UV
Extracto
El hongo marino
Microascus brevicaulis
LF580 cepa es un no-modelo secundaria productor metabolito con altos rendimientos de los dos metabolitos secundarios scopularides A y B, que exhiben actividades distintas contra las líneas celulares tumorales. Se obtuvo una cepa mutante mediante mutagénesis UV, que muestra el crecimiento y las diferencias en la formación de gránulos, además de mayores niveles de producción más rápido. Aquí, se muestra el primer estudio del proteoma de un hongo marino. proteómica comparativa se aplicaron a obtener un mayor conocimiento de la regulación de la producción y de la fisiología de la cepa de tipo salvaje y su mutante. Para este fin, se estableció un protocolo de extracción de proteínas optimizada. En total, se identificaron 4759 proteínas. La vía metabólica central de LF580 cepa fue asignada mediante el análisis de la vía KEGG y GO anotación. El empleo de etiquetado iTRAQ, se mostró que 318 proteínas para ser regulada de manera significativa en la cepa mutante: 189 eran abajo y 129 upregulated. La proteómica es una herramienta poderosa para la comprensión de los aspectos normativos: Las diferencias en el nivel proteoma podría atribuirse a la disponibilidad de nutrientes limitados en la cepa de tipo salvaje debido a la formación de pellets fuerte. Esta información puede ser aplicada para la optimización de la cepa y el nivel de proceso. La vinculación entre la limitación de nutrientes y la formación de gránulos en el modelo de no-hongo
M
.
brevicaulis
es en consenso con el conocimiento de los organismos modelo como
Aspergillus niger
y
Penicillium chrysogenum
Visto:. Un Kramer, Beck HC, Kumar a, Kristensen LP, Imhoff JF, Labes a (2015) Análisis proteómico de anti-canceroso Scopularide Producción por un marine
Microascus brevicaulis
cepa y su mutante UV. PLoS ONE 10 (10): e0140047. doi: 10.1371 /journal.pone.0140047
Editor: Marie-Joelle Virolle, Universidad de París Sur, Francia |
Recibido: 16 Marzo, 2015; Aceptado: September 21, 2015; Publicado: 13 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Kramer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles en los archivos de información de apoyo oa través de la base de datos de Pangea. (doi: http://dx.doi.org/10.1594/PANGAEA.853591)
Financiación: Este estudio fue apoyado financieramente por la Unión Europea a través de el proyecto 7 de KBBE Marco (http://cordis.europa.eu/fp7/kbbe/about-kbbe_en.html) MARINO HONGOS (proyecto. no 265926). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los nuevos metabolitos secundarios producidos por hongos tienen un gran potencial en aplicaciones para el uso humano [1, 2]. Los dos ciclodepsipéptidos scopularides A y B se producen por un ascomicetos, aislado del tejido interno de la esponja marina
Tethya aurantium
[3]. La cepa fúngica fue descrito originalmente como
Scopulariopsis brevicaulis
LF580. Estudios recientes revelaron
S
.
brevicaulis
para ser el teleomorfa de
Microascus brevicaulis
[4-6]. De acuerdo con las reglas de nomenclatura para los hongos (6), el nombre de
Microascus brevicaulis
cepa LF580 se utiliza dentro de este manuscrito.
Ambos scopularides demostraron una actividad específica contra el tumor de páncreas líneas celulares Colo357 y Panc89 así como la línea celular de tumor de colon HT29 [3]. Ambos scopularides consisten en cinco aminoácidos cicla a través de una cadena lateral (scopularide A: (
cyclo
- (3-hidroxi-4-methyldecanoyl- Gly-L-Val-D-Leu-L-Ala-L- Phe); scopularide B:
cyclo
- (3-hidroxi-4-methylloctanoyl- Gly-L-Val-D-Leu-L-Ala-L-Phe)) En el análisis del genoma de
M
.
brevicaulis
LF580, se identificaron 17 genes NRPS [7]. El grupo de genes responsable de scopularide a incluye una sintetasa no ribosómica de péptidos (NRPS1), un policétido sintasa (PKS2), una CoA ligasa, una aciltransferasa y un factor de transcripción [7, 8]. Debido a la analogía estructural, se supone una síntesis de ambos scopularides por el mismo complejo enzimático.
el LF580 tipo de cepa silvestre representa un no-modelo productor de metabolitos secundarios, que exhibe altos rendimientos de los metabolitos de destino (aproximadamente 200 mg L
-1 para scopularide a [9]). el uso de un enfoque de detección optimizada [10], una cepa mutante UV (
M
.
brevicaulis
se detectó LF580-M26) cepa, que mostró un aumento del nivel de producción de los dos scopularides en condiciones estándar, el crecimiento y los cambios en la formación de gránulos más rápido y diferente. Por lo tanto, esta cepa mutante LF580-M26 fue elegido para una comparación detallada con la cepa de tipo salvaje en el nivel proteoma.
comparativo de perfiles proteoma ayuda a comprender los cambios metabólicos como la mediación de las actividades metabólicas celulares se produce, en principio, en el nivel de proteína [ ,,,0],11, 12]. proteómica cuantitativa pueden vincular los cambios fisiológicos, características de crecimiento y una mayor producción de metabolitos secundarios con cambios moleculares en el plano proteoma. Una comparación cuantitativa proporciona nuevos datos sobre las vías de regulación implicados y contribuye a la tensión precisa y desarrollo de procesos [13-16]. A pesar de su prevalencia en la industria biotecnológica y su importancia como patógenos, hongos filamentosos recibieron menos atención durante el inicio y la ejecución de los métodos biológicos innovadores y en la biología de sistemas en el pasado [17]. Al igual que en la era genómica, hongos filamentosos están rezagados en la era proteómica: En 2008, sólo unos pocos estudios proteoma hongos estaban disponibles, que describe principalmente las especies modelo clásico de los dos géneros
Aspergillus
y
Penicillium
[15]. Hoy en día, 250 proteomas fúngicas están disponibles, lo que representa menos del 5% si se compara con los proteomas de bacterias disponibles (http://www.uniprot.org, agosto de 2015). células enteras Molecular analiza revelar penetraciones completas especialmente en organismos no modelo, que proporcionan información de la reacción del organismo a los cambios ambientales. Algunos estudios ya dieron una idea de la enorme potencial de la proteómica:.
E
g
. el análisis del proteoma de etapas de desarrollo en
militaris Cordyceps
llevaron a puntos de partida concretos para el desarrollo de la cepa [18], estudios de proteoma de
Un
.
fumigatus
arrojar nueva luz sobre los mecanismos de patogenicidad [19], y el análisis comparativo del proteoma de un
Un
.
nidulans
cepa y su cepa mutante revelaron los múltiples efectos de las supresiones de genes [20, 21].
Proteoma técnicas están evolucionando rápidamente, pero muchos protocolos fueron desarrollados por sólo un pequeño número de organismos. Casi todos los nuevos estudios necesitan una adaptación de la metodología de extracción de proteínas. En general, los hongos se sabe que tienen paredes celulares rígidas y complejas, por lo que se requiere un enfoque especial en la interrupción de la pared celular durante la preparación de la muestra [17, 22, 23].
El objetivo de este estudio fue el basado caracterización proteoma de las diferencias entre el mutante UV LF580-M26 y su cepa de tipo salvaje (WT) con el fin de identificar los mecanismos moleculares subyacentes para el aumento de la producción scopularide por la cepa mutante UV. Este estudio es el primer análisis del proteoma de un hongo filamentoso marino.
Resultados
Identificación de los puntos de muestreo iguales mediante la determinación de las características de crecimiento y de producción scopularide
Al igual que todos los cambios celulares actividades metabólicas resultan en cambios en el nivel de proteína, un análisis del proteoma comparativo de cepas con diferente comportamiento de crecimiento y fisiología sólo puede obtenerse mediante la sincronización de la característica metabólica de las dos cepas. Una comparación de su comportamiento de crecimiento se utilizó para seleccionar el punto de cosecha, donde se supone que las dos cepas a estar en la misma etapa de crecimiento y producción. Curvas de crecimiento de las dos cepas se obtuvieron por triplicado y mostraron diferencias en el comportamiento de crecimiento de la cepa WT LF580 y la cepa mutante LF580-M26 (Fig 1A). eran evidentes diferencias de velocidad, el pH, la biomasa y la producción scopularides (figura 1B) en las diferentes fases de crecimiento
(A) Las series temporales de la biomasa (LF580: - ◆ - (gris claro); LF580-M26.: - ▲ - (gris oscuro)) y el valor de pH (LF580: - ■ - (gris claro); LF580-M26: - ● - (gris oscuro)) para el LF580 tipo de cepa silvestre y su cepa mutante LF580- se muestran M26. Las determinaciones se realizaron por triplicado durante 6 días. (B) Los niveles de producción de scopularide A (LF580: - ◆ - (gris claro); LF580-M26: - ▲ - (gris oscuro)) y B (LF580: - ■ - (gris claro); LF580-M26: - ● - (gris oscuro)) durante la serie de tiempo se comparan sobre la base del área del pico de la señal respectiva masa después de análisis por HPLC-MS. Las curvas representan la línea de tendencia.
La fase de rápido crecimiento de la cepa mutante LF580-M26 comenzó 20 horas después de la inoculación. Por el contrario, la fase de retardo de la cepa WT terminó aproximadamente ocho horas más tarde. Tomando la producción de biomasa y pH como marcadores para el crecimiento de hongos, las curvas diferían en la duración de la fase de crecimiento rápido, siendo de aproximadamente 24 h para el mutante y 42 h para el WT. Estas diferencias llevaron a tasas de crecimiento de 0,0715 g de biomasa L
-1 h
-1 y 0,0426 g de biomasa L
-1 h
-1 (basado en la biomasa: μX = dX (dt)
-1) para la cepa mutante LF580-M26 y la cepa WT, respectivamente. La producción de biomasa de ambas cepas durante esa fase mostró valores muy similares de 1,71 g de biomasa L
-1 (cepa mutante LF580-M26) y 1,79 g de biomasa L
-1 (cepa WT). El rendimiento final de las dos cepas estaba en la misma gama (LF580: 3,4 g de biomasa L
-1, LF580-M26: 4,3 g de biomasa L
-1). Similar a la curva de la biomasa, la progresión de la curva de pH de la cepa mutante LF580-M26 era bastante exponencial en relación con la progresión lineal de la curva de pH de la cepa WT. Comparando el punto de tiempo en ambas cepas alcanzaron el nivel más bajo pH (que indica el final de un crecimiento rápido), una diferencia de se observó aproximadamente 24 h entre ambas cepas. El valor de pH para la cepa WT mantuvo a ese nivel hasta el final del experimento (120 h). En contraste, el valor pH de la cepa mutante LF580-M26 comenzó a aumentar inmediatamente después de alcanzar el nivel de pH más bajo con la misma progresión que había estado cayendo previamente. El valor de pH alcanzó un máximo de 7,5 al final del experimento.
Ambas cepas mostraron que la producción continua de los scopularides con tasas similares durante la fase de crecimiento rápido. Se observó un cambio drástico que conduce a claras diferencias entre los WT y la cepa mutante durante la transición de la tarde rápida a la fase estacionaria temprana (Fig 1B): La cepa mutante LF580-M26 pasa a través de esta transición dentro de 7 h, mientras que el WT cepa necesita aproximadamente 32 h. La tasa de producción scopularide fue 50 veces mayor en la cepa mutante durante la fase de transición. En la fase de crecimiento estacionario, el factor disminuyó a aproximadamente 10. En esta fase (
i
.
e
. 52 h y 72 h de cultivo para LF580-M26 y LF580, respectivamente) la producción de ambos scopularides estancó en la cepa WT, mientras que la producción en la cepa mutante aumentó aún más, hasta que aproximadamente 100 h de cultivo, seguido por una disminución de la concentración de ambos scopularides. La formación pellet compacto característica de la cepa WT no se observó para la cepa mutante LF580-M26. la formación de gránulos de la cepa WT iniciarse en el día dos después de la inoculación; en el día tres, aproximadamente 90% de los pellets alcanzó un tamaño de 2-3 mm de diámetro; el día cuatro la formación de pellets terminó con un diámetro de 3-4 mm. No hay un aumento significativo del número de pellets se puede observar después de cuatro días. Por el contrario, LF580-M26 mostró una turbidez creciente de la cultura, con un crecimiento filamentoso convirtiéndose en el desarrollo de gránulos peludas (aproximadamente 1 mm de diámetro). La viscosidad de los cultivos aumentó hasta el día cinco de cultivo
Teniendo en cuenta las diferencias observadas, pH, la biomasa y la producción scopularides fueron utilizados como marcadores para determinar los puntos de muestreo equivalentes:. De acuerdo con ello, las células se recogieron después de 68 h (cepa WT LF580) y 44 h (cepa mutante LF580-M26). En estos momentos, las cepas se asume que están en un estado de crecimiento comparables, como el pH (LF580: 4,62 ± 0,13; LF580-M26: 4,95 ± 0,17) y la biomasa (LF580: 2,5 ± 0,2 mg ml
-1; LF580-M26: 2,6 ± 0,1 mg ml
-1) los valores estaban en el mismo rango
extracción de proteínas cuantitativa como requisito previo para Estudios del Proteoma
en el caso de la no marino. -modelo hongo
M
.
brevicaulis
cepa LF580 de este estudio, los enfoques metodológicos adicionales y la validación de los protocolos eran esenciales para obtener datos proteoma de alta calidad. Un procedimiento de extracción estándar simple basado en la disrupción celular mediante sonicación no dio lugar a una calidad similar (patrón) y la cantidad (intensidad) de las proteínas para el WT y la cepa mutante, lo que indica la extracción incompleta. Por lo tanto, un protocolo de extracción de proteínas adaptado fue desarrollado y validado. El foco se establece en la ruptura celular y la disolución de las proteínas (Fig 2). Se compararon dos procedimientos de disrupción celular: molienda en nitrógeno líquido y la aplicación de los granos. Además, el foco se encuentra en la disolución de la fracción de proteína insoluble, que sedimentó durante la separación inicial.
Dos diferentes métodos de disrupción celular se compararon con respecto al número de grupos de proteínas identificados utilizando nano-LC-MS /SRA. Un enfoque adicional se encuentra en la solubilización de la fracción de proteína difícilmente soluble (H) al lado de la fracción de proteína soluble (S).
La aplicación de este protocolo adaptado, un grado comparable para la extracción y el WT cepa mutante era demuestra por SDS-PAGE antes de digestión de la proteína extracto final (resultados no mostrados). Con el fin de comparar los grados de extracción de las diferentes preparaciones de muestra (Fig 2), los datos se analizaron proteoma muestra por muestra utilizando nano-LC-MS /MS. Estudios anteriores mostraron que el genoma completo de
M
.
brevicaulis
tiene un tamaño de aproximadamente 32 Mb, que contiene 16.298 genes. 1,33% del genoma representado repeticiones [7, 24]. Aquí, se identificaron 4759 proteínas (FDR & lt; 0,01 y 1 ≥ péptidos por proteína) utilizando los procedimientos de extracción desarrollados en ambas cepas. Esto refleja cobertura de aproximadamente el 30% del número de proteínas teórico. Las proteínas obtenidas por extracción de nitrógeno líquido cubrieron el 92,2% de estas proteínas 4759. En comparación con la cobertura de 88,1% usando extracción basado en perlas, extracción de nitrógeno líquido, por tanto, condujo a un aumento de 4,1% de las proteínas cubiertas. Una de aproximadamente tres veces mayor aumento (11,4%) se logró mediante la solubilización de las proteínas "difícilmente solubles" (92,2%), en lugar de centrarse únicamente en la fracción proteica "fácilmente soluble" (80,8%). Este aumento fue independiente del método de la confusión célula original.
La comparación de los proteomas de tipo salvaje LF580 cepa y su cepa mutante UV LF580-M26
Análisis de las vías y funciones de la proteína.
Una combinación de todas las fracciones de las células tratadas de nitrógeno líquido se utiliza para la comparación cuantitativa usando etiquetado iTRAQ. 3526 mutuos proteínas se identificaron con confianza y se cuantifiquen en el WT y la cepa mutante LF580-M26 (FDR & lt; 0,01 y 2 ≥ péptidos por proteína). 318 proteínas fueron regulados diferencialmente: se upregulated 129 proteínas y 189 se downregulated en la cepa mutante en comparación con la cepa WT. Para la identificación de los procesos moleculares y actividades celulares, el conjunto de proteínas reguladas diferencialmente se sometió a análisis GO [25] (Figura 3). Las funcionalidades de la enzima se revelaron utilizando KEGG [26], que predicen efectos de la mutación en los niveles celulares y metabólicos (figura 4).
3526 proteínas se cuantificaron utilizando el etiquetado iTRAQ. 318 (9%) mostró una regulación significativa en la cepa mutante. 129 (3,7%) se upregulated y 189 (5,3%) se downregulated. El gráfico de barras muestra el porcentaje de proteínas hacia arriba y downregulated ordenan en las diferentes categorías sobre la base de GO anotación.
gráficos gris oscuro representan las proteínas downregulated en la cepa mutante, de color gris claro, en contraste , los upregulated queridos. Los números reflejan las secuencias de las enzimas clasificadas en las diferentes categorías.
La evaluación de los datos IR se realizó mediante el uso de un conjunto de categorías extendidas,
i
.
e
. subniveles de las categorías GO [27]. No se encontraron diferencias principales en las categorías de catabolismo, la formación de gránulos y la replicación. Las dos últimas categorías mostraron una regulación por incremento distinto en el mutante con factores de 3,2 (la formación de gránulos) y 3,5 (replicación), respectivamente. Sin embargo, la formación de gránulos representa una categoría con un pequeño conjunto de datos de proteínas (1,6% y 0,5% arriba downregulated). Una regulación a la baja clara fue visto por grupos de proteínas relacionadas con el catabolismo de las categorías, el almacenamiento, la respuesta al estrés y la muerte. El 18,6% de las proteínas relacionadas con la categoría catabolismo se upregulated y downregulated 33,3%. En la categoría de anabolismo, aproximadamente el mismo número de proteínas fue arriba o downregulated: 10,1% y 9,5%, respectivamente. Las pequeñas diferencias se podían ver por la pared celular categorías (relación de 1,5) y el transporte (relación de 1,3). Dentro del almacenamiento categorías (0,5%), respuesta al estrés (4,2%) y la muerte (2,1%) se encontraron proteínas sólo se downregulated. El número de proteínas desconocidas fue casi la misma para el conjunto de datos hacia arriba y regulados a la baja (17,8% y 16,9%, respectivamente). 12,4% (0,8% upregulated, 11,6% downregulated) de las proteínas reguladas no podría ser asignado a una de las categorías.
KEGG vía de análisis de calificación permitido de todas las enzimas necesarias del metabolismo central (ver siguientes secciones). En general, los niveles de expresión de la mayoría de las enzimas se downregulated en la cepa mutante (Fig 4). Dentro de la categoría "biosíntesis de metabolitos secundarios" un número igual de enzimas era arriba y downregulated. En el metabolismo de los lípidos categorías, el metabolismo de los cofactores y vitaminas, el metabolismo de los terpenoides /policétidos y traducción, un mayor número de enzimas reveló altos niveles de expresión en la cepa mutante.
KEGG y GO se utilizaron los datos para una comparación detallada de la cepa WT y la cepa mutante LF580-M26.
el catabolismo.
la categoría GO del catabolismo mostró un mayor número de proteínas que se downregulated en la cepa mutante (figura 3). Sin embargo, regulación a la baja no refleja una ralentización general del catabolismo. Por ejemplo, i9 inhibidor de peptidasa (g7795), un inhibidor de los procesos catabólicos, mostró una regulación a la baja en la cepa mutante, lo que indica una mejora de los procesos catabólicos. La evaluación de los datos KEGG confirmó esta hipótesis, ya que una regulación a la baja se observa principalmente en el nivel de enzimas para vías e isoenzimas adicionales en la cepa mutante, probablemente conduce a mayores flujos en las vías centrales.
Todas las enzimas de una clásica Embden-Meyerhof vía (glucólisis) estuvieron presentes y activos, lo que permite el crecimiento en glucosa como se esperaba para un eucariota típica. Además, todas las enzimas necesarias para la degradación inicial de otros mono y disacáridos podrían ser calificados. El medio de crecimiento contenía glucosa como fuente de carbohidratos, pero peptona de soja y extracto de levadura eran fuentes de azúcares monoméricos adicionales (de acuerdo con los certificados de los análisis de los proveedores). La expresión de todas las enzimas glucolíticas fue la misma en la cepa WT y la cepa mutante LF580-M26.
La ruta de la pentosa fosfato (PPP) podría ser calificado. La mayoría de las enzimas fueron regulados a la baja en la cepa mutante, como la fructosa-bifosfatasa (CE 3.1.3.11). La cepa WT utiliza tanto la fructosa-bifosfatasa (CE 3.1.3.11) y la 6-fosfofructoquinasa (CE 2.7.1.11). Con respecto a la parte oxidativo, la vía de d-gluconato-6-fosfato a D-ribosa-1-fosfato se downregulated en la cepa mutante. El WT puede beneficiarse de una PPP en ejecución, ya que genera NADPH adicional, que es necesaria para la absorción de amonio, así como para la biosíntesis de proteínas. En general, una mayor demanda de NADPH aumenta el flujo a través de PPP [28]. El mayor nivel de expresión de la proteína en el PPP en el WT indica un aumento en el flujo [29]
.
Como se espera de un organismo eucariota, piruvato generado en la glucólisis se canalizará a través del complejo de la piruvato deshidrogenasa clásica en el tricarbonic ciclo del ácido (TCA). El TCA completo era operativa en la dirección catabólico en ambas cepas. Sin embargo, la cepa mutante LF580-M26 mostró regulación a la baja de algunas enzimas: El paso inicial de la condensación de oxalacetato y acetil-CoA a citrato está catalizada por un citrato sintasa (EC 2.3.3.8) en la cepa mutante.
M
.
brevicaulis
cepa LF580-M26 utiliza la isoforma deshidrogenasa una isocitrato paso (CE 1.1.1.41) la generación de NADH. El WT expresó Además, la isocitrato deshidrogenasa de dos pasos (CE 1.1.1.42) la generación de NADPH. Utilizando esta enzima, el WT podría elevar el nivel de NADPH,
e
.
g
. por aumento de la captación de amonio o de niveles más altos de la traducción. Se observó el mismo fenómeno para la succinato deshidrogenasa, que está presente en la cepa WT como EC 1.3.99.1 y EC 1.3.5.1. Esta última isoforma está unida a la membrana y parte de la cadena de transporte de electrones respiratoria. Se encontró en el mismo nivel de traducción en ambas cepas. La conversión de ácidos carbónicos activados-CoA (acetato, butirato, acetoacetato) se downregulated en el nivel de acetato de CoA-transferasa (EC 2.8.3.8), que conduce a un alto nivel de sustratos activado en el TCA y el posterior flujo en la cepa mutante .
CoA-transferasa (EC 2.8.3.8) y de enzimas relacionadas con la β-oxidación se downregulated en la cepa mutante que indica los niveles más bajos de β-oxidación. Regulación a la baja de las enzimas de conversión de propionil-CoA reductasa, tales como 2-methylcitrate sintasa (EC 2.3.3.5) y la posterior deshidratasa (EC 4.2.1.79), coincidió con menores niveles de β-oxidación, como se forma propionil-CoA a través de la degradación de ácidos grasos impares. En contraste, el WT mostró niveles más altos de estas enzimas, lo que podría explicarse por la degradación de compuestos de almacenamiento (
i
.
e
. Ácidos grasos) inducida por una limitación de carbono dentro de los gránulos formados .
las enzimas de la cadena respiratoria (fosforilación oxidativa) fueron calificados y no mostró diferencias en el nivel de expresión de proteínas entre cepa mutante y WT.
el aminoácido degradación y metabolismo de nitrógeno estaban calificados, lo que indica que la deshidrogenasa NADP-glutamato (EC 1.4.1.4) se utilizó por ambas cepas de asimilar amonio libre del medio. En la cepa mutante, la absorción de amonio adicional a través del ciclo de la glutamina sintetasa glutamina-oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT) se downregulated a nivel de la conversión de glutamato en glutamina por la glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2).
El NAD glutamato deshidrogenasa específico de (CE 1.4.1.2, la conversión de glutamato a cetoglutarato y amonio o al revés) se downregulated en la cepa mutante. Tal regulación a la baja se muestra para las células fúngicas no limitado en su nitrógeno o de carbono las fuentes [30, 31]. Viceversa, la glutamato deshidrogenasa NAD específica sería activado, si una cepa está limitado en una de estas fuentes. Dado que la producción de nitrógeno scopularide es dependiente [9], los datos sugieren proteoma una limitación de nitrógeno de la WT en el medio utilizado. Por el contrario, todas las vías para el aumento adicional de nitrógeno se downregulated en la cepa mutante, que no parece ser de nitrógeno limitado.
En general, la degradación de aminoácidos está activo, lo que permite a las cepas cultivadas en medio que contiene peptona . La conversión de los aminoácidos a acetil-CoA para la respiración posterior se ha mejorado a nivel de los respectivos acetil-CoA C-aciltransferasas (EC 2.3.1.16). Sin embargo, se downregulated degradación de los aminoácidos necesarios para la producción de scopularides (véase más adelante).
anabolismo.
La evaluación de los datos GO reveló un número similar de proteínas agrupadas en la categoría de anabolismo sea arriba y downregulated. El KEGG vía de análisis permite una vista más detallada
Las enzimas de la vía de Embden-Meyerhof clásica (EM) en eucariotas suelen servir en dos direcciones:. De la glucólisis y la gluconeogénesis. Por lo tanto, la presencia de una vía de trabajo EM indica la gluconeogénesis operativo a través de la misma vía. Como algunas reacciones de la ruta EM son irreversibles, reacciones adicionales son necesarios para la gluconeogénesis: El eucariota glucogenetic enzimas clave en fructosa 1,6 bisfosfatasa (EC 3.1.3.11) y carboxiquinasa fosfoenolpiruvato (CE 4.1.1.49) fueron calificados y demostrado ser regulados a la baja en la cepa mutante. La tercera enzima, una fosfatasa de la glucosa-6 (EC 3.1.3.9), no podía ser calificado en ambas cepas. Esto indicó una conversión directa de gluconeogenética glucosa-6-fosfato en glucosa-1-fosfato para la formación de la envoltura celular y otros azúcares poliméricos con fines de almacenamiento. Como fue el caso de otras enzimas gluconeogenética, se demostró la mutasa fosfato de glucosa respectiva (CE 5.4.2.2) para ser regulado por disminución en la cepa mutante.
almacenamiento interno de azúcar (
e
.
g
. formación de glucógeno) no estaba activo en la cepa mutante. Todo glucosa disponible introducir directamente la ruta glicolítica como se indica por la regulación a la baja de todas las enzimas necesarias para la degradación de azúcar polimérico. La regulación a la baja de glucosa fosfato mutasa (CE 5.4.2.2) apoya esta hipótesis, ya que su actividad es un requisito previo para la transformación de los azúcares en polisacáridos de almacenamiento.
Los cetoácidos del TCA sirven como moléculas iniciadoras para la biosíntesis de aminoácidos y otras moléculas. La eliminación de estos cetoácidos de la TCA por reacción anabólica disminuye el flujo de las reacciones catabólicas y por lo tanto del rendimiento energético. En consecuencia, muchas de las reacciones anabólicas a partir de TCA se downregulated en la cepa mutante, tal como succinato deshidrogenasa (EC 1.2.1.16), 4-aminobutanoato-transaminasa (CE 2.6.1.19) y malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.38).
los amino vías de biosíntesis de ácidos fueron calificados, pero no se observaron diferencias entre las cepas. Los proteoma datos revelaron que LF580 utiliza la vía de alfa-aminoadipato para la biosíntesis de la lisina.
Transporte.
Un número equivalente de proteínas vinculadas a los procesos de transporte fue arriba y regulados a la baja. proteínas Upregulated estaban involucrados en el transporte de aminoácidos, así como del oxígeno en las células. En particular, una proteína (permeasa de fosfato reprimible fosfato, g10374) responsable de la absorción regulada de fósforo se downregulated; en lugar de un transporte de fósforo no regulada está presente. La regulación de la ingesta de nitrógeno (
i
.
e
. Nitrato) se downregulated (nitrato de asimilación reguladora Nira proteínas, g12583) y es conforme a la regulación a la baja de todas las vías para el aumento adicional de nitrógeno en la cepa mutante.
las proteínas implicadas en el transporte intracelular se downregulated en la cepa mutante, por ejemplo proteínas que pertenecen al aparato de Golgi, el peroxisoma y vesícula de transporte.
replicación, la morfología, célula integridad y mantenimiento.
diferencias de crecimiento se reflejan claramente en la replicación de las categorías y la formación de gránulos. En comparación con la cepa WT tres veces más proteínas que pertenecen a estas dos categorías se upregulated en la cepa mutante (Fig 3). Algunas proteínas se downregulated, como la proteína extracelular rico en serina (g7517), que estaba afiliado a última fase de desarrollo [32]. Sin embargo, no se observaron cambios en las proteínas implicadas en la morfogénesis de pellets.
La cepa mutante mostró algunas proteínas upregulated involucrados en funciones de mantenimiento,
e
.
g
. conversión de glicina a aminolevulinato (5-sintasa aminolevulinato, EC 2.3.1.37) para la síntesis de porfirinas posterior. La regulación positiva de esta enzima podría estar relacionado con una mayor mantenimiento de la cadena respiratoria. Los niveles más altos de la respiración en la cepa mutante implican niveles más altos de protección contra el estrés oxidativo. Por ejemplo, la proteína nuclear qri2 nse4 (g3175), que actúa en la reparación del ADN, se reguló en la cepa mutante [33].
Sin embargo, los genes implicados en la respuesta al estrés mostraron mayores niveles de expresión en el WT. Teniendo en cuenta la situación de limitación para el WT debido a la formación de pellets (
i
.
e
. Estrés de nutrientes, pH bajo al final de la fase de crecimiento), se esperaría que tales respuestas de estrés [34 , 35]. Un ejemplo es un mayor nivel de catalasa peroxisomal (g8585), que está regulado por disminución en la cepa mutante. Otras proteínas de respuesta de reparación y el estrés fueron regulados a la baja:
e
g
.. Tam metiltransferasa dominio (g15885) preservar la integridad de polipéptidos que enfrentan las reacciones no enzimáticas dependientes de la edad [36]; esfingomielina fosfodiesterasa (g8757) [37] y las proteínas de supervivencia como Sure-fosfatasa /nucleotidasa (g13733). Estos últimos pueden estar involucrados en la respuesta al estrés, como las células con mutaciones en el gen Seguro mal sobreviven en la fase estacionaria [38].
Metabolismo secundario.
En total, 39 eran complejos de enzimas de biosíntesis identificado en el genoma de
M
.
brevicaulis
. 17 estaban afiliados a NRPS, 18 de PKS, dos de ligasa de ácidos grasos y uno representaba una PKS /NRPS híbrido [7, 24]. Fuera de estos genes, 9 y 7 NRPS proteínas PKS fueron tipificados en el conjunto de datos GO. iTRAQ cuantificación mostró una mayor expresión de NRPS13 y PKS15 y una menor expresión de PKS 9, 14 y 18 en el mutante. Sin embargo, la función de estas enzimas está claro que los perfiles de metabolitos secundarios de WT y mutante son muy similares
Específicamente, la regulación de las respectivas vías de biosíntesis para los cinco aminoácidos que forman scopularides A y B se compararon.: las vías para la L-valina, L-fenilalanina, L-alanina, D-leucina y la síntesis de glicina estaban calificados, lo que indica que
M
.
brevicaulis
sintetizó todas las moléculas precursoras de las scopularides. Esto es apoyado por los estudios de crecimiento anteriores que mostraron que los aminoácidos de las fuentes de nutrientes no sirven como precursores directos para la producción scopularide [9]. La degradación de los aminoácidos necesarios para la producción de scopularide se downregulated significativamente en la cepa mutante: la degradación alanina se downregulated a nivel de alanina transaminasa-glioxilato (CE 2.6.1.44) y transaminasa 4-aminobutirato-2-oxoglutarato (CE 2.6.1.19) . degradación de valina fue bloqueada a nivel de metilmalonato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.27). [17].