Extracto
Labio y Paladar Hendido proteína transmembrana 1-Como (CLPTM1L), reside en una región del cromosoma 5 para los que copia el número de ganancia se ha encontrado para ser el evento genético más frecuente en las primeras etapas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Este lugar ha sido encontrado por múltiples estudios del genoma amplia asociación para ser asociados con el cáncer de pulmón en los fumadores y los no fumadores. CLPTM1L ha sido identificado como una proteína sobreexpresada en líneas celulares de tumor de ovario humano que son resistentes a cisplatino, que es la única visión hasta el momento en la función de CLPTM1L. Aquí encontramos la expresión CLPTM1L a incrementarse en los adenocarcinomas de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales de la misma y en el pulmón líneas de células tumorales por mecanismos no exclusivos para copiar el número de ganancia. Cuando se pierde la acumulación CLPTM1L en las células tumorales de pulmón, cisplatino y la apoptosis inducida por camptotecina se incrementaron en proporción directa con el nivel de CLPTM1L caída. la acumulación de Bcl-XL se redujo de manera significativa en la pérdida de CLPTM1L. La expresión de Bcl-XL exógeno abolió la sensibilización a matar apoptóticas con CLPTM1L caída. Estos resultados demuestran que CLPTM1L, una proteína sobreexpresada en las células tumorales de pulmón, protege de la apoptosis inducida por el estrés genotóxico mediante la regulación de Bcl-xL. Por lo tanto, este estudio implica la función anti-apoptótica CLPTM1L como un mecanismo potencial de la susceptibilidad a la tumorigénesis de pulmón y la resistencia a la quimioterapia
Visto:. James MA, Wen W, Wang Y, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et al. (2012) Caracterización funcional de CLPTM1L como un gen candidato Riesgo de Cáncer Pulmonar en el 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10.1371 /journal.pone.0036116
Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2011; Aceptado: March 30, 2012; Publicado: 4 Junio 2012
Copyright: © 2012 James et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por un Instituto Nacional del cáncer del Centro del cáncer de subvención CA91842 Soporte#P30, el proyecto Human Protein Atlas, y la subvención del NCI U19CA148127. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CLPTM1L se llama así en base a su homología con labio y paladar proteína transmembrana 1, que fue identificado como perturbado en una familia con labio leporino y paladar [1]. CLPTM1L fue identificado como una transcripción regulada en marcha en una línea celular de tumor de ovario resistente al cisplatino [2]. Sin embargo, la interpretación de los resultados de este estudio es difícil, ya que no hay implicación del mecanismo y el efecto de la sobreexpresión de CLPTM1L en la sensibilidad a cisplatino fueron contradictorias en diferentes líneas de células tumorales de ovario, en función de su nivel preexistente de resistencia. Sin embargo, se sugirió un papel para CLPTM1L en la resistencia al cisplatino. Curiosamente, el CLPTM1 homólogo se ha encontrado que se expresa en niveles más altos en los tumores de mama resistentes a la doxorrubicina, y la expresión de CLPTM1 es predictivo de la respuesta a la doxorrubicina [3]. Un estudio reciente encontró que una variante genética en el gen CLPTM1L (rs402710) se asocia con la acumulación de aductos de ADN en el tejido pulmonar adyacente del tumor [4]. Este mismo SNP, entre otros en la región de los genes CLPTM1L y TERT se asocia con el riesgo de cáncer de pulmón [5], [6], [7]. En un estudio reciente sobre el cáncer de cuello de útero integración de los datos de dosis génica y de expresión, se encontró que el locus CLPTM1L /terc tener número de copias ganancia en los tumores y los patrones de expresión que se correlacionaron con el aumento de número de copias [8]. Otro estudio reciente reveló que con copia el número de ganancia a través de 5p, expresión CLPTM1L aumentó aproximadamente 5 veces en líneas celulares de cáncer de cuello uterino más de células epiteliales cervicales normales, mientras que la expresión de los otros genes en 5p15.33 no se ha modificado [9]. Estas ideas sobre la función de CLPTM1L, y el hecho de que copian el aumento de número de la región del cromosoma 5p que contiene CLPTM1L es el evento citogenética más frecuente en las primeras etapas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [10] son una justificación convincente para el estudio del papel de CLPTM1L en el cáncer de pulmón, así como otros tipos de cáncer.
daño en el ADN, como la causada por agentes quimioterapéuticos genotóxicos, induce la apoptosis a través de quinasas de ruptura asociado de doble cadena, y la regulación transcripcional posterior de apoptosis efectores principalmente a través de p53 [11]. miembros de la familia Bcl-2 regulados por p53 incluyendo Bax son centrales a la activación de la apoptosis por esta vía y actuar por permeabilización de la membrana mitocondrial [12]. Anti-apoptóticos miembro de la familia Bcl-2 Bcl-xL protege a las células cancerosas de la apoptosis inducida por p53 [13] y actúa a través de la unión y la inactivación de Bax [14] y la unión de proteínas que reclutan Bax a la membrana mitocondrial [15]. Bcl-xL se sobreexpresa frecuentemente en tumores de pulmón, se asocia con un mal pronóstico [16], [17] y desempeña un papel importante en la resistencia a los agentes quimioterapéuticos genotóxicos en pulmón y otros tipos de cáncer [18], [19], [20] , [21], [22], [23]
a pesar de una conexión de CLPTM1L al cáncer es sugerido por el aumento de número de copias, la asociación del genoma de ancho y estudios en líneas celulares de tumores ováricos.; la función de CLPTM1L y su papel en la tumorigénesis es hasta ahora desconocido. Aquí mostramos que CLPTM1L es un factor anti-apoptótica comúnmente se sobreexpresa en tumores de pulmón. Desmontables de CLPTM1L transcripción en células de NSCLC resultado en un aumento de la sensibilidad al estrés genotóxico mediado muerte apoptótica y disminuye la expresión de Bcl-xL en una forma dependiente de la dosis de la expresión CLPTM1L. Por otra parte, la expresión de Bcl-XL exógena suprime la sensibilización a la apoptosis inducida por el estrés genotóxico CLPTM1L caída. Este efecto protector no es exclusivo de cisplatino mediada por asesinato. Más bien, CLPTM1L actúa indirectamente como un inhibidor general de la vía mitocondrial de la apoptosis mediante la regulación de Bcl-XL. Estos resultados demuestran un papel para CLPTM1L en la resistencia quimioterapéutico en las células tumorales de pulmón, y sugieren un papel para CLPTM1L en la tumorigénesis de pulmón a través de protección de la apoptosis a través de aumento de la acumulación de Bcl-xL.
Resultados
Expresión de CLPTM1L en tumores de pulmón
informes dados de ganancia de número de copias en el cáncer de pulmón, la evidencia GWAS, y el aumento de la expresión de CLPTM1L en las células tumorales de ovario resistentes a cisplatino, hemos tratado de determinar si CLPTM1L se sobreexpresa en tumores de pulmón. La expresión de mRNA CLPTM1L en los tumores de NSCLC paciente se comparó con la de los tejidos de tumor adyacente emparejados por qPCR. CLPTM1L se incrementó en un promedio de 2,24 veces alcanzando una importancia general para la expresión diferencial en 30 pacientes con NSCLC en estadio I (p = 0,0028, prueba t de Student de dos colas) (Figura 1A). Aunque la expresión de TERT era un promedio de 1,76 veces mayor en los tejidos tumorales, diferencias globales en la expresión de TERT no alcanzaron significación y no se correlacionaron significativamente con la expresión CLPTM1L (r
2 = 0,0018, p = 0,994) (Figura S1 A). La muestra consistió en 22 adenocarcinomas y 8 pacientes con carcinoma de células escamosas Tabla S1 se describen las características conocidas de la población estudiada. No hubo diferencia en el tumor de la sobre-expresión entre los carcinomas de células escamosas y adenocarcinomas (datos no mostrados). El análisis de los datos de microarrays de expresión a partir de líneas de células tumorales de pulmón 148 y 59 líneas de células "normales" inmortalizado con terc Cdk4 y confirmó estos resultados, revelando una diferencia media de 2,02 veces en la expresión CLPTM1L en comparación con líneas celulares inmortalizadas (p = 1.48E-9, dos la prueba t de Student -tailed) (Figura 1B). Estos datos también demuestra que la expresión de CLPTM1L se incrementa en las células tumorales por mecanismos distintos de la variación del número de copias, como análisis con exclusión de las líneas de células tumorales con la variación del número de copias permaneció significativa (p = T-Test 1.28E-8, de dos colas de Student) y similar en magnitud (1,83 veces) (Figura 1C). cambio de número de copia era idéntico entre CLPTM1L y terc genes. Sin embargo, no se observó correlación entre la expresión y la expresión de TERT CLPTM1L dentro de líneas de células tumorales (r
2 = 0,0126, p = 0,175) (Figura S1B). Análisis de la expresión también se llevó a cabo para diferentes subtipos de tumores de pulmón. líneas celulares de adenocarcinoma mostraron un pliegue mayor expresión promedio de 2.15 CLPTM1L sobre líneas celulares inmortalizadas normales (p = 3.59E-7, dos colas de la t de Student) y de células pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón mostró un promedio de 2,07 veces mayor expresión (p = 1,15 Prueba T E-9, de dos colas de Student) (Figura 1D). Por lo tanto, el aumento de expresión CLPTM1L parece ser una característica de los tumores de pulmón, independientemente de subtipo.
A) acumulación CLPTM1L transcripción medido por qPCR en tejidos de adenocarcinoma de pulmón en relación con la media de tejido adyacente normal correspondiente tumor en 30 pacientes que demuestra un aumento medio de 2,23 veces en la expresión en los tejidos tumorales. B) la acumulación CLPTM1L transcripción medido por microarray en líneas celulares de tumores de pulmón respecto a la media de las líneas celulares inmortalizadas no transformadas que demuestran un aumento medio de plegado 2,02 en la expresión en líneas celulares de tumor. C) La línea celular de expresión con excepción de las líneas de células tumorales con la variación del número de copias que demuestra un aumento de 1,83 veces en líneas celulares tumorales de datos. línea D) de la célula dividida en líneas celulares de adenocarcinoma y líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas. Las barras negras representan valores medios. p-valores se obtuvieron utilizando de Student de dos colas t-test.
CLPTM1L Resistencia confiere al estrés genotóxico inducido por apoptosis en células tumorales de pulmón
Dado que la expresión aumentada de CLPTM1L se asocia con tumores de pulmón, que tuvo como objetivo modular los niveles de CLPTM1L en las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y determinar la respuesta a agentes genotóxicos. Desmontables de CLPTM1L en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 y H838 se realizó mediante tres vectores virales shRNA independientes y resultó en una gama de rendimientos de hasta el 90% medido por cuantitativa en tiempo real PCR y mediante inmunotransferencia (Figura 2A y B). El efecto de CLPTM1L caída en la destrucción por cisplatino se determinó en estas líneas celulares. Se contaron las células, se sembraron en un número igual a aproximadamente 50% de confluencia, y se ensayaron para la viabilidad por el recuento de células después de 48 horas de tratamiento con cisplatino. Destrucción de células tumorales de pulmón por el cisplatino se aumentó en caso de pérdida de CLPTM1L de una manera dependiente de la dosis, que van desde 53% de viabilidad en células A549 con el vector solo a 12% de viabilidad en células con shCLPTM1L-3 (Figura 2C). Del mismo modo, se indujo apoptosis en células A549 con caída estable de CLPTM1L usando camptotecina, un inhibidor de topoisomerasa I células A549 se sembraron en igual número y se ensayó la viabilidad por el ensayo de MTS después de 48 horas de tratamiento con camptotecina. Una vez más, la pérdida de CLPTM1L a través de células tumorales de pulmón desmontables shRNA sensibilizado a la dosis muerte apoptótica dependiente de una manera consistente con el nivel de expresión CLPTM1L (Figura S2), lo que demuestra que los efectos anti-apoptóticos de CLPTM1L no es exclusivo de cisplatino. Se observaron resultados similares en células H838, lo que demuestra un aumento de la sensibilidad a la camptotecina inducida matanza sobre desmontables de expresión CLPTM1L (Figura 2D). De acuerdo con estos hallazgos, exógeno sobre-expresión de CLPTM1L en células H1299, que se determinaron para expresar niveles relativamente bajos de transcripción CLPTM1L endógeno en comparación con las células A549 de análisis de microarrays (datos no mostrados), dio como resultado un aumento en la viabilidad celular de 27% con vector solo a 36% con CLPTM1L la sobre expresión (p & gt; 0,04) después del tratamiento con camptotecina en relación con DSMO controles de disolvente (Figura 2E)
a) Desmontables de expresión CLPTM1L en células A549 a través de shRNA estable.. La confirmación de la caída por Western blot (recuadro). B) Derribo de expresión en células H838 CLPTM1L través shRNA estable. La confirmación de la caída por Western blot (recuadro). C) La viabilidad celular relativa de las células A549 con CLPTM1L caída después de 48 horas de tratamiento con cisplatino o los medios de comunicación. D) viabilidad celular relativa de las células H838 con CLPTM1L caída después de 48 horas de tratamiento con vehículo DMSO o 1 M camptotecina. E) la viabilidad celular relativa de las células H1299 con CLPTM1L sobre-expresión después de tratamiento de 48 horas con vehículo DMSO o 10 M camptotecina. Las barras de error representan una desviación estándar de la media de triplicados biológicos. Se utilizó
Anexina V inmunofluorescencia detectada por citometría de flujo como un marcador de apoptosis temprana en las células A549 con o sin CLPTM1L desmontables y tratamiento con cisplatino. Se observó un aumento dependiente de la dosis de la apoptosis con pérdida de CLPTM1L (Figura 3A). Mientras que sólo el 16% de las células con el vector solo fueron apoptóticas después del tratamiento con cisplatino 10μM durante 24 horas, el 76% de las células con shCLPTM1L-3 fueron apoptóticas. La resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino se encontró que era proporcional a la cantidad de CLPTM1L acumulación de transcripción en estas células, con un r
2 de 0,9808 (p = 2 × 10
-8) entre el porcentaje de caída y el porcentaje de células apoptóticas ( Figura S3A). Las concentraciones de cisplatino en los límites más bajos de sensibilidad se utilizaron para permitir la resolución de las sensibilidades que confieren los distintos niveles de CLPTM1L caída. Los agentes que dañan el ADN cisplatino y nitrosamina 4- (metil-nitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) ambos causados acumulación de roturas de la cadena de ADN de forma independiente de la expresión CLPTM1L como se detectó por el método de COMET (Figura S4) . Por lo tanto, el aumento observado en la sensibilidad al cisplatino tositivity en caso de pérdida de CLPTM1L es debido a un efecto sobre la apoptosis o la apoptosis de señalización en lugar de un efecto sobre los niveles de daño del ADN aguda. La sensibilidad a la apoptosis inducida por cisplatino también se incrementó con la pérdida de expresión CLPTM1L por shRNA en las células tumorales H838 (Figura 3B), medida por ensayo de actividad de la caspasa 3/7 colorimétrico. Una vez más la resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino fue proporcional a la cantidad de CLPTM1L acumulación de transcripción en las células, con un r
2 de 0,8847 (p = 1,3 × 10
-4) entre el porcentaje de caída y relativa actividad de la caspasa 3 (figura S3B). La aparición de células en cultivo es consistente con el aumento de la sensibilidad a cisplatino inducida por apoptosis en la pérdida de CLPTM1L (Figura 3C)
.
A) Anexina de unión por citometría de flujo de las células A549 con CLPTM1L caída después de 48 horas de tratamiento con cisplatino V . B) En relación caspasa 3/7 actividad en las células H838 con CLPTM1L caída después de 48 horas de tratamiento con cisplatino. Las barras de error representan una desviación estándar de la media. ** - P & lt; 0,01 * - p & lt; 0,02 por dos colas de la t de Student. C) Las micrografías de las células A549 con CLPTM1L caída después de 24 horas de tratamiento con 50 mM cisplatino muestra aumentó la muerte celular genotóxico en caso de pérdida de CLPTM1L.
Reglamento de Bcl-xL expresión es esencial para Efectos sobre la apoptosis CLPTM1L
para investigar el mecanismo de protección CLPTM1L de la apoptosis, que mide los niveles de proteína de los reguladores de apoptosis en las células A549 no tratados en comparación con los tratados con cisplatino. Para la evaluación de la exigencia de CLPTM1L para la regulación de la apoptosis, se evaluaron las construcciones desmontables más eficaces en células A549 (SH2 y SH3). El tratamiento de células A549 con 20 M de cisplatino inducida por acumulación de p53 y la p53 objetivo pro-apoptóticos, Bax, y disminución de la acumulación de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2, de acuerdo con el daño del ADN inducido intrínseca ruta apoptótica (Figura 4A). La expresión de estos reguladores de apoptosis no fue afectado por desmontables de CLPTM1L solo. Sin embargo, la proteína anti-apoptótica Bcl-XL, mientras afectada por el tratamiento con cisplatino en las células A549, se redujo cuando los niveles de CLPTM1L fueron aplastados por shRNA expresión. Desmontables de CLPTM1L con shRNAs reduce los niveles de proteína Bcl-XL en un 81% y un 76% en las células tratadas con cisplatino (p & lt; 0,003, de dos colas de la t de Student), medida por tres análisis independientes occidentales (Figura 4B). Por lo tanto, expresado de forma estable exógeno Bcl-XL en células con y sin desmontables de CLPTM1L para evaluar el papel de Bcl-xL en la protección CLPTM1L de apoptosis. Re-expresión de Bcl-xL fue confirmada por Western blot (Figura 4C). Mientras desmontables de CLPTM1L aumento de la apoptosis en las células transfectadas con vector vacío en un 71%, exógeno Bcl-XL eliminó la apoptosis dependiente de CLPTM1L (Figura 4D). La resistencia a la apoptosis inducida por el estrés genotóxico estrechamente correspondió a los niveles de Bcl-xL y Bcl-XL de la reconstitución completamente derogada la sensibilización al estrés genotóxico la apoptosis inducida por CLPTM1L.
A) de Western blot para los reguladores de apoptosis en las células A549 con CLPTM1L caída después el tratamiento con cisplatino muestra disminución de la expresión de Bcl-xL en caso de pérdida de CLPTM1L. Se muestran manchas de Bcl-XL para dos poblaciones separadas representativos clonales de células A549 con CLPTM1L desmontables (# 1 y#2). B) Representación gráfica de la expresión de Bcl-XL en células con CLPTM1L caída de tres populationsA549 clonal independiente. Las barras de error representan una desviación estándar de la media. * - P & lt; 0,003 por la prueba t de Student C) transferencias de Western que confirman la expresión de Bcl-XL exógeno en las células A549 con CLPTM1L caída. D) el recuento de células viables relativas en células A549, con la eliminación CLPTM1L y la expresión ectópica de Bcl-XL después del tratamiento con cisplatino que demuestra la supresión de apoptosis efecto de la pérdida de CLPTM1L tras la expresión ectópica de Bcl-XL.
Discusión
la supervivencia de las células sometidas a daño en el DNA de la inestabilidad genómica o de estrés genotóxico conduce a la acumulación de lesiones genéticas que caracterizan tumores humanos. Abrogación del punto de control del ciclo celular y la apoptosis salvaguardas contra la replicación del ADN dañado es una característica del cáncer. El resultado de la protección contra la apoptosis inducida por daño en el ADN incluye tanto la vulnerabilidad a la mutación somática sin control y disminución de la sensibilidad a la radioterapia y la quimioterapia. El estudio anteriormente referenciado por Zienolddinny et al. sugiere que los polimorfismos CLPTM1L pueden afectar a la acumulación de daño del ADN [4]. Sobre la base de nuestras observaciones, es plausible que la protección de la apoptosis por CLPTM1L contribuye a la acumulación de daños en el ADN, lo que confiere susceptibilidad a la tumorogénesis. Una hipótesis alternativa es que CLPTM1L juega un papel en el reconocimiento o la reparación del daño en el ADN, que afecta a la acumulación de tales daños. Otra es que CLPTM1L influye directamente en la cantidad de daño en el ADN que se incurre por agentes genotóxicos. Nuestros datos (Figura S4) sugiere que la expresión CLPTM1L no afecta directamente los niveles de daño en el ADN aguda incurrido por el cisplatino o NNK. Por otra parte, el estudio actual demuestra que CLPTM1L tiene un papel de apoptosis aguas abajo de daño del ADN y a través de la regulación de la expresión de Bcl-xL, que es probable que afecte acumulación de daño del ADN. La observación de la acumulación diferencial de Bcl-xL en modulación de la expresión CLPTM1L, junto con la reconstitución de un fenotipo resistente a la apoptosis con la expresión exógena de Bcl-xL, proporcionan evidencia de que CLPTM1L actúa aguas arriba de Bcl-xL para conferir resistencia a la apoptosis inducida por el estrés genotóxico. En exógenos experimentos de expresión Bcl-XL, parece que menos Bcl-xL se expresa en el vector que contiene células que se observó en los experimentos anteriores, a pesar de la disminución de la acumulación en las células con CLPTM1L caída sigue siendo evidente. Al mismo tiempo, la muerte apoptótica es ligeramente más robusto en el vector que contiene células observadas en los experimentos anteriores, pero la tendencia de aumento de la sensibilidad a la pérdida de CLPTM1L y Bcl-XL se mantiene. Es importante destacar que este estudio muestra que la función anti-apoptótica de CLPTM1L no es exclusivo de la sensibilidad cisplatino, pero es una inhibición general de la vía mitocondrial de la apoptosis.
sobreexpresión Común de CLPTM1L en tumores apoya la noción de un oncogénico o tumor promover el papel de CLPTM1L en los cánceres de pulmón. Los estudios de expresión de proteínas realizan y anotados por el proyecto Human Protein Atlas [24] confirmar nuestros hallazgos. La inmunohistoquímica en las células alveolares y los tumores de pulmón humano normal demostró expresión negativa de CLPTM1L en los tejidos normales, mientras que la expresión en 12 tumores de pulmón promedio de una puntuación de 1,91 en una escala de 0-3 (Figura S5). Una puntuación de 0 es negativo, 1 es "débil", 2 es "moderado" y 3 es "fuerte". Seis de estos pacientes fueron diagnosticados con carcinoma de células escamosas y seis fueron diagnosticados de adenocarcinoma. No se observó diferencia significativa en la expresión entre las dos patologías. Un total de 66 tejidos normales de diversos órganos obtuvo una media de 0,98 (débil). Ninguno de los tumores de pulmón probados fueron negativos. De pulmón líneas de células tumorales A549 (NSCLC) y SCLC-21H (células pequeñas) mostraron una fuerte tinción y coloración moderada, respectivamente.
datos de microarrays de tumores y líneas celulares inmortalizadas demuestra que los mecanismos distintos de la copia consecuencia el aumento de número en aumento de expresión en un subconjunto de tumores. En el genoma asociaciones de ancho, las cuentas locus 5 p15.33 para la mayor contribución al riesgo de cáncer de pulmón de tres loci conocidos en los seres humanos [6]. El locus p 5 también está implicado en el carcinoma cutáneo de células escamosas y el melanoma [25], el cáncer de ovario [26], cáncer testicular de células germinales [27] y el cáncer de cuello uterino por el aumento de número de copias [8]. En el estudio de cáncer de cuello uterino, CLPTM1L emergió del 5 p locus que tienen patrones de expresión que se correlacionaron con el aumento de número de copias. Otro estudio reciente del número y los cambios de expresión de copias en líneas celulares de cáncer cervical reveló que con el aumento de número de copia a través de 5 p, expresión CLPTM1L aumentó aproximadamente 5 veces más que las células epiteliales cervicales normales, mientras que la expresión de los otros genes a los 5 p15.33 no era cambiada [9]. El gen de TERT está también dentro de esta región genética. En el análisis de SNPs en la región 5 p, se ha encontrado que el cáncer de pulmón de SNPs asociados no están asociados con la longitud del telómero (datos no mostrados), de acuerdo con otros dos estudios [28], [29]. Por el contrario, un estudio realizado por Rafnar et al. mostró una asociación (
p = 0,017
y 0,027, respectivamente) entre 5 variantes (p rs401681 y rs2736098) y la longitud del telómero, aunque este efecto sólo se observó cuando las mujeres mayores de 75 años con genotipos homocigotos se incluyeron [30 ]. Para nuestro conocimiento, no se han identificado mutaciones comunes de codificación, ya sea en CLPTM1L o terc. Es plausible que tanto de TERT y CLPTM1L contribuyen a la susceptibilidad en este locus, que tiene un efecto co-fundador. Un estudio reciente [5] ofrece varias líneas de evidencia que la asociación de cáncer de pulmón rs31489 en el gen CLPTM1L es una observación independiente de la asociación de rs2376100 en el gen de TERT. El estudio más reciente densa genotipado de 5 p15.33 encontró múltiples asociaciones en 5p15.33, con la región de la asociación está centrada sobre CLPTM1L [7]. Nuestro análisis anterior muestra que rs31489 es la variante más fuertemente asociado con el cáncer de pulmón familiar en este locus. El presente estudio indica que CLPTM1L también juega un importante papel funcional en relación con el cáncer, y que este gen puede ser al menos parcialmente responsable de la asociación de variantes en la región 5p15.33 con cáncer de pulmón. los esfuerzos para definir aún más la variación genética de conducción de susceptibilidad al cáncer de pulmón en esta región genética continua son un paso importante en la evaluación de la relación de CLPTM1L y otros genes en la región con la susceptibilidad del tumor de pulmón.
sobreexpresión Común de CLPTM1L en el pulmón tumores y un papel funcional en la tensión inducida por apoptosis genotóxico identifican CLPTM1L como un factor importante que influye en la supervivencia de ADN dañado células tumorales y, potencialmente, la susceptibilidad al cáncer de pulmón. Orientación CLPTM1L así como Bcl-xL puede llegar a ser enfoques útiles para la quimioprevención y tratamiento del cáncer de pulmón. La orientación de estas proteínas anti-apoptóticas también pueden tener potencial de sensibilización de los tumores a quimioterapias y radioterapias tradicionales.
Materiales y Métodos
PCR
paciente en tiempo real RT-cuantitativa igualaron las muestras de ARN normales adyacentes al tumor tumor y fueron obtenidos de la base de adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Washington en St. Louis bajo protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Washington en la Escuela de Medicina de St. Louis, la Oficina de Protección de Investigación humana. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los pacientes que participan en este banco de tejidos. Se aisló ARN de líneas celulares utilizando reactivos y protocolos (Invitrogen, Carlsbad, CA) Tri-zol. Quantitative PCR en tiempo real (qPCR) se llevó a cabo utilizando el método como se describe anteriormente (Chaparro, Wen et al. 2005). En pocas palabras, un microgramo de ARN total por muestra se convirtió en ADNc utilizando el sistema Superscript First-Strand Síntesis de RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). ensayo de RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando el SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se añadió un microlitro de ADNc a un agua de 25 l mezcla de reacción total del volumen que contiene, SYBR Green PCR Master Mix, y los cebadores. Cada ensayo en tiempo real se realizó por duplicado en una máquina MyIQ BioRad. Los datos fueron recogidos y analizados con el software de Stratagene Mx3000. La
β-actina
gen (Actb) se utilizó como un control interno para calcular el nivel de expresión relativa (? C
T) para cada muestra. Imprimación eficiencia y linealidad conjunto se calculó, y la normalización se llevó a cabo de conformidad con las directrices MIQE. El factor de cambio de la expresión génica en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales emparejados se calculó como 2
d, donde d =? C
T
Normal -.? C
T tumoral
análisis de microarrays
microarrays de expresión se realizó a través de Illumina HumanWG 6-V3 plataforma, que contiene 48.800 sondas correspondientes a 20.700 genes únicos. ARN (500 ng) se marcaron y se hibridó con los arrays BeadChip como se especifica por el fabricante (www.illumina.com). matriz de datos se pre-procesadas con el algoritmo MBCB (Ding, LH et al, Nucl Acids Research, 2008, 36:. e58). y la expresión diferencial se determinó mediante el cálculo de factor de cambio y la prueba T
Cell Culture, Las células A549 desmontables y sobreexpresión
(ATCC, Manassas, VA), recientemente autenticados por Genetica Laboratores, Inc. (Cinncinati, OH), fueron cultivadas en RPMI-1640 más del 10% de SFB (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las células fueron transducidas con vectores lentiviral ARN corto horquilla (shRNA) basados en el vector pLKO.1 y diseñados para apuntar específicamente transcripción CLPTM1L humana (Sigma, St. Louis). vector vacío o vector derribando CLPTM1L transcripción fueron empaquetados primero en células 293T (Orbigen, San Diego, CA) con plásmidos auxiliares y luego transducidas en las células A549 con 8 mg /ml de Polybrene (Sigma, St. Louis, MO). Se reemplazó el medio 24 horas después de la transducción, y las células se dividieron 1:4 48 horas después de la transducción. A las 72 horas después de la transducción, se seleccionaron las células que albergan constructos de lentivirus con 1 mg puromicina /ml durante 2-4 días, hasta que las células infectados de forma simulada estaban muertos. Se reunieron las células supervivientes
pBabePuro vector de expresión o pBabePuro:. CLPTM1L, clonado por PCR a partir pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), en los sitios EcoRI /SalI de pBABE-puro, se transfectaron en células H1299. células transfectadas se seleccionaron con puromicina hasta que las células transfectadas de manera simulada estaban muertos.
vector pSSFV Bcl-xL expresión (Addgene plásmido 8749) o el vector vacío se transfectaron en células con y sin desmontables de CLPTM1L como se describe anteriormente. Se seleccionaron las células transfectadas con geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Viabilidad Ensayo
Las células que expresan de forma estable shRNA vectores como se describe anteriormente fueron sembradas en placas de cultivo de 12 pocillos de tejido a densidades iguales de aproximadamente 50% por triplicado. Después de la unión durante la noche seguido de 48 horas de tratamiento con las concentraciones indicadas de cisplatino (Sigma, St. Louis, MO) disueltas en medios de comunicación, la camptotecina (Sigma, St. Louis. MO) disuelto en DMSO (Sigma, St. Louis, MO) o disolvente DMSO solo. concentraciones de DMSO en los medios de cultivo se mantuvieron consistentes y estaban en o por debajo de 0,08%. Las células se ensayaron con respecto a los números de células viables mediante tinción con azul de tripano y se contaron en un contador de células automatizado condesa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para los ensayos de camptotecina, la viabilidad celular se midió por Cell Titer 96 Aqueous Una célula de soluciones Ensayo de proliferación (MTS) en 24 placas de cultivo de tejido, así, por triplicado. P-valores se determinaron mediante la prueba t de Student de una cola.
Citometría de Flujo
Las líneas celulares indicadas fueron tratados durante 24 horas con las concentraciones indicadas de cisplatino en 10 cm placas de cultivo de tejidos. 10
6 células se lavaron y se suspendieron en PBS y se tiñeron con Anexina V-FITC. Las células en solución de tinción se diluyeron con 500 l de PBS y se analizaron en un Coulter citómetro de flujo.
caspasa 3/7 Ensayo
Las líneas celulares indicadas se sembraron a densidades de 5 × 10
4 células por pocillo de una placa de cultivo de tejido 12 pocillos y se trataron como se indica con agentes genotóxicos después de la fijación durante la noche. Caspasa 3 y 7 de la actividad se midió utilizando SensoLyte® Homogénea Rh110 caspasa - 3/7 Kit de ensayo (Anaspec, Fremont, CA):
Transferencia Western
Las líneas celulares indicadas fueron tratados con cisplatino a. las concentraciones indicadas en las placas de 6 pocillos durante 72 horas. Las células se lisaron con 100 l de inhibidores de proteinasa de tampón de lisis 1X NP40 que contienen, esquilada 10 veces con una aguja de calibre 28, se centrifugó a 16.000 × g durante 30 minutos, normalizada por la concentración de proteínas como se determina por el método de Bradford, y el sobrenadante se sometió a ebullición durante 10 min. 20 l de lisado normalizado se resolvió por SDS-PAGE y la inmunotransferencia se analizaron con anticuerpos indicados. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-conejo CLPTM1L (Sigma, St. Louis, MO), de conejo anti-beta tubulina (Sigma, St. Louis, MO), el clon 124 de ratón anti-Bcl2 (Dako, Carpinteria, CA), de conejo anti-Bax#2774 (Cell Signaling, Boston, MA), ratón anti-p53 (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), Bcl-xL - Bcl2l1 conejo (AbCam, Cambridge, MA). La cuantificación de los análisis occidentales de tres cultivos independientes se realizó utilizando el software Image J disponibles en línea de los NIH en http://rsbweb.nih.gov. P-valores determinados por la prueba t de Student de una cola.
Comet Assay
El método basado en la electroforesis en gel para la detección de daño en el ADN se llevó a cabo fue modificado a partir de oliva, et al.
Nature Protocols
1 23 - 29 (2006). Las células se trataron con las concentraciones indicadas de NNK, cisplatino o disolvente DMSO 0,1% durante 24 horas. Los portaobjetos se pre-recubrieron con bajo punto de fusión de agarosa (Sigma, St. Louis, MO) 1% en dH2O y se secan. Un ml de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en dH2O mantuvo a 40 ° C se añadió a 0,4 ml de una suspensión de 2 × 10
4 células /ml en medio frío. La mezcla de agarosa /células (1 ml /diapositiva) se extendió en las diapositivas pre-revestido.