Extracto
Objetivo
Para el perfil de expresión de ARN en el cáncer gástrico por subsitios anatómicas como un paso inicial en la identificación de los subtipos moleculares y proporcionar objetivos para la detección precoz y la terapia.
Métodos
Se realizó el análisis del transcriptoma mediante el U133A Affymetrix GeneChip en adenocarcinomas del cardias gástrico (n = 62) y noncardia gástrica adenocarcinomas (n = 72) y sus tejidos normales emparejados de pacientes en la provincia de Shanxi, y validado seleccionaron los genes desregulados con estudios adicionales de ARN. La expresión de los genes desregulados también se relacionó con la supervivencia de los casos.
Resultados
Análisis de Componentes Principales mostró que las muestras agrupadas por el tumor versus normal ubicación, anatómica y características histopatológicas. Pareadas pruebas t de tejidos tumorales /normales identificaron 511 genes cuya expresión fue desregulado (
P Hotel & lt; 4.7E-07 y al menos dos veces la diferencia en magnitud) en el cardias o cánceres gástricos noncardia, incluyendo casi una -la mitad (n = 239, 47%) dysregulated en tanto cardia y noncardia, un cuarto desregulada en cardia solamente (n = 128, 25%), y alrededor de un cuarto en noncardia solamente (n = 144, 28%). Estudios adicionales de ARN confirmados de perfiles de resultados. La expresión se asocia con una supervivencia caso de los 20 genes en el cardias y 36 genes en los cánceres gástricos noncardia.
Conclusiones
Los genes desregulados identificados aquí representan un punto de partida integral para los futuros esfuerzos para entender la heterogeneidad etiológica, el desarrollo de biomarcadores de diagnóstico para la detección temprana, y probar terapias molecularmente dirigidas para el cáncer gástrico
Visto:. Wang G, Hu N, Yang HH, Wang L, Su H, Wang C, et al. (2013) Comparación de la Expresión Génica Global de Cardia gástrico y cáncer noncardia de una población de alto riesgo en China. PLoS ONE 8 (5): e63826. doi: 10.1371 /journal.pone.0063826
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 3 Enero, 2013; Aceptado: 5 Abril 2013; Publicado: 22 May, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación está financiada por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer, la División de Epidemiología del Cáncer y Genética y el Centro para la Investigación del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Carol Giffen es empleado de Gestión de Servicios de Información, Inc. No hay patentes, productos o en el desarrollo de productos comercializados a declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Como resultado de su gran población y las altas tasas, China representa el 42% de todas las muertes por cáncer gástrico en el mundo cada año [1]. La provincia de Shanxi es una de las regiones con la mayor tasa de incidencia de cáncer gástrico en China [2], [3]. De hecho, el cáncer gástrico sigue siendo la causa principal de muerte por cáncer tanto en hombres (36%) y mujeres (28%) en esta región [4], a pesar de la disminución de la incidencia de este cáncer en el norte de China.
las tasas de cáncer gástrico en china son más altas en los factores de riesgo para el norte y tanto cardias gástrico y cáncer noncardia han sido previamente estudiado allí. El aumento de la edad, el sexo masculino, antecedentes familiares de cáncer del tracto gastrointestinal superior, la exposición al tabaco, y
Helicobacter pylori
sido todos factores de riesgo consistentes tanto para el adenocarcinoma gástrico cardias (GCA) y adenocardinoma noncardia gástrica (GNCA) [ ,,,0],5] - [13]; Además, la evidencia emergente apoya el aumento del riesgo de daño térmico de los alimentos calientes [6]. La dieta, particularmente micronutrientes, parecen desempeñar un importante papel protector, como lo demuestran los resultados de un gran ensayo controlado realizado en Linxian cuales demostraron una reducción de la ACG y la mortalidad GNCA de la combinación antioxidante del selenio, vitamina E al azar, y beta-caroteno [14 ], [15]; otros estudios nutricionales basadas en cuestionarios también apoyan el papel de la nutrición en la etiología del cáncer gástrico [6].
Los cánceres gástricos se clasifican histológicamente en difusa y tipos intestinales [16], tanto para cardias y noncardia. Anatómicamente, el cardias se encuentra entre el final del esófago y el cuerpo del estómago, y es una pequeña zona macroscópicamente indistinta inmediatamente distal a la unión gastro-esofágica. Se combina de manera distal en el fondo de ojo y se distingue únicamente por su patrón histológico
.
Además de ser anatómicamente adyacentes, ACG y el carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) tanto producirse a tasas epidémicas en esta población, compartir algo de riesgo etiológico factores, y antes de que el uso generalizado de la endoscopia y biopsia, se diagnosticaron como una sola enfermedad se refiere como "el cáncer de esófago" o "enfermedad de tragar duro" [17]. La capacidad para diagnosticar con precisión GCA y distinguirla de la CECA ha llevado a un aumento en la incidencia de cáncer gástrico en esta región [18]. La razón de las altas tasas de ACG y la CECA en esta área geográfica y su relación entre sí aún no está claro, pero hay casi seguro que las exposiciones ambientales etiológicamente importantes comunes, y un estudio de asociación del genoma reciente del ADN germinal encontraron un gen común (
PLCE1
) asociado con un riesgo tanto para la ACG y CECA [19].
adenocarcinomas gástricos son un grupo heterogéneo de tumores. GCA muestran biológico, epidemiológico y clínico-patológicas características que se asemejan más a los adenocarcinomas de esófago (EAC) que GNCAs, lo que sugiere que los tumores que surgen en el estómago pueden tener diferentes etiologías. Por ejemplo, varios estudios detectaron sustancialmente mayor
TP53
tasas de mutación en los casos con ACG de GNCA, mientras que el
TP53
espectro de mutaciones en la ACG se parecían más a EAC [20]. Un número de otras alteraciones genéticas se han reportado en el cáncer gástrico, incluyendo
CDH1
[21],
β-catenina
[22],
TFF1
[23], y
Met
[24], pero ningún estudio comparó estas alteraciones por subsitio anatómico. Además, aunque varios de expresión génica del cáncer gástrico perfiles de estudios han sido previamente informado [25] - [31]., Ninguno tiene casos GNCA directamente en comparación ACG y de una región geográfica de alto riesgo utilizando un protocolo común
El objetivo de este estudio fue identificar las diferencias genómicas entre cáncer gástrico por subtipos anatómicas para ayudar a nuestra comprensión de la etiología de estos dos tipos de cáncer distintos y facilitar el desarrollo de estrategias específicas adecuadas para la detección precoz, el pronóstico y el tratamiento.
Materiales Métodos y
1. Selección de los pacientes y el seguimiento
Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional del Hospital del Cáncer de Shanxi en China y el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) en los EE.UU.. Los pacientes ingresados en el Hospital del Cáncer de Shanxi entre 1998 y 2001 con un diagnóstico de ACG o GNCA y considerados candidatos para la resección quirúrgica curativa fueron identificados y reclutados para participar en el estudio. Ninguno de los pacientes tenía antes de la terapia, y Shanxi fue el hogar ancestral para todos. Después de obtener el consentimiento informado, los pacientes fueron entrevistados para obtener información sobre los factores de riesgo demográficos y de estilo de vida con cáncer y los datos clínicos y las muestras fueron obtenidas.
El cáncer gástrico aquí fue definido por la histología (sólo se incluyeron los adenocarcinomas) y sitios anatómicos se definieron como adenocarcinoma gástrico cardias (GCA) y el adenocarcinoma gástrico noncardia (GNCA). cánceres Cardia eran cánceres gástricos situados en las proximales tres centímetros de estómago (C16.0), mientras que los cánceres noncardia fueron aquellos en los que el resto del estómago (fondo de ojo, cuerpo, antro, píloro (C16.1-8), y la ubicación no especificado (C16.9) basado en códigos de sitio de la Clasificación Internacional de tumores malignos (séptima edición)) [32].
Entre 2005 y 2007, fueron re-estableció contacto con todos los pacientes (o sus familiares) de este estudio para determinar el estado vital. Para los que habían muerto, se determinaron la fecha y causa de muerte.
2. Muestra Colección
El tumor y los tejidos normales emparejados obtenidos durante la cirugía fueron instantánea congelada en nitrógeno líquido y se almacena a -130 grados C hasta su utilización. Los casos fueron seleccionados para este estudio en base a tres criterios: (i) el diagnóstico histológico de la ACG o GNCA confirmado por los patólogos, tanto en el Hospital del Cáncer de Shanxi y el Instituto Nacional del Cáncer; (Ii) muestras de tumor que eran al menos 50% de tumor; y (iii) la calidad del ARN de tejido /cantidad adecuada para la prueba.
3. Preparación de la muestra y Chip hibridación
ARN total fue extraído de tumor congelados y coincide tejidos normales usando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la purificación del ARN se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) y RNasa libre de DNasa Set digestión (Qiagen Inc, Valencia, CA). calidad y la cantidad de ARN se determinaron utilizando el RNA 6000 LabChip /Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Germantown, MD)
Microarray experimentos se realizaron con 8 g de ARN total.; detalles de la transcripción inversa, el etiquetado y la hibridación se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx; visitada 2013 May 14). En pocas palabras, los procedimientos incluyen síntesis de la primera cadena de ADNc, síntesis de la segunda cadena de ADNc, el ADNc de doble cadena limpiar,
in vitro
la transcripción, la purificación de ARNc, y la fragmentación. Veinte g biotinilado cRNA se utilizaron en cada hibridación matriz. Las muestras se hibridó en Affymetrix GeneChip Human Genome U133A virutas (Affymetrix, Santa Clara, CA). Después de la hibridación a 45 ° C durante la noche, las matrices se desarrollaron posteriormente con estreptavidina conjugada con ficoeritrina por la estación de fluidos (GeneChip Fluidics la estación 450, Santa Clara, CA) y se escanearon (GeneChip escáner 3000, Santa Clara, CA) para obtener niveles de expresión génica cuantitativa . tumor emparejados y muestras de tejido normales de cada paciente se procesan simultáneamente en todo el proceso experimental. La llamada actual promedio para las 124 fichas de los 62 pacientes con ACG fue 50,0%; de las 144 fichas de los 72 pacientes GNCA fue 51,5%.
4. Análisis estadístico
Hay 22283 sonda fija en el Affymetrix GeneChip Human Genome U133A (HG_U133A). El multiarray media (RMA) algoritmo robusto [33], [34] aplicado en Bioconductor en R (http://www.bioconductor.org; visitada 2013 14 de abril) se utiliza para la corrección de fondo y la normalización en todas las muestras. Todos los métodos estadísticos fueron desarrollados en el número de acceso R. El GEO para estos datos de la matriz es GSE29272.
Análisis de Componentes Principales (PCA) se utilizó para el análisis de la agregación de todas las muestras de cáncer gástrico aquí analizados. Para el PCA solamente, también se incluyeron datos de un estudio recientemente publicado expresión gama de CECA casos para la comparación [35].
Se aplicaron emparejado pruebas t para cada uno de los 22283 probesets para identificar los genes que son expresados diferencialmente entre los tumores y sus muestras normales de la misma, pero se presentan resultados sólo para los 21.130 probesets mapeado en el que 13.003 genes. Para tener en cuenta para comparaciones múltiples, se seleccionaron genes que mostraron diferencias significativas con
P
-valores de menos de 4.73E-07 (igual a 0,01 dividido por 21.130, es decir, un ajuste de Bonferroni conservador). Además de la
P
-valor de corte, los genes expresados diferencialmente debían cumplir por lo menos una diferencia de dos veces en la magnitud de la expresión génica entre los tejidos tumorales y normales (es decir, el cambio, ya sea ≥2 veces o ≤0.50) .
para identificar los genes desregulados cuya expresión se asocia con personales (sexo y antecedentes familiares de cáncer gastrointestinal superior o UGI) y características (el estadio del tumor, el grado, la metástasis de ganglios linfáticos) clínica, se realizó prueba t no pareada para las diferencias de expresión génica entre las muestras utilizando la relación de la expresión génica tumor dividido por la expresión del gen normal correspondiente. A
P
-valor umbral (
P
& lt; 0.005) se utilizó para la significación para estos análisis; no se aplicaron criterios de cambio veces.
Para evaluar la relación de la expresión génica para la supervivencia, Kaplan-Meier (KM) parcelas se utilizan para visualizar las diferencias de supervivencia por (por debajo de la mediana) la expresión génica de alto (por encima de la mediana) vs baja pruebas del estado y log-rank se utilizaron para probar las diferencias utilizando la señal probeset del tumor para cada gen expresado diferencialmente identificados en el análisis de la prueba t pareada tumoral /normal, se ha descrito anteriormente. Los genes cuya expresión fue significativamente relacionados con la supervivencia en log-rank pruebas fueron evaluados en modelos de riesgo proporcional de Cox para alta vs baja expresión con el ajuste de las características demográficas y clínicas de los tumores (por ejemplo, edad, sexo, estadio, grado, metástasis). Para todos los análisis de supervivencia, se utilizó una de dos caras
P-valor
. & Lt; 0,05 como nuestro umbral de significación estadística
5. Validación de los genes expresados diferencialmente Usando cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Se seleccionó un total de 21 genes expresados diferencialmente (12 de ACG y 9 de GNCA) para la validación cuantitativa utilizando en tiempo real de RT-PCR ( QRT-PCR). Para la validación técnica, los ensayos de QRT-PCR se realizaron usando el mismo tumor y ARN normales analizados en el experimento de microarrays para un subconjunto de los GCA (n = 41 de 62) y GNCAs (n = 50 de 72). Para la validación de replicación, tumor y ARN normales coincidentes de un nuevo conjunto de GNCAs (n = 44) fueron probados.
Primer capítulo cDNA fue sintetizado utilizando 3 g ARN total con oligo (dT)
12-18 (500 mg /ml) en una reacción de 20 l con el sistema de la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los productos de ADNc se diluyeron a continuación en 1:100. En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron usando un sistema ABI Prism 7000 de detección de secuencias (Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos los cebadores y sondas de siete genes diana y un gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa gen de control interno (
GAPDH
) se compraron de Applied Biosystems. reacciones QRT-PCR se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se describe anteriormente [36]. Las condiciones de ciclado térmico incluyen una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 95 ° C cada uno durante 15 segundos, 60 ° C durante un minuto, y 72 ° C durante un minuto. La expresión de genes se analizó utilizando 2
-ΔΔCT algoritmo.
: Resultados de la
1. Características de los pacientes
Un total de 62 ACG y 72 pacientes GNCA se analizó mediante el Affymetrix U133A. Los datos personales y clínicos de los pacientes estudiados se resumen en la Tabla 1 (Características clínicas de los casos individuales estudiados aquí se muestran en la Tabla S1). La edad media al diagnóstico fue de mediados y finales de los años 50, los machos predominaron, y aproximadamente una cuarta parte tenían una historia familiar de cáncer (UGI) gastrointestinal superior (es decir, cáncer esofágico o gástrico en primera, segunda o parientes de tercer grado). Por tanto ACG y GNCA, la mayoría de los casos estudiados fueron la etapa tardía, de alto grado, y los tumores de células de tipo intestinal con metástasis en los ganglios linfáticos. La mediana de supervivencia para los casos de ACG fue de 20,3 meses, y para los casos GNCA fue de 27,8 meses, sobre la base de un total de 50 muertes y 52, respectivamente.
2. Análisis de Componentes Principales de microarrays de expresión génica de datos
Se utilizó el Análisis de Componentes Principales (PCA) para obtener una comprensión de la expresión génica global de estas muestras. En este análisis, se evaluaron 124 muestras de 62 pacientes con ACG (cada uno con tumor y normal de pares) y 144 muestras de 72 pacientes GNCA (cada uno con tumor y normal de pares), así como 106 muestras de pacientes CECA (cada uno con tumor y normal de pares ) a partir de un estudio anterior [35]. PCA reveló dos grupos principales de muestras que separan todos los cánceres gástricos combinados (GCA en rojo, GNCA en azul) de la CECA (verde) en el eje de PC1 (Figura 1). Los dos grupos se dividen en los tejidos normales y tumorales por PC2 (tumor y normal se denotan por t y n, respectivamente). La diferencia entre GCA (rojo) y GNCA (azul) también fue notable, especialmente para los tejidos normales. a continuación, nos centramos en el análisis de cáncer gástrico. PCA de GCA (Figura 2) y GNCA (Figura 3) mostraron de nuevo la separación de las muestras en el tumor (T) y (n) grupos normales.
PCA reveló dos grupos principales de muestras que separan el cáncer gástrico (CC [ ,,,0],GCA] en rojo, N = 62; aC [GNCA] en azul, N = 72) de la CE [CECA] (verde, N = 53) en el eje PC1. PC2 divide en grupos de tumor (t) y las muestras (n) normales. (Nota sobre la comparabilidad de los resultados de la expresión: Los casos de la CECA, GCA, y GNCA fueron inscritos simultáneamente desde un solo hospital usando un protocolo común; se recogieron muestras, procesados, almacenados y transportados de manera idéntica, y los análisis de laboratorio se llevaron a cabo durante el mismo período de tiempo, en el mismo laboratorio, por el mismo personal técnico, usando la misma plataforma, y el mismo enfoque técnico.).
rojo "t" representa el tumor y verde "n" representa igualada el tejido normal.
rojo "t" representa el tumor y verde "n" representa igualó el tejido normal.
3. Identificación de Genes altura o hacia abajo-regulada en ACG y GNCA
En la ACG, se expresa de forma diferente un total de 367 genes entre los tumores y sus muestras normales emparejados. De estos genes, 199 genes fueron reguladas y 168 se redujeron regulado (Figura 4). Para GNCA, se expresaron con un total de 383 genes diferencialmente entre los tumores y las muestras no tumorales emparejados, incluyendo 192 genes regulados y 191 genes regulados abajo (Figura 4).
4. Comparación de la expresión génica en ACG y GNCA
Se han comparado los dos conjuntos de genes que mostraron diferencias significativas en la expresión génica de ACG y GNCA e identificaron 239 genes que se dysregulated en tanto ACG y GNCA, entre los cuales 113 fueron de hasta - 126 y las reguladas (Figura 4 y Tabla S2). Además, se encontró que 128 genes fueron dysregulated sólo en GCA (86 arriba y 42 abajo reguladas) (Figura 4 y Tabla S3), y 144 genes fueron dysregulated sólo en GNCA (79 arriba y 65 hacia abajo-regulado) ( Figura 4 y Tabla S4).
Entre los 113 genes regulados hasta en tanto ACG y GNCA se asocia con genes punto de control (por ejemplo,
CDC2, TOP2A
), la señalización de Wnt (por ejemplo, ,
SULF1
,
SFRP4, LEF1, LAMB1
), la adhesión (por ejemplo,
FN1
), y la vía de TGF-β (por ejemplo,
COL1A1
,
COL1A2
,
COL3A1
). Por el contrario, los 126 genes regulados comunes a ambos ACG y GNCA fueron enriquecidos en los procesos implicados en el metabolismo (por ejemplo,
AADAC
,
CA2
,
CA9
), la digestión (por ejemplo,
ATP4A, ATP4B
), y el desarrollo de tejido gastrointestinal (por ejemplo,
GIF
,
MUC5A
,
MUC6
,
TFF1
,
TFF2
) (Tabla S2). Estos resultados sugieren que la ACG y GNCA comparten muchas vías etiológicos comunes.
Los genes regulados hasta sólo en GCA estaban involucrados en la regulación del punto de control (por ejemplo,
CCNB1
,
CCNB2
,
CCNE1, CDC25B, SFN
), CXC quimiocinas (por ejemplo,
CXCL1
,
CXCL10
), y la matriz extracelular (por ejemplo,
MMP9, MMP11
); mientras que sólo GCA-reguladas por los genes estaban asociados con la desintoxicación (por ejemplo,
GPX3
) y oncogenes (por ejemplo,
FOS
,
junio
) (Tabla S3).
Entre los genes alterados significativamente en GNCA solamente, hasta los genes regulados incluidos los relacionados con la transición epitelio-mesenquimal transición (por ejemplo,
CALD1
,
IGFBP4
) y filamentos de actina ( por ejemplo,
DES, FLNA
). Por el contrario, reguladas por los genes funcionaban en la desintoxicación (por ejemplo,
CYP2C9
) y las superficies epiteliales (por ejemplo,
MUC1
) (Tabla S4).
5. Relación entre la expresión génica y el paciente /Características clínicas personales
En la ACG, se encontró que los genes expresados diferencialmente estar relacionado con antecedentes familiares de cáncer de UGI (Tabla S5a) y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla S5B), pero no otra características (es decir, el sexo, el estadio del tumor, el grado del tumor; datos no mostrados). Sesenta y siete genes fueron significativamente dysregulated (47 arriba y 20 hacia abajo-regulada) en pacientes con una historia familiar de cáncer de UGI (n = 16 casos) en comparación con los pacientes sin tales antecedentes (n = 46 casos), pero doblar cambios fueron en general pequeña: el mayor factor de cambio entre los genes regulados fue de 1,39 (es decir,
JDP1
), mientras que cuatro genes regulados (
LMO4
,
ABHD2, Lama3-
,
MAP17
) se redujeron en un tercio o más (Tabla S5a). Por las características clínicas, se identificaron 57 genes que fueron significativamente dysregulated (9 hacia arriba y 48 hacia abajo-regulada) en pacientes con ACG con ganglios linfáticos positivos (n = 50 casos) en comparación con los pacientes ganglios linfáticos negativos (n = 12 casos); 11 de estos genes (seis abajo y cinco hasta reguladas) alcanzó 1,5 veces el cambio (Tabla S5B).
Para GNCA, 37 genes tenían significativamente diferentes niveles de expresión en los antecedentes familiares positivos (n = 16) frente (n = 56) de los casos negativos (Tabla S6a), pero plegables cambios eran de menos de 1,5. Importantes genes expresados diferencialmente también fueron identificados por las características clínicas de varios tumores, incluyendo la etapa tardía (III /IV) frente a temprana (I /II) (n = 90 genes) y versus baja (1/2) de grado alto (3) ( n = 89 genes) (Tablas S6B y S6C). Metástasis en los ganglios linfáticos, el predictivo característica clínica más fuerte de la supervivencia, también se asoció con los niveles de expresión de 57 genes (Tabla S6D).
6. Expresión Génica y Survival
Se evaluó la relación de la expresión de ARN para la supervivencia de cada uno de los genes /probesets en el microarray. Para ACG, 20 genes se asociaron significativamente con la supervivencia (nominal
P-valor
& lt; 0,05) por medio de pruebas de rangos logarítmicos (Tabla 2). Un ejemplo ilustrativo de la curva de supervivencia de uno de estos genes (
MMP9)
se muestran en la Figura 5. Once genes siguieron siendo significativas tras un nuevo ajuste de las covariables en modelos de Cox. Análisis similares para GNCA mostraron que 36 genes estaban asociados significativamente con la supervivencia en las pruebas de log rank, incluyendo 27 que permaneció significativa después del ajuste de covarianza (Tabla 3); una curva de supervivencia para uno de los 36 (
ESRRG
) se muestran en la Figura 6.
líneas rojas
punteadas indican alta (por encima de la mediana) expresión y líneas azules discontinuas indican baja (por debajo de la mediana ) expresión.
discontinuas líneas rojas indican alta (por encima de la mediana) expresión y líneas azules discontinuas indican baja (por debajo de la mediana) expresión.
7. Validación de los genes expresados diferencialmente Usando cuantitativa en tiempo real RT-PCR
hemos realizado experimentos de validación técnica para 12 genes en 41 de los casos GCA 62 cuyas muestras todavía tenía suficiente cantidad de ARN después de la finalización del estudio matriz. Cuatro hasta reguladas (
Sulfi, CDC2, TOP2A, BUB1B) Opiniones y ocho abajo reguladas (
CA9, Cckbr, PIK3C2G
,
FOS, Jun, KLF4
,
KLK11, NUCB2
) los genes se analizaron utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR). Nuestros resultados muestran que los patrones de expresión génica fueron muy similares a los resultados del experimento ARN matriz (Tabla 4 y la Tabla S7).
Para GNCA, nueve genes expresados diferencialmente (cinco arriba y cuatro abajo-regulado) fueron seleccionados para la validación de QRT-PCR. Se evaluaron pares de muestras para 50 de 72 casos examinados en el chip de ARN para la replicación técnica y mostraron resultados similares a los de la matriz (Tabla 5 y la Tabla S8a). Además, las muestras normales /tumorales emparejado de una nueva serie de 44 casos GNCA se probaron para la validación de la replicación. Los resultados fueron consistentes con los de la matriz de datos de expresión (Tabla 5 y la Tabla S8b).
Discusión
GCA es uno de los pocos tumores malignos que ha aumentado considerablemente en los países desarrollados en los últimos años por razones que son todavía inexplicado, y los eventos moleculares que rodean este tipo de cáncer gástrico siguen siendo en gran medida desconocido [37], [38]. Para entender mejor los eventos moleculares en el cáncer gástrico y sus subtipos anatómicas, perfilamos la expresión génica en pacientes ACG y GNCA de una población de alto riesgo en China con alta densidad de microarrays de expresión de ARN. Se identificaron 511 genes cuya expresión se dysregulated en el cáncer gástrico en general, incluyendo casi una media (n = 239, 47%) dysregulated en tanto GCA y GNCA, un cuarto dysregulated en GCA solamente (n = 128, 25%), y alrededor de un cuarto en GNCA solamente (n = 144, 28%). Asociaciones con antecedentes familiares de cáncer de pista UGI en la susceptibilidad genética en la etiología, mientras que las asociaciones con las características clínicas y la supervivencia sugieren posibles dianas terapéuticas para una evaluación adicional.
Los genes regulados comunes identificados están involucrados en muchas vías relacionadas con la desarrollo de cáncer, incluyendo el ciclo celular, el crecimiento celular y la proliferación, control del ciclo celular, la remodelación de la matriz extracelular, y la angiogénesis (por ejemplo, Wnt de señalización del ciclo celular y las vías de puntos de control, tales como
SULF1, SFRP4, LEF1, TOP2A,
y
CDC2
[26], [26], [27], [39] - [41], y la vía de señalización de la integrina (
ARPC1B
,
COL1A1
,
COL4A1
,
FN1
, y
LAMB1))
. Algunos genes también están relacionados con la respuesta inmune adaptativa (por ejemplo,
CD14
) y la metástasis tumoral (por ejemplo,
CD9
). Los comunes genes regulados se encuentran en ACG y GNCA son consistentes con otros estudios sobre el cáncer gástrico mediante microarrays, como
AKR1B10
,
ALDH3A1
,
ATP4B
,
CA2
,
IGFBP2
,
KLF4
,
MUC5AC
,
MUC6
,
TFF1
, y
TFF2
[25], [29], [39]. Las reguladas por los genes en nuestro estudio son principalmente involucrados en las vías metabólicas, el desarrollo del sistema digestivo, o integridad de la mucosa. Se cree que varios genes que tienen funciones específicas en el epitelio gástrico, como
PGC
y
GIF
, lo que implica que la desdiferenciación es una característica común de la carcinogénesis [26].
BUB1B
es un gen de control de huso-ensamblaje. Un reciente informe de un caso con múltiples neoplasias gastrointestinales, incluyendo los adenocarcinomas gástricos, identificó una mutación intrónica homocigotos de la línea germinal en
BUB1B
, con bajos niveles de
BUB1B
ARNm y proteínas en los linfocitos y fibroblastos, lo que sugiere que
BUB1B
es un gen de susceptibilidad para este tumor [40]. En nuestro estudio
BUB1B
fue regulada hasta en tanto GCA (2,56 veces) y GNCA (2,11 veces), que es opuesta a la presentación de un caso citado, lo que sugiere que sería útil para investigar
BUB1B
estado de la mutación en nuestro ACG y pacientes GNCA.
Para los genes dysregulated de manera significativa en la ACG única, que tenga en cuenta un par de ejemplos interesantes aquí.
SOX9
mostró un cambio 2,13 veces en pacientes GCA pero ningún aumento significativo en los casos GNCA.
SOX9 gratis (situado en 17q24.3-q25.1) se cree que desempeñan un papel esencial en la determinación del sexo y marca la población de células precursoras durante el reemplazo celular fisiológica incluyendo el proceso de regeneración después de la lesión [41], [42 ]. La expresión de
SOX9
ha sido previamente informado en varios órganos, tales como el páncreas y el intestino [41], pero no estómago. Un estudio publicado recientemente encontró que "
Sox9
marca una población de células madre adultas putativa que contribuye a la auto-renovación y reparación del hígado, el páncreas exocrino y el intestino, tres órganos de origen endodérmico" [41].
COL2A
es un objetivo regulatorio candidato del
SOX9
[42]. En nuestros casos de ACG,
COL2A1
se redujo reguladas (doble cambio 0,27), lo que puede ser el resultado de
SOX9
regulación.
Algunos de los differentially- genes expresados reportados en la ACG también se dysregulated en un patrón similar al de carcinomas de células escamosas de esófago (CECA) examina desde esta misma población de alto riesgo, tales como
CDC25B
y
COL1A2
[43]. Esta similitud sugiere que a pesar de sus diferencias en el tipo de célula, ACG y la CECA de esta población de alto riesgo de China, probablemente comparten factores genéticos y /o ambientales comunes en su etiología. La evidencia de una influencia genética común es evidente por los resultados de un estudio de asociación del genoma reciente que encontró un locus de susceptibilidad compartida en
PLCE1
tanto para ACG y CECA [19].
Entre los genes desregulada significativamente en GNCA única,
DES
es el único que mostró una expresión diferente direccionalidad en GNCA (3,24 veces el cambio) que GCA (0,85 veces el cambio).
DES (desmina
en 2q35) codifica la desmina, una proteína del citoesqueleto muscular específica que se encuentra en los músculos lisos, cardíacos, y el corazón. Se identificaron varios genes asociados con los filamentos de actina, como
FLNA
,
ACTN1
,
SVIL
y
TPM1
. Varios genes dysregulated sólo en GNCA también estaban relacionados con la matriz extracelular, como
EMILIN1
y
TNC
. Los estudios sobre
TNC
indicado que la sobre regulación de
TNC
adhesión al sustrato de células rotas [44].
Otro propósito de este estudio fue investigar cómo los perfiles de expresión génica en el tumores diferían entre los pacientes con diferentes fenotipos clínicos. Aunque hemos identificado un gran número de asociaciones en nuestro
P designado
-valor umbral de 0,005, sólo tres permanecieron significativas después de la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (es decir,
P Hotel & lt; 2.36E-06 ). Las asociaciones más significativas fueron para
COL11A1
y
ITGAX
con el estadio tumoral en GNCA, y
UNG Chat con metástasis, también en GNCA.
COL11A1
[45] y
ITGAX
[46] tienen tanto sido previamente relacionadas con el estadio del tumor para otros tipos de cáncer (por ejemplo, el melanoma, el cáncer no microcítico de pulmón de células), pero no hay informes
UNG
y la metástasis.
Otro objetivo fue evaluar la supervivencia de la expresión génica para los genes que fueron significativamente mal regulada. Entre los 20 genes relacionados con la supervivencia ACG y los 36 genes relacionados con la supervivencia GNCA eran sólo tres genes que se superponen -
CTSB
,
LEPR
, y
LIPF
. Las asociaciones estadísticas más significativas observadas con la supervivencia (
P Hotel & lt; 0,01 en las pruebas de log-rank) fueron para
COL11A1, CTSB
, y
MMP9 Opiniones de ACG, y
ADA
,
ESRRG
, y
LHFP Opiniones de GNCA. Aunque aún no existen estudios han informado sobre
COL10A1
,
ADA
, o
LHFP
y la supervivencia del cáncer,
CTSB
[47] y
MMP9
[48] han sido asociados previamente con la supervivencia en el cáncer gástrico, mientras que
ESRRG
expresión se ha asociado con la supervivencia en el cáncer de próstata [49].
Conclusión
Este es el primer informe centrado en la expresión génica global en ACG y GNCA en una población de alto riesgo de Shanxi china.