Extracto
epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM), una célula madre del cáncer (CSC) marcador se sobreexpresa en los cánceres epiteliales y en el retinoblastoma (RB ). Se han fabricado un EpCAM focalización quimera aptámero-siRNA y se investigaron sus propiedades anti-tumor y EpCAM dominio intracelular (EpICD) de señalización mediada en el cáncer epitelial. La eficacia antitumoral de EpCAM aptámero-siEpCAM quimera (EpApt-SIEP) se evaluó mediante qPCR, transferencia Northern y Western en la línea celular WERI-Rb1- RB, RB células tumorales primarias y en la línea celular de cáncer de mama MCF7-. Se estudió la actividad antitumoral de EpApt-SIEP
in vivo usando
cáncer (MCF7) modelo de xenoinjerto en ratones epitelial. El mecanismo y las vías involucradas en la actividad anti-tumoral se estudió adicionalmente usando arrays de proteínas y qPCR. EpApt-SIEP quimera se procesa
in vitro fotos: por la enzima Dicer. El tratamiento de las células WERI-Rb1 y MCF7 con EpApt-SIEP reveló regulación estadísticamente significativa hacia abajo de la expresión de EpCAM (P & lt; 0,005) y la reducción concomitante en la proliferación celular. En las células RB primarias cultivadas a partir de tumores Rb, EpApt-SIEP silenciada EpCAM, inhibió significativamente (P & lt; 0,01) la proliferación celular y la citotoxicidad inducida. Desmontables de EpICD expresa en tumores primarios RB dado lugar a la represión de los marcadores de pluripotencia, Sox2, Oct4, Nanog, y CD133.
in vivo
estudios mostraron regresión del crecimiento tumoral completa sin ningún tipo de toxicidad en animales (P & lt; 0,001) y los tejidos tumorales mostraron regulación a la baja significativa (P & lt; 0,05) de EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmina, survivina y la regulación positiva de la ATM ( P & lt; 0,05) que conduce a la apoptosis por vía intrínseca con la alteración de menor importancia en las citoquinas. Nuestros resultados revelaron que EpApt-SIEP potencialmente erradicada EpCAM positivas las células del cáncer a través de la supresión marcador de CSC y la apoptosis, sin afectar a las células adyacentes negativos EpCAM normales
Visto:. Subramanian N, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, J Biswas , Khetan V, et al. (2015) Objetivos EpCAM aptámero-siRNA quimera y la regresión de cáncer epitelial. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10.1371 /journal.pone.0132407
Editor: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia
Recibido: 8 de Octubre, 2014; Aceptado: June 14, 2015; Publicado: July 15, 2015
Derechos de Autor © 2015 Subramanian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles en el papel. Además, las imágenes primas utilizadas para el montaje de las figuras se depositan en Figshare. (Enlace: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61)
Financiación: Este trabajo fue apoyado por BARC a 2010/35/19 /BRNS y en parte de subvención de apoyo /CE1B /11 /V /16-programa de BT /Indo-Aus /06/08/2011 y COE-subvención BT /01 Departamento de Medios Biotecnológicos indo-australiana el RB
Conflicto de intereses.: los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) es una célula conocida madre del cáncer (CSC) marcador expresado en la superficie celular y considerarlo como un tumor antígeno asociado a [1]. EpCAM se sobreexpresa en tumores epiteliales, como el cáncer de mama y cáncer en el ojo de la niñez como el retinoblastoma (RB) [2-4]. EpCAM se asocia con aumento de la proliferación, la migración y la invasión, tanto en el cáncer de mama y RB [5, 6] .EpCAM proteína se diferencia en dominio extracelular (EPEX), dominio transmembrana (EPTM) y el dominio intracelular (EpICD). Desempeña un papel vital en la señalización oncogénica por proteolisis EpCAM y translocación EpICD en el núcleo [7, 8] .Proteolysis de EpCAM conduce EpICD para formar el complejo withFHL2, β-catenina y Lef1. Este complejo se une a sitio de unión theLef1 de los genes diana y modula su transcripción [7] .EpICD se sabe que ocupan la región promotora y regular positivamente SOX2, Oct4 y NANOG que contribuye a la auto-renovación y pluripotencia de las células del cáncer [9].
EpCAM es considerado como un objetivo terapéutico ideal para el tratamiento del cáncer debido a la diferencia en su distribución espacial entre células normales y cancerosas. EpCAM se sobreexpresa en la superficie apical de las células tumorales [10] y mínimamente en la superficie basolateral de las células epiteliales normales y mutaciones no se han descrito en EpCAM hasta ahora en las células del cáncer [11]. Varios anticuerpos anti-EpCAM como edrecolomab y adecatumumab se generaron para apuntar el cáncer y estudiado en ensayos clínicos [12]. Para mejorar aún más el potencial terapéutico de la orientación EpCAM, se buscaron los aptámeros con mayor especificidad y afinidad más alta [13].
Los aptámeros son oligonucleótidos sintéticos (RNA /ssDNA) o moléculas de péptidos que se unen a una diana específica con alta afinidad debido a sus estructuras tridimensionales [14]. Se sintetizan a partir de bibliotecas moleculares grandes por un proceso de selección denominado "evolución sistémica de ligandos por enriquecimiento exponencial '(SELEX) [15, 16]. Ambos aptámeros de ARN y de ADN monocatenario se desarrollaron en contra de la superficie celular EpCAM [13, 17]. Desde que se muestra RNA EpCAM aptámero para ser internalizado por endocitosis, sería capaz de suministrar ARNsi en la célula a la quimerización. Se estudiaron varias estrategias quimerización aptamer siRNA para atacar a las células cancerosas. Se informó aptámeros de ARN contra marcadores de superficie tales como PSMA, EGFR, BAFF-R, integrinas y aptámero de ADN contra la nucleolina para la entrega de siRNA en varios modelos de cáncer (que se resumen en la Tabla S1).
La funcionalidad de aptámero-siRNA quimérico construcciones podrían explicarse en tres pasos tal como (i) la unión y la internalización, (ii) procesamiento de Dicer y el silenciamiento (iii) mediada por RNAi [18]. Anteriormente, hemos demostrado la orientación específica de RB mediante el uso de aptámero-doxorrubicina (EpDT3-dox) que se une EpCAM superficie celular para entregar la doxorrubicina [19]. Aquí, por primera vez, hemos construido ARN EpCAM aptámero-EpCAM siRNA quimera (EpApt-SIEP) para conseguir el silenciamiento de genes en las células EpCAM dirigida EpCAM positivas. También reportamos por primera vez que es EpICD-expresado en más de RB, y derribando EpCAM conduce a la regulación por disminución de los marcadores de CSC como Sox2, Oct4 y Nanog expresión. También se realizó
in vivo
estudios que utilizan el modelo de xenoinjerto en ratones desnudos con la línea celular de cáncer de mama MCF7, como una prueba de concepto para los cánceres epiteliales sólidos que expresa EpCAM. Una elevada actividad antitumoral se logró utilizando nuestra construcción quimérica EpApt-SIEP sin toxicidad. Además, se estudió el mecanismo involucrado en la muerte celular y la inhibición de la proliferación celular en los xenoinjertos de tumores mediante la investigación de los apoptóticos y citoquinas completas moléculas utilizando arrays de proteínas.
Métodos
Fabricación de construcción quimérica y
in vitro
dicer escisión ensayo
EpApt-SIEP se construyó como se describe en Petromus
et
.,
al
. 2009 [20]. La estructura secundaria de la construcción fue estudiado por la estructura del ARN v5.3 [21] y software Mfold [22]. Las construcciones diseñadas fueron sintetizados comercialmente por Dharmacon Inc. (GE ciencias de la vida, Lafayette, CO).
in vitro
ensayo dicer se realizó para demostrar que EpApt-SIEP quimera está siendo procesada por la enzima Dicer para la liberación de siRNA del aptámero quimérico usando el kit recombinante dicer (recombinante humana dicer Enzyme kit Cat No: T510002) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos reaccionado se sometieron a electroforesis y se analizaron por transiluminador UV (protocolo detallado proporcionado en S1 Archivo).
Líneas celulares y cultivo celular primario y RB aptámero estudio captación
línea de RBcell Humano (WERI-Rb1) , línea celular de cáncer de mama (MCF7) comprado de banco de células Riken, RIKEN de bio Center (Ibaraki, Japón) se incluyó en el estudio. Las líneas celulares que estaban libres de contaminación por micoplasma, según lo verificado por puesto de observación para Mycoplasma kit (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 células andWERI-Rb1 se cultivaron en la modificación del medio de Eagle (DMEM) y Rosewell Media Park Memorial Institute (RPMI-1640) mediarespectively con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, Bangalore, India) de Dulbecco. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de las muestras tumorales de CO2 incubator.RB de bolas de los ojos enucleados se recogieron como parte de la terapia y utilizados para fines de investigación de forma anónima. Un consentimiento general escrito se obtuvo de los padres /tutores de la enucleación paciente que se somete. El estudio se realizó de acuerdo a la declaración de Helsinki, en la Fundación de Investigación de la Visión, después de obtener la aprobación del Subcomité de Ética (Junta de Revisión Institucional) de Sankara Nethralaya hospital de ojos [Éticos de limpieza. no. 240-2010-P]. células tumorales RB primarios obtenidos de los ojos enucleados se disociaron por trituración manual, y se cultivaron en medio RPMI que contenía 20% de FBS. medio RPMI y DMEM se adquirieron de Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore, India). La captación de FITC-SIEP EpApt por MCF7 y células WERI-Rb1 se estudió mediante citometría de flujo y microscopía fluorescente siguiendo el protocolo proporcionado en S1 Archivo.
in vitro
eficacia de EpApt-SIEP en la celda líneas
se evaluó
in vitro usando
MCF7 y líneas celulares WERI-Rb1 La eficacia de EpApt-SIEP. Brevemente, 2X10
5 células fueron tratadas con EpApt-SIEP o transfectadas con siEpCAM durante 48 h, el aislamiento de ARN seguido por transferencia de Northern, qPCR para el análisis de ARNm y de Western blot para los niveles de proteína (S1 File)
cuantitativo PCR en tiempo real, en el norte y transferencia Western
Para analizar el efecto de siEpCAM y EpApt-SIEP en la expresión de EpCAM, qPCR y el norte de secante se realizó utilizando ARN total. qPCR se realizó mediante la normalización del gen diana a ß-2-microgloublin (B2M) por el método basado SYBR verde usando las secuencias de cebadores que se enumeran en la Tabla S2. Secante del Norte se realizó mediante electroforesis del ARN total en gel de agarosa formaldehído, transblotted usando tampón SSC, se sondeó con una sonda de ARN antisentido EpCAM marcado con biotina y se desarrolló utilizando el método de quimioluminiscencia. Western Blot se realizó para analizar el nivel de proteína EpCAM usando el protocolo estándar con anti-EpCAM (c-10) anticuerpo (protocolo detallado proporcionado en S1 File).
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica (IHC) era realizado utilizando el sistema de detección de polímero Novolink (biosistemas de Leica, Bangalore, India) siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante utilizando secciones de tejido con parafina-de RB humano. En pocas palabras, la recuperación de antígenos se realizó mediante el método de olla a presión, entonces el bloqueo de la peroxidasa del tejido y el bloqueo primaria se realizó seguido de incubación con el anticuerpo anti-EpICD (imgenex, India). la detección basada en un polímero utilizando DAB cromógeno se hizo, diapositivas secos se montaron y se anotó para los niveles de expresión (protocolo detallado proporcionado en S1 Archivo).
proliferación celular MTT ensayo
Igual número de MCF7 y WERI -Rb1 células (10.000 por pocillo) se sembraron, respectivamente, en una placa de 96 pocillos. Después de 24 h, las células fueron tratadas con 400 nM de aptámero quimera-siRNA. Las células también fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen lifescience, Bangalore, India) con 200 nM EpCAM siRNA (Qiagen, Alemania). Se incubaron las células tratadas durante 48hat 37 ° C en 5% incubadora de CO2. Después de 48 h, MTT (Sigma Aldrich, Bangalore, India) en medio fresco se añadió a las células y se incubó durante 4 h. Los cristales formados se disolvieron en DMSO y se leyó la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrofotómetro SpectraMax.
En vivo
eficacia antitumoral de EpApt-SIEP en xenoinjerto de cáncer epitelial modelo
para estudiar el
in vivo
eficacia de EpApt-SIEP, MCF7, modelo de cáncer epitelial fue elegido ya que el
in vitro
eficacia fue mejor que la línea celular WERI-Rb1. Este estudio se realizó en las instalaciones de Syngene International Pvt. Ltd., comercialmente. Todos los animales fueron manipulados de manera de minimizar o eliminar el dolor y el sufrimiento mediante el uso de anestesia de isoflurano base. cuidado de los animales estaba en conformidad con las recomendaciones del Comité para los fines de control y supervisión de los experimentos con animales (CPCSEA), Gobierno de la India y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC). La "Forma B" para llevar a cabo la experimentación con animales fue revisado y aprobado por el Syngene International Pvt. Ltd., Animal Comité de Ética Institucional (AICE Protocolo Número de Registro: Syngene /AICE /430/10-2013). Los animales se mantuvieron en condiciones controladas y asépticas y provistos de mazorcas de maíz, agua RO autoclave ad libitum y con el ciclo luz /oscuridad de 12 horas cada uno. MCF7cells se suspendieron a una concentración de 5X10
6cells en 200μl de medio libre de suero que contiene 50% de Matrigel y se inyecta por vía subcutánea en la parte posterior del nude atímicos-Foxn1
nuovariectomized ratones hembra de 7-8 semanas de edad implanta con 17β- gránulos de estradiol. Una vez que los tumores se hicieron palpables, los animales fueron agrupados al azar basado en el volumen del tumor (TV≈80mm
3) y la dosificación se inició. El esquema de tratamiento seguido se da en la Tabla S3. El volumen de los pesos corporales y tumorales se midió una vez cada tres días y se calculó el% de cambio en el peso corporal. Durante el sacrificio, se recogió sangre bajo anestesia con isoflurano de todos los grupos para la evaluación clínica de la función hepática (SGOT, SGPT) & amp; la función renal (BUN, urea), frotis de sangre periférica para el recuento diferencial de leucocitos. Los tejidos tumorales y los órganos fueron extirpados y analizados histo-patológicas de hematoxilina y eosina.
array de proteínas para los marcadores de apoptosis y citoquinas
perfiles proteoma se realizó para estudiar el mecanismo de EpApt-SIEP construir Mediada actividad y para estudiar su efecto sobre el inicio de la apoptosis y la respuesta inflamatoria anti-tumor. Se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante; los arrays de proteínas de matriz-Humanos apoptosis, catálogo#ARY009 y ratón del panel matriz de citoquinas Un catálogo#ARY006 (D Systems, Abingdon, Reino Unido R & amp). El ratón de xenoinjerto (control-tratado con vehículo con agua estéril para inyección y EpApt-SIEP tratado) tejidos lisados de proteínas y de suero se prepararon mediante la normalización de su concentración de proteína y se usan en la matriz. Los arreglos se realizaron a una condición idéntica y se desarrollan de forma simultánea para los grupos tanto en el control y tratamiento utilizando XRS ChemiDoc
+ instrumentos (BioRad) utilizando misma exposición. Antecedentes señal de normalización se llevó a cabo y se midió la densidad de píxeles integrada utilizando el software ImageJ con el plugin perfil de microarrays. Se utilizaron las diferencias entre los puntos duplicados para el cálculo de la desviación estándar y se expresaron como barra de error en los histogramas.
El análisis estadístico
El análisis estadístico para el
in vitro Análisis FODA de aptámero quimera sobre las líneas celulares se realizó con desapareado
t-test
. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron tres veces. Para la evaluación de la significación estadística de la inhibición de tumores, no apareado
t-test
se ha realizado mediante Graph Pad Prism v5. Se llevaron a cabo los estudios de inhibición de tumores en ratones de xenoinjerto con n = 8. Los valores de p inferior a 0,05 indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. valor de p en el rango (0,01-0,05) se indica con "*", los valores en el rango (0,01-0,001) con "**" y menos de 0.001 se indica con "#".
Resultados
quimerización de EpApt con siEpCAM;
in vitro
dicer procesamiento mediada y captación celular
EpCAM aptámero quimera siRNA se fabricó siguiendo las estructuras previamente optimizadas de PSMA aptamer siRNA construcción quimérica [20]. En el estudio anterior, tallo y bucle con quimera aptámero de intercambio hebra exhibió mejor silenciamiento comparación con las otras formas quiméricas. De ahí que en el presente estudio, se han fabricado quimera aptámero mediante la ampliación de la secuencia de aptámero con la secuencia de siRNA en su extremo 5 'y el extremo 3'. La fabricado EpApt-siRNA llevó siRNA dirigidos a EpCAM. La estructura de tallo y bucle fue diseñada de forma manual mediante la incorporación de la secuencia de siRNA dirigidos a EpCAM. Además, el aptámeros-siRNA llevó a la modificación resistentes a nucleasa (2F) en las pirimidinas. El extremo 5 'del aptámero era extremo marcado con FITC para controlar la unión de aptámeros y absorción por las células y extremo 3' del aptámero albergado dos voladizos de uridina que ayuda en el reconocimiento y la carga de la enzima Dicer [23]. El EpApt y estructuras quiméricas construidas de aptámero se prevé utilizar v5.3 estructura de ARN y Mfold y presentados en la figura 1A y 1B. Las ayudas EpApt en la unión a EpCAM, internalización y liberación en el citoplasma celular. El EpApt-SIEP bajo la influencia de dicer, siRNA generates21bp que se carga en el complejo RISC, orquesta inhibición de la traducción de ARNm EpCAM escote.
A. EpCAM aptámero predicción de la estructura secundaria de Mfold en línea. B. EpCAM aptámero siRNA construcción quimérica que lleva el EpCAM siRNA dirigidos (EpApt-SIEP) es plegado usando Mfold en línea y el aptámero se indica en el cuadro azul y el siRNA dentro de la caja roja. C. EpCAM aptámero siRNA construcción quimérica se incubó con la enzima Dicer recombinante a 37ºC durante 18 h. Las reacciones se realizaron sin dicer como reacción de control. electroforesis en gel de poliacrilamida de las reacciones con y sin enzima Dicer se corrieron en gel de 15% y se tiñeron con EtBr. Se observaron el siRNA 21 pb procesados y no procesados constructo. D. EpCAM aptámero siRNA construcción quimérica se añadió a las células WERI-Rb1 y MCF7 en tampón de unión y se analizó por citometría de flujo. La gráfica de superposición muestra la captación del aptámero quimérico. E. parcela de dispersión que muestra la captación de EpApt-SIEP por la línea celular RB, WERI-Rb1 y las células tumorales primarias RB. F. EpCAM aptámero siRNA construcción quimérica se añadió a las células RB primarios en medios sin suero durante 2 horas a 37ºC seguido de lavado con PBS 1X. Las imágenes microscópicas fueron tomadas a 20X objetiva de conformidad con los canales de fase y FITC de células control y células solas con EpApt-SIEP. Los datos representan la media ± SD. Los experimentos se repitieron 3 veces independientemente con resultados similares. ** P valor de 0,01-0,001; * P valor de 0,05-0,01.
Para la funcionalidad de sintetizado EpApt-SIEP, el reconocimiento dicer es necesario. Esto fue probado mediante la realización de
in vitro
dicer división de ensayo en. El constructo EpApt-SIEP se incubó con Dicer humano recombinante durante 18 h y posteriormente a electroforesis en gel de agarosa. Los resultados revelaron 21 pb y 19merproducts correspondientes a siRNA y aptámeros, respectivamente (Figura S1). Esto se confirmó mediante la ejecución de una página no desnaturalizante, se obtuvieron fragmentos escindidos de longitud ~ 20-22bp (figura 1C). Se buscó más para analizar la estabilidad de la construcción en condiciones que imitan fisiológicas. La construcción dio como resultado una degradación mínima (& lt; 10% de degradación) hasta 72 horas en los medios sin y con 10% de FBS, respectivamente. El constructo en 100% de FBS era estable hasta 96 horas, aunque, una ligera degradación fue evidente en duración 48h. Por lo tanto las construcciones podrían ser estable bajo condiciones fisiológicas imitan hasta 72 horas (Fig S1 A)
.
La captación celular de los estudios EpApt-SIEP son necesarios para fundamentar la internalización de aptámero a través de endocitosis mediada por receptor. El aptámero EpCAM (EpDT3 /EpApt) ya ha sido dilucidado para la endocitosis mediada por receptor [13] Los estudios .Earlier y estudio actual utiliza aptámero EpCAM scramble (ScrApt), con la modificación de 2'OMe en la cadena principal EpApt impide la unión a EpCAM [13 , 19]. Al igual que en el EpApt-SIEP, se construyó ScrApt quimera (ScrApt-SIEP). El ScrApt-SIEP al quimerización dio lugar a la unión no específica a las células MCF7 (Fig S1B) y no mayor investigación. Encontramos mayor captación celular de EpApt-SIEP construir en MCF7 que WERI-Rb1cells (Figura 1D). Las células primarias RB y la línea celular WERI-Rb1 mostraron captación de quimera. Se encontró que las células RB primarias para exponer una mayor eficiencia de unión de las líneas celulares, debido a los niveles más altos de expresión EpCAM en los tumores (Fig 1E). A partir de los estudios microscópicos del 75% de las células primarias RB mostró captación del EpApt-SIEP (Figura 1F).
EpApt-SIEP silencia EpCAM específicamente en líneas celulares y células tumorales primarias RB
El objetivo entrega específica, la generación de siRNA y capacidad de silenciamiento se estudiaron usando líneas celulares MCF7 WERI-Rb1 y. Dado que el nivel de expresión de EpCAM es mayor en las células MCF7 que WERI-Rb1 [24], el constructo quimérico se evaluó primero para el silenciamiento de EpCAM en las células MCF7. Los resultados de transferencia de Northern mostró el silenciamiento de EpCAM alrededor del 40% en EpApt-SIEP células y alrededor del 25% en las células transfectadas SIEP normalizado a 28S rRNA (Figura 2A y el panel de la derecha) a lo tratado. Un análisis cuantitativo de la expresión de mRNA por qPCR mostró una mejor inhibición de la expresión de EpCAM, -1,8 y -3,4 regulación a la baja de plegado (73% y 90% de inhibición de la expresión del ARNm) en la línea celular MCF7 (P & lt; 0,01) y -1,4 y -1,0 veces regulación a la baja (63% y 51% de inhibición de los niveles de ARNm) en línea WERI-Rb1cell (P & lt; 0,05) (Fig 2B). La regulación a la baja EpCAM también se observó en los niveles de proteína (Fig 2C), las células WERI-Rb1 exhiben 47% y 43% y MCF7 mostraron 65% y 49% de regulación a la baja de la proteína EpCAM (P & lt; 0,05) (Fig 2D). Las transferencias Northern y Western sin procesar se muestran en S2 Archivo.
A. Los niveles de ARNm de EpCAM se detectaron a partir del ARN total del control, SIEP y EpApt-SIEP trataron células MCF7 mediante transferencia northern. El ARN total se sometió a electroforesis en la electroforesis en gel de agarosa formaldehído, se transfirió y desarrollado por método basado quimioluminiscencia. EpCAM siRNA dirigidos se utilizó para sintetizar la sonda. A su derecha, el análisis de densitometría de las bandas se realizó utilizando el software ImageJ y se representa como un gráfico con la expresión de ARNm% contra los ARNr 28s. los niveles de mRNA B. La EpCAM se cuantificaron por el verde SYBR qPCR basada a partir del ADNc de control, SIEP y EpApt-SIEP trataron células MCF7 WERI-Rb1 y. C. transferencia Western se realizó en la SIEP transfectaron y EpApt-SIEP trataron células MCF7 WERI-Rb1 y para el EpCAM y b-tubulina. EpCAM siRNA dirigidos se utilizó para sintetizar la sonda. D. El análisis de densitometría de las bandas de Western Blot se realizó utilizando el software ImageJ y se representa como un gráfico con la expresión% de proteína (EpCAM) normalizado a ß-tubulina. E. El porcentaje de proliferación celular se cuantificó mediante la realización de ensayo de MTT en el control, SIEP transfectadas, EpApt-SIEP, EpApt y ScrApt trataron células MCF7 WERI-Rb1 y. El gráfico muestra la proliferación de células% normalizado a las células control. Los datos representan la media ± SD. Los experimentos se repitieron 3 veces independientemente con resultados similares. ** P valor de 0,01-0,001; * P valor de 0,05-0,01.
El efecto de la construcción quimérica fue probado en células tumorales primarias RB para silenciar. El funcional /metabólica activityof células primarias wasevaluated bytransfecting plásmido pGFP. puesto 24h transfección mayoría de las células mostró muy alta expresión (Fig S2A). Esto confirmó el estado metabólicamente activa de las células primarias, que luego trató de analizar el efecto de EpApt-SIEP y SIEP en estas células. Las células tumorales primarias mostraron inhibición de la expresión de EpCAM un -0,5 -2,4 pliegue y pliegue en siRNA y las células tratadas construcción quimérica, respectivamente (Figura S2 B). La citotoxicidad celular tal como se mide por el ensayo de LDH mostró 37% y 35% de aumento en la actividad de LDH en el silenciamiento de EpCAM usando siRNA y EpApt-SIEP. El EpApt-SIEP construir de manera significativa (P & lt; 0,01) downregulated niveles de ARNm de EpCAM y causaron la citotoxicidad en las células tumorales RB primaria (S2C FIG). La proliferación de las células como una lectura de la actividad metabólica se midió mediante el ensayo de MTT. células TheWERI-Rb1 y MCF7 mostraron una inhibición significativa la proliferación de células con EpApt-SIEP, mientras EpApt o ScrApt solo no mostraron ningún efecto en la proliferación celular (Fig 2E)
EpICD en los tumores primarios RB:. regulación de la madre de cáncer marcadores de células
EpCAM se ha demostrado que se sobreexpresa en las células que inician el cáncer o cáncer progenitor /células (CPC /CSC) [25-27] madre. El mecanismo detrás de esta propiedad fue regulada por la proteolisis intramembrane de EpCAM que conduce a la liberación EpICD y desplazando al núcleo [7] .We reportó la presencia de EpCAM a principios de 2004 y en el presente estudio se pretende estudiar la expresión de EpICD en primaria RB tumores [28]. Los resultados IHC mostraron una intensa tinción nuclear y la intensidad de la tinción nuclear varió entre los tumores estudiados. Los tumores mostraron 40-60% de células positivas y algunos casos mostraron un 70-80% de células positivas para la tinción nuclear. La retina normal estudió no reveló ninguna tinción nuclear evidente (Figura 3A). La intensidad y la distribución porcentual de las células positivas EpICD en el tumor se presentan en la Tabla 1.
A. La inmunohistoquímica de la sección de retina normal sin mostrar evidente EpICD en el núcleo, las secciones de tejido RB que muestra tinción intensa de núcleo. La expresión de EpICD se observó mayormente en el núcleo de las células tumorales, como se muestra por las flechas blancas. B. El factor de cambio en los niveles de mRNA de Sox2, Oct4, Nanog, CD44s, CD133 y survivina (BIRC5) se cuantificaron por el verde SYBR qPCR basado en la SIEP y EpApt-SIEP trataron células WERI-Rb1 y normalizado a ß-2-microglobulina como limpieza de genes. C. El factor de cambio en los niveles de mRNA de Sox2, Oct4 y Nanog se cuantificaron por SYBR verde basada qPCR de la SIEP y EpApt-SIEP trataron células MCF7 y normalizado a ß-2-microglobulina como la limpieza gene.Data representa la media ± SD. Los experimentos se repitieron 3 veces independientemente con resultados similares ** valor de p de 0,01-0,001.; * P valor de 0,05-0,01.
El EpICD liberado forma compleja proteína nuclear mediante la interacción con el FHL2, β-catenina y media la transcripción de genes Lef1 y ayudas en la proliferación celular. La regulación de EpICD en la expresión de marcadores de pluripotencia se informó anteriormente [9] y estábamos interesados en estudiar la modulación de EpCAM detrás de la expresión de Oct4, Sox2, NANOG, CD133, CD44s. Estamos, además, estudió la expresión de los niveles de survivina al silenciamiento de EpCAM en la línea celular RB, WERI-Rb1. silenciamiento EpCAM utilizando la transfección de siRNA o EpApt-SIEP mostró una mayor regulación a la baja de Sox2, Oct4 y Nanog en células transfectadas siRNA en comparación con el EpApt-SIEP, mientras que el CD133, CD44s y los niveles de survivina fueron más regulados a la baja en las células transfectadas EpApt-SIEP (figura 3B ). Estamos, además, se estudió la expresión de Sox2, Oct4 y Nanog en células MCF7 y encontramos regulación a la baja de Sox2 y Oct4 NANOG pero no en silenciar EpCAM utilizando siRNA o EpApt-SIEP construir (Figura 3C). De esta manera hemos sido capaces de dilucidar la regulación de los marcadores de células madre por EpCAM través EpICD
EpApt-SIEP una regresión del cáncer de mama:.
in vivo de xenoinjertos
estudio
El antitumoral efecto de la EpApt-SIEP se estudió con el cáncer de mama
in vivo
modelo. Se inyectaron células MCF7 en ratones desnudos ovariectomizados bilateralmente suplementados con estrógeno externo. La dosificación de EpApt-SIEP se realizó en días alternos desde day0 a Día 14 y en day20, los animales se dosificaron, 24h después n = 4 fueron sacrificados de cada grupo. La cinética de crecimiento de tumores mostraron una reducción significativa (P & lt; 0,01) en el volumen tumoral, el control del vehículo mostró 584mm
3, mientras que el animal tratado mostró 52mm
3 significa el volumen del tumor. El resto de n = 4 en el grupo de control del vehículo y el grupo EpApt-SIEP se dosificaron en day22 y day24, más estudiado hasta day33. Los volúmenes promedio de tumor en day33, para el grupo de control del vehículo y EpApt-SIEP eran 922mm
3 y 64 mm
3, respectivamente. El perfil de crecimiento del tumor, tanto para los grupos durante este período se muestra en la figura 4A. Se encontró que la inhibición del crecimiento del tumor% (TGI) para el grupo EpApt-SIEP al nivel de dosis probado ser 102% (Day33,
#indicates p & lt; 0,001). Por day33, los ratones (Figura 4B) fueron sacrificados y los tumores fueron extirpados (figura 4C), seguido por el análisis de la expresión de marcadores de células madre del cáncer y EpCAM, los responsables de apoptosis y proteínas resistentes a los fármacos se llevaron a cabo.
cinética de crecimiento del tumor de xenoinjerto MCF7 tratados con EpApt-SIEP. ratones desnudos hembra (HSD: atímicos Nude-Foxn1
nu, ovariectomía bilateral) alojados en jaulas ventiladas individualmente (IVC) se utilizaron para la presente investigación. La tumorigenicidad de las células MCF7 en ratones es dependiente de estrógenos. Veinte horas antes de la inyección de células MCF-7, los animales fueron implantados con pellets de 17ß-estradiol (0,36 mg /pellet; liberación de 60 días; Innovative Research of America, Sarasota, FL) en región omóplato dorsal de ratones utilizando trocar. MCF-7 células tumorales (5 x 10
6 células /animal) fueron inyectados por vía subcutánea en los flancos de los animales. Después de 7-10 días después de la inyección de las células, los animales fueron asignados al azar basado en el volumen del tumor (TV≈80mm3) y la dosificación se inició. Gráfico que muestra la (A) El volumen del tumor del grupo de control de vehículo inyectados con PBS por vía subcutánea cerca del sitio del tumor, EpApt-SIEP subcutánea inyecta cerca del sitio del tumor en días alternos. Las flechas de color naranja indican las inyecciones EpApt-SIEP dados y el asterisco azul indica el día del sacrificio. En el Día 21 y 33, debido a razones experimentales y éticas animales de ambos grupos se sacrificaron 50% en cada tiempo. Las fotografías de los ratones representativos (B) y los tumores extirpados (C) de control del vehículo y los grupos tratados. D. Los cambios en la expresión de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western de proteínas de la extracción del tejido representante de los ratones de control o ratones tratados con EpApt-SIEP (0.6nmol) y terminado en 21 y 33 días respectivamente (a su derecha, gráfico que representa la expresión relativa calculado por ImageJ software. E. gráfico que muestra los cambios en MCF7 EpCAM tejido tumoral de xenoinjerto, los niveles de CD44s, CD24 mRNA y MRP1 después del tratamiento con EpApt-SIEP constructo. el control del vehículo se utilizó para la normalización de la expresión pliegue y la microglobulina β-2 se utilizó como control interno. F. Gráfico que muestra los cambios en los niveles STMN, BIRC5, Bcl2, Bax mRNA y los cajeros automáticos después del tratamiento con EpApt-SIEP aptámero construir la normalización se hizo con tanto grupo sin tratamiento /control del vehículo. los datos representan la media ± sE para
in vivo
experimento (n = 8) y la media ± SD para otros experimentos se llevaron a cabo experimentos por triplicado y la significación se calculó mediante la prueba t#P & lt;.. 0,001; P ** El valor de 0,01-0,001; valor de p * de 0,05-0,01.
el efecto de EpApt-SIEP construir sobre la expresión de EpCAM y otros marcadores de CSC fueron estudiados entre el control y el grupo tratado con vehículo (n = 2) secciones de tumores recogidos de day21 y day33 respectivamente. Para comprobar el efecto de silenciamiento inducido por EpCAM EpApt-SIEP construir, la expresión de EpCAM se analizó por Western blot en el nivel de proteínas, se incluyó, además, la proteína ABCG2. El análisis de densitometría mostró 55% y 60% de EpCAM regulación a la baja de proteína en el grupo day33 day21and, mientras que la proteína ABCG2 mostró 60% y 85% de regulación a la baja en day21 y day33 respectivamente en EpApt-SIEP muestras tratadas en comparación con el control del vehículo (Fig 4D).