Extracto
Las tirosina quinasas receptoras (RTK), en respuesta a sus ligandos del factor de crecimiento, fosforilan y activan las señales de aguas abajo importantes para el desarrollo fisiológico y la transformación patológica. El aumento de expresión, la activación de mutaciones y fusiones de reordenamiento de las RTK conducen a cáncer, la inflamación, el dolor, las enfermedades neurodegenerativas y otros trastornos. La activación o sobreexpresión de ALK, ROS1, TRK (A, B, y C), y RET se asocian con fenotipos oncogénicos de sus respectivos tejidos, lo que los objetivos terapéuticos atractivos. estudios cDNA array cáncer demostraron la sobre expresión de TRK-A y ROS1 en una variedad de tipos de cáncer, en comparación con sus respectivos controles de tejido normal. Hemos sintetizado una biblioteca de moléculas pequeñas que inhiben las RTK indicados anteriormente con picomolar a nanomolar potencia. La molécula de plomo GTX-186 inhibió RTK dependiente de células de cáncer y el crecimiento tumoral.
in vitro
y
in vivo
crecimiento de la tasa de mortalidad infantil-32 células de neuroblastoma TRK-A-dependiente y ROS1 que sobreexpresan las células NIH3T3 fueron inhibidas por GTX-186. GTX-186 también señales inhibidos inflamatorias mediadas por NFkB, AP-1, y TRK-A y potentemente reducida dermatitis atópica y la bolsa de aire la inflamación en ratones y ratas. Por otra parte, GTX-186 inhibe eficazmente la fosforilación ALK y el crecimiento de células de cáncer ALK-dependiente. En conjunto, el inhibidor de RTK GTX-186 tiene un perfil único quinasa con potencial para tratar el cáncer, la inflamación y el dolor neuropático
Visto:. Narayanan R, Yepuru M, CC Coss, Wu Z, Bauler MN, Barrett CM , et al. (2013) Descubrimiento y preclínicos sobre caracterización de nuevos moléculas pequeñas TRK y ROS1 Tirosina inhibidores de la quinasa para el tratamiento de cáncer y la inflamación. PLoS ONE 8 (12): e83380. doi: 10.1371 /journal.pone.0083380
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Octubre, 2013; Aceptado: 2 de noviembre de 2013; Publicado: December 26, 2013
Derechos de Autor © 2013 Narayanan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. RN, MI, CCC, ZW, MB, CMB, MLM, YW, JK, LS, YH, DDM, y JTD son empleados de GTX y tienen GTX opciones de alamcenaje. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El receptor tirosina quinasa (RTK) se compone de proteínas transmembrana que 58 regulan muchos funciones celulares incluyendo la proliferación, la migración y la progresión del ciclo celular [1]. El aumento de la expresión, la activación de mutaciones, reordenamientos de fusión, o co-activación de estos proto-oncogenes promover la transformación oncogénica de sus respectivos tejidos [2], [3]. Debido a su importancia funcional, las RTK se han desarrollado como dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer, la inflamación, el dolor, las enfermedades neurodegenerativas, y otros [4]. los esfuerzos de descubrimiento para desarrollar inhibidores de moléculas pequeñas o anticuerpos de las RTK se han incrementado de manera exponencial en los últimos 10-15 años. Desde el descubrimiento de BCR-Abl reordenamiento y su imatinib inhibidor, otros inhibidores de RTK, como crizotinib (inhibidor de ALK), afatinib (inhibidor de EGFR), y lenvatinib (inhibidor de VEGFR), han sido desarrollados para indicaciones oncológicas [5] - [7 ].
quinasa relacionada con tropomiosina
(TRK) es una familia de tres RTK (TRK-a, TRK-B, y TRK-C) que regulan varias vías de señalización que son importantes para la supervivencia y diferenciación de las neuronas [8 ], [9]. Además de su función crítica en las neuronas, que ellos y sus ligandos (factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF), y neurotrofinas, respectivamente) son importantes para el crecimiento celular no neuronal y la supervivencia. El aumento de expresión y la activación de TRK-A se observan en neuroblastoma, cáncer de mama, psoriasis, y el dolor neuropático, por nombrar algunas enfermedades que resultan de TRK-A disfunción [10] - [12]. Aunque fusiones oncogénicas de TRK-A no se han identificado hasta la fecha, su sobre-expresión es suficiente para aumentar la proliferación y la invasión de las células. Mientras que los anticuerpos de NGF se encuentran en ensayos clínicos para el dolor, K252a, el único inhibidor de molécula pequeña TRK-A en la clínica, se encuentra actualmente en proceso de evaluación para el tratamiento de la psoriasis [13], [14].
ROS1 es una proto-oncogén que pertenece a la misma rama filogenética como TRK-a [15]. A diferencia de TRK-A, la activación de ROS1 se produce normalmente cuando se fusiona con parejas de fusión oncogénicos tales como fundidos, en glioblastoma (FIG) y soluto familia de transportadores 34 miembro 2 (Slc34a2) [2], [16]. ROS1 se ha demostrado que se sobre-expresan en el glioblastoma, el colangiocarcinoma, cáncer de pulmón, y otros [17] - [19]. El aumento de expresión de ROS1 en varios tipos de cáncer ha impulsado el desarrollo de inhibidores selectivos. Crizotinib, desarrollado para el cáncer de pulmón ALK positivo, también inhibe ROS1 y está en un ensayo clínico para el cáncer de pulmón positivo ROS1-.
La presión selectiva aplicada por los resultados continuos de inhibición RTK en la aparición de diferentes poblaciones clonales de cáncer células con resistencia adquirida y la proliferación a menudo acelerado [20], [21]. mecanismos de escape utilizados por las células de cáncer para superar la inhibición RTK incluyen mutaciones, fusión oncogénica, y la activación de quinasas secundarias y vías de señalización. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores de RTK segunda y tercera generación es imprescindible para el tratamiento de los fenotipos resistentes que surgirán inevitablemente de la terapia de primera generación. El desarrollo de inhibidores con distintas farmacóforos y perfiles inhibidores de quinasa únicas proporcionará estrategias alternativas necesarias para superar la resistencia.
Hay algunos estudios que muestran ROS1 o TRK-A sobreexpresión en cáncer, pero la expresión individual o combinada de ROS1 y TRK- a en una amplia gama de tipos de cáncer fue hasta ahora mal caracterizado. El uso de 381 muestras de cDNA a partir de 22 cánceres, se demuestra sobre expresión de TRK-A y ROS1 en los cánceres que no se han descrito previamente. TRK-A está sobre-expresa en 100% de la feocromocitoma y la mayoría de otras muestras de cáncer analizadas. GTX-186, un nuevo inhibidor de RTK con el perfil inhibidor de quinasa único, inhibe la familia TRK, quinasas ROS1, ALK, y RET en picomolar a nanomolar baja IC
50 valores. GTX-186 de cáncer de manera eficiente inhibidos impulsados por TRK-A y la expresión ROS1 y también fue excepcional en la superación de enfermedades inflamatorias tales como dermatitis.
in vitro
estudios demostraron que GTX-186 también inhibe el dolor neuropático señalización mediada por TRK-A ligando, NGF, haciendo GTX-186 una herramienta valiosa en el arsenal para combatir el cáncer, la inflamación y el dolor.
Materiales y Métodos
Reactivos
Todos los anticuerpos fueron adquiridos de Señalización celular (Danvers, MA). reactivos de PCR en tiempo real y los cebadores y sondas TaqMan se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). se obtuvo la matriz-2 citoquinas rata de Ray Biotech (Norcross, GA). Cáncer de cDNA array encuesta (CSRT 103) era de Origene (Rockville, MD). recombinantes humanos NGF fue 2,5 s de Millipore (Billerica, MA) y dexametasona se obtuvo de LKT Labs (St. Paul, MN). Tumorales α del factor de necrosis (TNF-a) y lipopolisacárido (LPS) se adquirieron de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN). aceite de Croton, carragenano, y acetato de forbol miristato (PMA) se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). La indometacina fue de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). TNF-kit ELISA se adquirió de Thermo Scientific (Norcross, GA). GTX-186 (S-isómero) y crizotinib (racemato) se sintetizaron por los químicos GTx y se caracterizaron por técnicas analíticas estándar. Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
quinasa Ensayo de actividad
Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO al 100% en un intervalo de concentraciones de 10
-8-10
-3 M, después se diluyó con ensayo de quinasa Buffer (HEPES 50 mM, pH 7,5, EGTA 1 mM, MgCl 10 mM
2, 0,01% de Tween-20, y 2 mM de DTT, agregó fresco) a 4X la concentración final. La curva final incluyó a 11 concentraciones (10
-11 a la 10
-5 M). concentraciones quinasa (Invitrogen) y ATP (Sigma) necesarias para la actividad óptima fueron determinados en experimentos separados (Tabla S1). La concentración de quinasa que dio lugar a una actividad máxima y la concentración de ATP que mostró 50% de estimulación máxima (EC
50) fueron elegidos para experimentos de inhibidor de la enzima.
Quinasa ensayos se realizaron en un volumen final de 10 l en placas de 384 pocillos, con 2,5 l de compuesto de ensayo por triplicado a cada concentración, 2,5 l de quinasa, y 5 l de ATP y sustrato peptídico (LANCE®
Ultra sobre U
luz
™ poli-GT, PerkinElmer) mezcla. Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente (RT), en la oscuridad, durante 30-120 min. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron con la adición de EDTA 40 mM en tampón 1X LANCE® (PerkinElmer) (5 l), y se incubaron a TA durante 5 min. LANCE® Eu-W1024 anti-fosfotirosina PT66 anticuerpo (5 l) en tampón 1X LANCE® se añadió a los pocillos a una concentración final de 1,25 nM y se incubó durante 1 h a TA. La cantidad relativa de sustrato fosforilado se midió con VICTOR ™ Multilabel lector de placas usando el protocolo LANCE ™ para la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo. La concentración de compuesto de ensayo requerida para reducir la señal de fluorescencia (665 nm) en un 50% (IC
50) de valor, se determinó por regresión no lineal con Sigma Plot® y los cuatro parámetro de curva logística estándar.
Cell Cultura y
IMR-32 y NIH3T3 se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas. Las líneas celulares autenticados por el proveedor se cultivaron durante menos de 6 meses después de la reanimación en el laboratorio. Para el factor de crecimiento inducido por los experimentos de expresión génica, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 10.000 células por pocillo en medio suplementado con FBS 1% tratado con carbón vegetal (csFBS). Las células se mantuvieron en 1% csFBS durante 3 días para reducir la transcripción basal con medio cambió el día 1 y antes del tratamiento en el día 3. chapado de la célula y condiciones de crecimiento para todos los otros experimentos son como se describe en las leyendas de las figuras.
La línea de linfoma T-937 (ATCC Manassas VA) y las grandes líneas de linfoma anaplásico de células SUDHL-1 y K-299 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal 10% y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina. células Kelly (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se hicieron crecer en medio RPMI-1640 y 10% de FBS.
BaF
3 células se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 10 ng /l de interleucina-3 (amp I +; D Systems Minneapolis, MN) y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina. BaF
3 líneas celulares estables se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina, y solución de sulfato /ml G418 500 mg (Mediatech).
Clonación y Estable Línea celular Creación
Todas las construcciones de plásmidos se secuenciaron para asegurar la fidelidad. FIG-ROS1 (S) [17], sintetizado por Genscript (Piscataway, NJ), se clonó en pCMV6 vector y luego sub-clonó en el vector U6 plenti Pgk-puro. líneas celulares NIH3T3 estables se generaron por la infección lentiviral de plenti U6 Pgk-puro-FIG-ROS1 (S) como se describe anteriormente [22]. La fusión NPM-ALK se obtuvo a partir de cDNA amplificado a partir de células K299 y se clonó en pCR3.1 (Life Technologies Carlsbad, CA) con EcoRI. EML-4ALK fue sintetizado por Genscript de secuencia de referencia que representa el AB274722 E13: A20 de fusión y también se clonó en pCR3.1 con EcoRI. Insertar la orientación y la fidelidad se confirmaron por secuenciación de ADN.
Aislamiento de ARN y la expresión génica
RNA se aisló usando el kit Cells-to-Ct y en tiempo real PCR se realizó usando cebadores y sondas TaqMan en el ABI 7900 (Life Technologies). serie de experimentos de ADNc se llevaron a cabo utilizando los cebadores y sondas TaqMan en la máquina PCR ABI 7900.
Western Blotting
Las células fueron cultivadas y tratadas como se describe en las leyendas de las figuras. Los extractos de proteína se prepararon y los extractos se realizaron utilizando un SDS-PAGE en un gel de gradiente de 4-20% y a inmunotransferencia para las proteínas indicadas.
Ensayo de crecimiento y ciclo celular Análisis
Las células adherentes se colocan en placas a 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio respectivo. Las células se trataron como se indica en las figuras y la viabilidad celular se midió utilizando sulforrodamina B reactivo (SRB) y la densidad óptica medida a 535 nm. Para el análisis del ciclo celular, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron para los puntos de tiempo indicados. Las células se fijaron, se tiñeron con yoduro de propidio, y su distribución en las diferentes fases del ciclo celular se evaluó mediante citometría de flujo.
Migración de ensayo
Migración de ensayo se realizó utilizando el kit de ensayo de migración ornitorrinco (Fisher Scientific) . Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y los insertos se eliminaron 24 horas después de la siembra. Las células se trataron como se indica en las figuras y la imagen 12 horas después del tratamiento.
citoquinas de matriz
arrays de citocinas se obtuvieron de Ray Biotech (Norcross, GA) y las matrices se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las matrices se incubaron durante la noche con un volumen igual de los exudados de la bolsa de aire, se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios antes de desarrollar usando quimioluminiscencia potenciada.
fueron tratados Cuantificación
células de ELISA ALK p-K-299 con crizotinib o GTX-186 durante seis horas. Los lisados celulares se aislaron y la proteína se extrajo usando Tampón de Lisis Celular (Cell Signaling) que contiene inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche Diagnostics), PMSF (Sigma Aldrich), y Cóctel fosfatasa inhibidores (Sigma Aldrich). p-ALK ELISA (Cell Signaling Technology Beverly, MA) se realizaron en lisados celulares de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando 0,01 g /l de proteína.
Experimentos con Animales
Todos los animales protocolos fueron aprobados por la Universidad de Tennessee Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Los ratones y las ratas obtenidas de Harlan (Indianapolis, IN) fueron alojados con cinco o tres animales por jaula, respectivamente, y se les permitió el libre acceso a agua y comida para roedores comercial (Harlan Teklad 22/5 roedores dieta - 8640). Durante el curso del estudio, los animales se mantuvieron en un 12 h de luz: oscuridad ciclo
Los experimentos de xenoinjertos tumorales
experimentos se llevaron a cabo de xenoinjertos en ratones desnudos como se describe anteriormente [23].. En pocas palabras, una mezcla de células en suspensión en 0,0375 ml de RPMI + 10% de FBS y 0,0625 ml de Matrigel se inyectaron s.c. en el flanco izquierdo posterior de cada ratón. Una vez que el volumen del tumor alcanzó 100-200 mm
3, los animales fueron asignados al azar y tratados (GTX-186 se disolvió en 81% de PEG-300 + 18% de agua desionizada estéril doble + 0,6% de ácido clorhídrico 12 N; crizotinib se disolvió en 10% de DMSO + 90% de PEG-300) como se indica en las figuras. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron como se indica en las figuras. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula de longitud * ancho * ancho * 0,5236.
inducida por aceite de crotón Dermatitis
C57BL /6 ratones fueron tratados dos veces en 16 horas y 2 horas antes de la aplicación de acetona o aceite de crotón (20 l de aceite de crotón al 10% en acetona en cada oído interno) [24]. Seis horas después de la aplicación del aceite de crotón, los animales fueron sacrificados, y los punzones de oreja se pesaron y se almacenan en el ARN más tarde para el aislamiento de ARN.
Aire Modelo inflamación de la bolsa
Se inyectó aire en los flancos de Sprague Dawley ratas cuatro días (20 mL) y dos días (10 ml) antes de la inyección de carragenina (1 ml de 2% de carragenina) en la bolsa [25]. , Los animales se sacrificaron seis horas después de la administración de carragenina, 5 ml de solución salina se inyectaron en la bolsa, se recogieron los exudados de la bolsa y el número de leucocitos y macrófagos infiltrados en la bolsa se contaron bajo un microscopio.
Se realizaron análisis estadísticos usando el software GraphPad Prism.
resultados
TRK-a y ROS1 se sobreexpresado en cánceres múltiples
estudios aislados han identificado la sobreexpresión de cualquiera de TRK-a o ROS1 en neuroblastoma [26], cáncer de pulmón [2], glioblastoma [16], y colangiocarcinoma [17]. Dado que estas dos quinasas son proto-oncogenes, especuló que la información sobre la expresión combinada podría ayudar a predecir aditivo o sinérgico crecimiento del cáncer respectiva. Para determinar el TRK-A y patrón de expresión ROS1, arrays de cDNA de escaneo de tejido que contiene 381 muestras de cDNA a partir de 22 tipos de cáncer y tejidos normales adyacentes fueron utilizados (Figura 1). Los cánceres de adrenal (7/10 muestras de cáncer expresan TRK-A), páncreas (5/17 TRK-A), ovario (7/20 TRK-A), el esófago (9/20 TRK-A y ROS1), la vejiga urinaria ( 6/22 TRK-a), y el endometrio (9/17 ROS1) expresan mayores niveles de TRK-a y /o ROS1, en comparación con las muestras normales correspondientes. Curiosamente, 100% de la feocromocitoma, un cáncer adrenal neuro-endocrino con origen en el sistema nervioso simpático, las muestras sobre-expresó TRK-A entre 50 a 1.000 veces, en comparación a los tejidos suprarrenales normales. Informes anteriores han demostrado que la línea celular de feocromocitoma, PC12, expresó el más alto nivel de TRK-A entre numerosos
in vitro
sistemas celulares examinadas, lo que corrobora estos resultados [27]. Las muestras de los cánceres de la vejiga urinaria (3 muestras) y el esófago (4 muestras) expresaron tanto TRK-A y ROS1, lo que podría dar lugar a la proliferación de aditivo o sinérgico. Los cánceres de próstata, mama y otros fracasaron para expresar niveles detectables de ninguna de las quinasas. Dado que estos resultados son de un pequeño subconjunto de las muestras, que tienen que ser validados con muestras adicionales.
Expresión de TRK-A y ROS1 se cuantificó por PCR en tiempo real en los ADNc a partir de 381 muestras de 22 diferentes tipos de cáncer y normales correspondientes tejidos. TRK-A y la expresión ROS1 se normalizaron a la actina y representan como veces de diferencia a partir de muestras no cancerosas normales, utilizando el método DDCT. Promedio de las muestras normales fue tomada para el cálculo DDCT. cáncer Ad.C-suprarrenal; Normal-cDNA a partir de tejidos no cancerosos. Las cifras debajo de las muestras indican las muestras normales.
Caracterización in vitro de la GTX-186
GTx186 es una imidazo [4,5-f] isoindol derivado relacionado con la novela anteriormente descrito RTKI GTX -134 [28]. Para aprovechar la oncología, inflamatoria, y los roles nociceptivas de TRK-A y tirosina quinasas ROS1, hemos construido una biblioteca de moléculas pequeñas que inhibe selectivamente las quinasas en la rama filogenética que contiene TRK-A y ROS1. GTX-186 inhibe selectivamente TRK-A, TRK-B, TRK-C, ROS1, ALK, y la fosforilación mediada por RET-IC con valores
50 en la picomolar a nanomolar gama baja (Tabla 1). Por otro lado, GTX-186 inhibió IGF-1R y la fosforilación de EGFR mediada a concentraciones mucho más altas (más de 100 a 1000 nM), lo que indica su selectividad hacia sólo un subconjunto de las quinasas. Desde ALK y expresión RET en los tejidos normales son mínimos y los animales knockout tienen fenotipos sin importancia [29], [30], la reactividad cruzada con estas dos quinasas son de pequeña preocupación que permite GTX-186 para el tratamiento de enfermedades TRK-A y ROS1-dependientes, con mínimo riesgo de efectos no deseados.
GTX-186 inhibe TRK-A-dependiente IMR-32 Neuroblastoma celular y el crecimiento de xenoinjerto
Dado que las células de neuroblastoma IMR-32 expresan isoformas TRK y dependen en TRK-a para su crecimiento [31], hemos utilizado esta línea como un modelo para estudiar los efectos de la GTX-186 sobre TRK-a fosforilación y crecimiento, tanto
in vitro
y
in vivo
. El altamente potente GTX-186 inhibe la fosforilación inducida por NGF de p42 /44 MAPK, una quinasa aguas abajo de TRK-A que media la proliferación y la inflamación en respuesta a NGF [32], a una concentración tan baja como 10 nM (Figura 2A). Por otra parte, a 10 veces menos potente análogo inhibe p42 /44 MAPK fosforilación inducida por NGF sólo a una concentración mayor que 100 nM. Posteriormente, IMR-32 células fueron tratadas con concentraciones crecientes de GTX-186 para determinar el efecto sobre el crecimiento celular después de 72 horas. Como se muestra en la Figura 2B, GTX-186 dependiente de la dosis inhibieron el crecimiento de células IMR-32 con una CI
50 valor de aproximadamente 100 nM. GTX-186 también la migración dependiente de NGF completamente inhibido de células IMR-32 (Figura 2C), indicando que la inhibición de TRK-A es a la vez anti-proliferativa y anti-invasivo. En condiciones idénticas, GTX-186 no tuvo efecto sobre el crecimiento de células SH-SY5Y, una línea celular de neuroblastoma que carecen de TRK-A [26].
A. GTX-186 inhibe ERK inducida por NGF (/44 MAPK p42) fosforilación. IMR-32 células de neuroblastoma fueron suero de hambre durante 2 días, pre-tratada durante 2 horas con las concentraciones indicadas de GTX-186 y se trató con 200 ng de NGF /ml durante 30 min. Se recogieron las células y Western blot realizaron para fosfo-ERK y Total-ERK. B. GTX-186 inhibe la proliferación de células IMR-32. IMR-32 células se sembraron en medio de crecimiento y se trataron con la concentración indicada de GTX-186 durante 3 días. Las células se fijaron y se tiñeron con sulforrodamina B (SRB) y la densidad óptica (DO) se midió a 535 nm. C. GTX-186 inhibe la migración de células IMR-32. IMR-32 células se sembraron en una placa de ensayo de migración platypus y se trataron con vehículo, NGF, o una combinación de NGF y GTX-186. Las imágenes fueron capturadas bajo microscopio de luz de 12 horas después del tratamiento. D-G. GTX-186 inhibe IMR-32 crecimiento neuroblastoma xenoinjerto. IMR-32 células se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos (10 millones de células /ratón). Una vez que los tumores alcanzaron 100 a 200 mm
3, los animales (n = 8) fueron asignados al azar y se trataron diariamente con vehículo o 20 mg /kg /día i.v. GTX-186. El volumen del tumor (D) y el peso corporal (F) se midieron cada día durante 4 días. Los animales fueron sacrificados, los tumores pesados (E), almacenados en formalina, y procesados para TUNEL inmunohistoquímica (G-Número de células TUNEL positivas (panel izquierdo) y la intensidad de la tinción de TUNEL (panel derecho)). Los valores se expresan como media ± S.E. Factor de crecimiento del nervio NGF-; Las barras abiertas son las barras tratadas con vehículo y llena son muestras tratadas con GTX-186. * -statistically Significativas a p & lt; 0,05; ** - Estadísticamente significativas a p & lt; 0,01
Para demostrar que los efectos antiproliferativos de GTX-186 son reproducibles
in vivo
en un modelo de xenoinjerto de tumor, IMR-32. las células se implantaron en ratones desnudos portadores de tumores y los animales se trataron con vehículo o GTX-186 por vía intravenosa. Debido a la rápida proliferación y la naturaleza altamente invasiva de células IMR-32, los tumores crecieron de 200 mm
3 a 2000 mm
3 plazo de 4 días. GTX-186 reduce con eficacia y de manera significativa el crecimiento del tumor (Figura 2D) a partir de día 1 hasta el final del estudio, lo que resulta en la inhibición del crecimiento del tumor mayor que 80%. Estos efectos se suscitó, sin efectos tóxicos visibles, incluyendo cualquier cambio en el peso corporal (Figura 2F). GTX-186 también redujo significativamente el peso del tumor (Figura 2E) en más de un 50% en comparación con animales tratados con vehículo. Con el fin de determinar el mecanismo de este efecto anti-tumor, los tejidos tumorales fijados con formalina se tiñeron inmunohistoquímicamente para TUNEL y se evaluaron el número de células TUNEL positivas y la intensidad de la tinción de TUNEL. GTX-186 aumento de la apoptosis de las células tumorales por más de dos veces en comparación con animales tratados con vehículo como se muestra por tanto el número de células TUNEL positivas y la intensidad de la tinción de TUNEL-(Figura 2G). Estos efectos fueron provocados con una concentración en estado estacionario de aproximadamente 50 nM GTX-186, que es comparable a
in vitro
IC
50 valores.
Efectos GTX-186 provoca Anti-inflamatorios in vitro
TRK-a y su ligando NGF son mediadores de enfermedades inflamatorias tales como dermatitis, psoriasis y artritis. NGF se expresa en los macrófagos y
in vitro
, NGF induce la síntesis de TNF-α y sinergia con interferón-γ para aumentar la expresión de citoquinas inflamatorias [33]. Estos efectos pueden ser revertidos por los inhibidores de TRK-A. Además, NGF y TRK-A han sido implicados en una variedad de condiciones inflamatorias y alérgicas, incluyendo asma y polimorfonucleares quimiotaxis de los leucocitos [34]. Para comprender el efecto de GTX-186 sobre la inflamación inducida por diversas citocinas y factores de crecimiento, las células PC12 fueron pre-tratados con GTX-186 o dexametasona y posteriormente tratadas con PMA o NGF para inducir la expresión de citoquinas inflamatorias. Mientras GTX-186 inhibe eficazmente la expresión de MMP-3, una metaloproteinasa de matriz, inducida tanto por PMA y NGF, dexametasona inhibió la expresión de MMP-3 inducida por PMA solamente, pero no por NGF (Figura 3A). Esto demuestra que NGF y PMA median la inflamación a través de vías distintas, y glucocorticoides, tales como dexametasona, sólo son eficaces en la inflamación no mediada por NGF. Para determinar los efectos más amplios antiinflamatorios de la GTX-186, en su caso, IMR 32 células (Figura 3B), queratinocitos humanos normales (NHEK; Figura 3C), macrófagos LADMAC (Figura 3D), y RAW 264,7 macrófagos de ratón (Figura 3E) fueron pre-tratados con GTX-186, y citoquinas inflamatorias fueron inducidos por NGF, TNF-α, o LPS. GTX-186 inhibe eficazmente importantes mediadores de la inflamación tales como cFos, IL-8, IL-1β y con una potencia comparable a sus efectos sobre la actividad quinasa.
Las células fueron suero de hambre durante 2 días, pre-tratadas con las concentraciones indicadas de GTX-186 durante 30 minutos y se trató con factores de crecimiento o citoquinas durante 12-16 horas. Se extrajo el RNA, cDNA sintetizado, y la expresión de genes inflamatorios se midieron por PCR en tiempo real usando el cebador Taqman y las sondas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Los valores se expresan como media ± S.E. Dex-dexametasona; PMA-miristato acetato de forbol; Factor de crecimiento del nervio NGF-; Factor de Necrosis TNF-α-Tumor; LPS-lipopolisacárido; MMP 3-Matrix Metalloproeinase 3; IL-8-interleucina 8; células PC-12-Feocromocitoma; Las células IMR-32-Neuroblastoma; NHEK-queratinocitos epidérmicos humanos normales; LADMAC y macrófagos /monocitos; RAW 264.7 de ratón-macrófagos.
GTX-186 inhibe inducida por aceite de crotón Dermatitis Atópica en ratones
Desde TRK-A ha sido implicado en la psoriasis [12] y dermatitis [ ,,,0],35] y GTX-186 inhibe la IL-8, una de las citoquinas críticos que median la inflamación dérmica [36] (Figura 3C), se evaluó GTX-186 en un modelo de aceite de crotón de la dermatitis atópica. aceite de Croton aumenta eritema, peso de las orejas, y la fuga vascular, un fenotipo similar a la dermatitis atópica [37]. La aplicación de aceite de crotón aumentó edema y el peso de las orejas, que fueron dosis dependiente reducido por GTX-186 (Figura 4A). ARN de golpes del oído se aislaron y la expresión de varios genes en las vías inflamatorias se midió (Figura 4B). aceite de crotón aumentó la expresión de todos los genes de la ruta inflamatorias medidos, incluyendo NGF, que estuvo marcadamente inhibida por GTX-186 y dexametasona.
A. C57BL /6 ratones (20-25 g; n = 3) se les administró dos veces con la dosis indicada de GTX-186 (sc) o dexametasona (sc), 16 horas y 2 horas, antes de la aplicación de aceite de croton (20 l de 10 aceite de crotón% en acetona en cada oído interno). Seis horas después de la aplicación del aceite de crotón, los animales fueron sacrificados, punzones de oreja se pesaron y se almacenaron para el aislamiento de ARN. * Indica la significación de P & lt; 0,05 en acetona aplicado animales tratados con vehículo.#Indica la significación de P & lt; 0,05 a partir de aceite de crotón aplica animales tratados con vehículo. B. Se aisló ARN de punzones de oreja de los animales en el panel A y la expresión de genes indicados se midieron por PCR en tiempo real y se normalizó a GAPDH utilizando cebadores TaqMan y sondas. Los valores se expresan como media ± S.E. Dex-dexametasona; 186-GTX-186; Factor de crecimiento del nervio NGF-; IL-interleucina; ligando de quimiocina CCL-; MMP-metaloproteinasas de la matriz; MCSF y macrófagos factor estimulante de colonias.
GTX-186 inhibe la inflamación inducida por carragenina en rata Aire bolsa Modelo
NGF
son clínicamente con éxito en el tratamiento de dolor de artritis [38]. Sin embargo, no se evaluó el potencial para tratar la inflamación sistémica, en relación con el dolor. Desde GTX-186 inhibe citoquinas inflamatorias en una variedad de líneas de células, incluyendo macrófagos, hemos probado GTX-186 en la inflamación sistémica inducida por carragenina usando un modelo de bolsa de aire. El modelo de bolsa de aire es fisiológicamente y mecánicamente comparable a la artritis, y por lo tanto se utilizó este modelo para evaluar GTX-186 [25], [39]. La administración de carragenina aumentó de leucocitos y la infiltración de macrófagos en la bolsa de aire, en comparación con los animales tratados con solución salina (Figuras 5A y 5B). Subcutánea e intra-bolsa de administración de GTX-186 redujo significativamente la infiltración de macrófagos y leucocitos. administración intra-bolsa de GTX-186 provocó una respuesta mejor que la administración subcutánea, lo que indica una correlación positiva entre la exposición al fármaco en el sitio de la inflamación y los efectos anti-inflamatorios.
A-C. Una bolsa fue creado por vía subcutánea en un flanco de ratas (n = 3) mediante la inyección de 20 ml de aire cuatro días antes y 10 ml de aire de dos días antes del tratamiento. GTX-186 (sc en el panel A y dentro de la bolsa o sc en el panel B; 40 mg /kg), dexametasona (30 mg /kg sc), o indometacina (30 mg /kg sc) se administraron tres veces, 48 hrs, 24 hrs, y 1 hr, antes de la administración de carragenina (1 ml de 2%). Seis horas después de la administración de carragenina, se sacrificaron los animales, 5 ml de solución salina se inyectó en la bolsa para vaciar el fluido de la bolsa y el número de leucocitos y macrófagos infiltrados en la bolsa se contaron bajo un microscopio. TNF-α se midió usando un ELISA en los exudados de la bolsa del experimento en el panel B. (C). D. Efecto de la GTX-186 en las citoquinas inflamatorias en la inflamación de la bolsa de aire inducido por carragenina se midió en los exudados de la bolsa mediante una matriz de citoquinas. principales citoquinas fueron cuantificados y expresados como gráficos de barras a la derecha. Los valores se expresan como media ± S.E. de n = 3. 186-GTX-186; Indom-indometacina; Dex-dexametasona; Factor de necrosis tumoral TNF-; IL-interleucina; CINC-inducida por citoquinas de neutrófilos-proteína quimiotáctica.
exudados de bolsa de aire se sometieron a la matriz de citocinas para determinar el efecto de GTX-186 y la indometacina en la expresión de la proteína citoquina mundial (Figura 5D y Tabla S2) . Curiosamente, GTX-186 y la indometacina difirieron en sus efectos para inhibir citoquinas. Mientras tanto GTX-186 y la indometacina inhiben inducido por carragenina TNF-α, IL-1β, fractalquina, IL-13, y la leptina, solamente GTX-186 inhibió CINC-1, CINC-2, IL-6, y LIX. Por otra parte, ni GTX-186 ni indometacina inhibe inducido por carragenina CINC-3, TIMP-1, PDGFa, MMP-8, y MCP-1, lo que indica que estas citoquinas pueden no ser mediadores importantes de la inflamación en el modelo de bolsa de aire .
TNF-α es un mediador importante de la inflamación en la inflamación aguda inducida por carragenina en modelos sinoviales bolsa de aire. los niveles locales de TNF-α se correlacionaron con la hinchazón y la extensión de la inflamación, que se invierte por un anticuerpo anti-TNF-α [25]. crizotinib.