPT-11, que no muestran actividad anti-tumor. Este patrón de aumento día-dependiente fue similar a la de los ratones tratados con PBS utilizado como control. En contraste, aunque el crecimiento tumoral en los ratones tratados con una alta dosis de CPT-11 (20 mg /kg /d) fue casi la misma que la observada en los ratones tratados con PBS por día 6 después de la primera administración, el crecimiento fue después inhibida. El volumen del tumor fue significativamente diferente de la del grupo administrado con PBS después de día 11, y llegó a 231 ± 36,5 mm
3, que es 40,4% de los que en el grupo administrado con PBS en el día 15 después de la primera administración. Por otro lado, aunque el crecimiento tumoral en los ratones tratados con SN 38-complejos /L-PGDS a una dosis de 1,0 mg /kg /d era también casi la misma que la observada en PBS o ratones CPT-11 tratadas por 4 días después de la primera administración, el crecimiento fue inhibido después. El volumen del tumor fue significativamente diferente de la del grupo administrado con PBS después de día 11, y llegó a 301 ± 37,9 mm
3, que es 52,6% de los que en el grupo administrado con PBS en el día 15 después de la primera administración. Además, en los ratones tratados con SN 38-complejos /L-PGDS a una dosis de 2,0 mg /kg /d (que es una dosis equimolar de CPT-11 a una dosis de 4,0 mg /kg /d) o en 2,8 mg /kg /d, se observó regresión del tumor después del día 4. después de día 8, el volumen del tumor de los ratones tratados con SN 38-complejos /L-PGDS a una dosis de 2,0 mg /kg /día o 2,8 mg /kg /d fue significativamente menor que la observada en el grupo administrado con PBS, llegando a 249 ± 19,9 y 212 ± 36,9 mm
3, respectivamente, que era 43,5 y 37,1%, respectivamente, de que en el grupo administrado con PBS en el día 15 después de la primera administración. Por lo tanto, el complejo /L-PGDS SN-38 mostró una actividad significativa y dependiente de la dosis anti-tumor. En el grupo (0,0029 mg /kg /d, y su concentración máxima en PBS) SN-38-administrada, sin embargo, el volumen del tumor aumentó de forma dependiente de día con el crecimiento tumoral similar a la de la PBS o CPT-11 administrado grupo (4,0 mg /kg /d) y llegó a 536 ± 79,6 mm
3 en el día 15 después de la primera administración (datos no mostrados). Estos resultados demostraron que SN-38 /solución de PBS tenía ninguna actividad anti-tumor significativa
in vivo
. Además, con el fin de evaluar los efectos secundarios del complejo /L-PGDS SN-38, se registró el peso corporal de los ratones diariamente durante el tratamiento (figura 4B). En el grupo administrado por PBS, no se observó el cambio de peso corporal. En el grupo (20 mg /kg /día), sin embargo, se observó que la pérdida de peso corporal CPT-11-administrada, y no se recuperó hasta el nivel normal en el Día 15 después de la primera administración. Por otro lado, en el SN-38 grupos administrados por complejos /L-PGDS, la pérdida significativa del peso corporal no se observó dentro de los 15 días después de la administración. Estos resultados, tomados en conjunto, sugieren que la administración intravenosa de SN-38 complejos /L-PGDS a una dosis baja mostró que la actividad anti-tumor mayor que CPT-11.
volúmenes (A) Tumor de PBS, grupos complejos administrados CPT-11-, y SN-38 /L-PGDS. células COLO201 se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones. PBS, CPT-11 a una dosis de 4,0 o 20 mg /kg /d, o SN-38 a una dosis de 1,0, 2,0 o 2,8 mg /kg /PGDS complejos L-/d se administró por vía intravenosa una vez cada dos días para 2 semanas. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con PBS. (B) Cuerpo cambio de peso de los ratones después de cada tratamiento. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con PBS. Las barras de error de grupo del complejo administrado SN-38 /L-PGDS a una dosis de 2,8 mg /kg /d se expresan como la media ± SE de 4 experimentos independientes; y los de los otros, como la media ± SE de 6 experimentos independientes.
Evaluación de la toxicidad intestinal del SN-38 /L-PGDS complejo
Es bien sabido que uno de los principales efectos secundarios clínicos de la CPT-11 es la diarrea grave [24, 25]. Varios informes han demostrado que la administración de CPT-11 induce mucositis intestinal caracterizados por la pérdida de la arquitectura cripta y la producción de citoquinas inflamatorias [26, 27]. Por lo tanto, se determinó por análisis histopatológico y la medición de los niveles de expresión de diversas citoquinas inflamatorias en el intestino delgado si estos efectos secundarios de CPT-11 se manifestaron por el complejo /L-PGDS SN-38 (Fig 5). Los ratones administrados por vía intravenosa SN-38 complejos /L-PGDS a una dosis de 2,8 mg /kg /d usando el mismo programa de dosis tal como se utiliza para el ensayo de inhibición del crecimiento no mostraron ninguna diarrea. Las observaciones histológicas de la mucosa intestinal demostraron la preservación de la arquitectura de las vellosidades y las criptas, que fue similar a la observada en el grupo administrado con PBS (Fig 5A), lo que indica que el complejo /L-PGDS SN-38 no indujo intestinal lesiones. Además, los niveles de expresión de la interleucina-6 (IL-6) y la interleucina-1β (IL-1β) en los intestinos de los ratones administrados SN-38 complejos /L-PGDS se mantuvieron sin cambios en comparación con los de los ratones administrados PBS ( 1.3- y 1.0 veces, respectivamente; figura 5B). Por otro lado, en el intestino de los ratones se administra lipopolisacárido, como control positivo, se observó la regulación de IL-6 y IL-1β (datos no mostrados). Por lo tanto, estos resultados revelaron que la administración del complejo /L-PGDS SN-38 no mostró efectos secundarios tales como mucositis intestinal.
(A) Histología de la mucosa ileal. El recuadro muestra la arquitectura de las vellosidades. La barra de escala representa 100 micras. El panel izquierdo muestra la mucosa ileal de los ratones administrados complejos de SN-38 /L-PGDS; y la derecha, la de los ratones administrados PBS. La mucosa ileal en ambos grupos fue casi la misma. niveles (B) la expresión de citoquinas inflamatorias en la mucosa ileal. Cada barra representa la media ± desviación estándar (
n
= 3).
Evaluación del poder inmunógeno de L-humana PGDS
Por último, se evaluó que sean humanos L-PGDS fue inmunogénica o no para los ratones (Fig 6). La temperatura corporal de los ratones sensibilizados OVA después de la administración intravenosa de OVA cayó rápidamente. Esta disminución de la temperatura corporal no se recuperó durante un máximo de 60 minutos después de la administración. Por otro lado, la temperatura corporal de los ratones sensibilizados-PGDS L humanos después de la administración intravenosa de L-humano PGDS no disminuyó. Estos resultados revelaron que la L-PGDS no causó ninguna respuesta anafilaxis en estos ratones.
Cambio en la temperatura corporal de los ratones. Los ratones fueron sensibilizados con OVA o L-PGDS, y luego desafiados con OVA (○) o L-PGDS (●). Se midió la temperatura del cuerpo para 60 min. Los datos se expresan como la media ± SE de 6 experimentos independientes.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado la viabilidad de la utilización humana L-PGDS como un nuevo vehículo de administración de fármacos para SN-38, un mal medicamento contra el cáncer soluble en agua. Las mediciones de solubilidad revelaron que la concentración de SN-38 mejoró significativamente en la presencia de L-PGDS. Además, los resultados de la
vitro
ensayo de inhibición de crecimiento en reveló que el complejo /L-PGDS SN-38 mostró una actividad anti-tumor potente y que la formulación complejo no afectó a la potencia del fármaco de SN-38 . Además, los resultados de la
in vivo
experimentos revelaron que la administración intravenosa de 38 SN-complejos /L-PGDS dio como resultado una actividad antitumoral pronunciada sin los efectos secundarios típicos de SN-38, tales como intestinal mucositis. Estos resultados demostraron que el complejo de formulación usando humano L-PGDS ahora hace que sea posible el uso de SN-38 para el tratamiento del cáncer.
SN-38 tiene una actividad anti-cáncer eficaz contra varias líneas celulares de cáncer como el colorrectal, de pulmón, de páncreas, de ovario y de células del cáncer [21, 22], pero no ha sido utilizado clínicamente debido a su pobre solubilidad en agua y disolventes farmacéuticamente aceptables tales como etanol. Aunque CPT-11, un profármaco soluble en agua de SN-38, se utiliza alternativamente para el tratamiento de cáncer colorrectal, la tasa de conversión metabólica está por debajo de 10% y depende de la variación genética en términos de actividad carboxilesterasa [28, 29]. Por lo tanto, la administración de una alta dosis de CPT-11 es necesaria para alcanzar el efecto terapéutico esperado (Fig 4A) [30]. Sin embargo, la dosificación múltiple con una gran cantidad de CPT-11 es limitado debido a los efectos secundarios graves. La toxicidad limitante de la dosis de la administración de CPT-11 es bien conocido para dar lugar a las mucositis intestinal caracterizada por diarrea grave [24, 25]. En el presente estudio, hemos demostrado que la administración intravenosa de SN-38 complejos /L-PGDS a una dosis baja mostró una actividad anti-tumor pronunciada en comparación con la de CPT-11 (Fig 4A). Además, el análisis histológico reveló que la mucosa intestinal de los ratones tratados con SN 38-complejos /L-PGDS a una dosis de 2,8 mg /kg /d no mostraron acorta vellosidades o la pérdida de la arquitectura crypt (figura 5A), que es uno de los signos de mucositis intestinal. complejos de SN-38 /L-PGDS Además, los niveles de mRNA de citoquinas inflamatorias tales como IL-6 e IL-1β en los intestinos de ratones administrados fueron similares a los de los ratones inyectados con PBS (Fig 5B). Por lo tanto, hemos demostrado que el uso directo de SN-38 como un complejo con L-PGDS mostró una actividad anti-tumor sin provocar efectos secundarios indeseables, tales como mucositis intestinal.
Hasta ahora, varios enfoques para solubilizar SN- 38 se ha informado, por ejemplo, mediante el uso de profármacos macromoleculares y formulaciones nanomedicina tales como liposomas y micelas poliméricas [18]. Sin embargo, estos métodos implican múltiples y complicadas reacciones; y se requiere el uso de disolventes orgánicos tóxicos. Por ejemplo, EZN-2208, un profármaco macromolecular soluble en agua de SN-38, se produce por pasos complicados incluyendo reacciones durante la noche [31]. Una forma de estrella de micelas de copolímero de bloque de cloro-núcleo, que es un agente fotosensibilizante de tamaño nanométrico capaz de encapsular SN-38, se preparó usando un método de liofilización-hidratación [32]. Sin embargo, este proceso de liofilización consume mucho tiempo; y, además, este proceso requiere el uso de disolvente orgánico tal como sulfóxido de dimetilo. Así, la toxicidad de los disolventes orgánicos residuales debe ser motivo de preocupación. En nuestro caso, sin embargo, la formulación de complejos de SN-38 /L-PGDS podría lograrse mediante una reacción simple, es decir, solamente la mezcla de una suspensión SN-38 con una solución de L-PGDS sin ningún disolvente orgánico. Además, también hemos demostrado que la formulación oral sólida de fármaco pobremente /complejo de L-PGDS soluble en agua puede lograrse simplemente mediante el uso de una técnica de secado por pulverización [33]. Por lo tanto, la formulación de fármaco usando L-PGDS tiene una gran ventaja en términos de tiempo de preparación y seguridad.