Extracto
Las diatomeas son una clase importante de algas unicelulares que producen aldehídos poliinsaturados bioactivos (PUA) que inducen abortos o malformaciones en la descendencia de los invertebrados expuestos a ellos durante la gestación. A continuación se comparan los efectos de la PUA 2 a
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, 4 a
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-decadienal (DD), 2-
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, 4 a
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-octadienal (OD) y 2-
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, 4 a
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-heptadienal (HD) en el A549 líneas de células de adenocarcinoma de pulmón y colon COLO 205, y el pulmón normal /almuerzo epitelial BEAS-2B línea celular. Usando el MTT viabilidad /ensayos de azul de tripano, se muestra que aplicaciones no deseadas, tienen un efecto tóxico sobre las células tumorales COLO 205 A549 y pero no las células normales BEAS-2B. DD era el más fuerte de las tres aplicaciones no deseadas probados, en todos los intervalos de tiempo considerados, pero HD fue tan fuerte como DD después de 48 h. OD fue la menos activa de las tres aplicaciones no deseadas. El efecto de las tres aplicaciones no deseadas era algo más fuerte para las células A549. Por ello, estudiaron la vía activada en el A549 que demuestra que las células tratadas con DD activan factor de necrosis tumoral receptor 1 (TNFR1) y Fas Asociada dominio de muerte (FADD) que conduce a la necroptosis vía de señalización de la muerte de la caspasa-3, sin la activación de la vía de supervivencia proteína del receptor-Interactuar ( Q.E.P.D). La vía /FADD /caspasa TNFR1 también se observó con OD, pero sólo después de 48 h. Este fue el único PUA que activó PIR, consistente con el hallazgo de que la OD causa menos daño a la célula en comparación con DD y HD. Por el contrario, las células tratadas con HD activan la vía de Fas /FADD /caspasa. Este es el primer informe que aplicaciones no deseadas activan una maquinaria apoptótica extrínseca en contraste con otros fármacos contra el cáncer que promueven una ruta de muerte intrínseca, sin afectar a la viabilidad de las células normales del mismo tipo de tejido. Estos hallazgos tienen implicaciones interesantes también desde el punto de vista ecológico teniendo en cuenta que la alta definición es una de las aplicaciones no deseadas más comunes producidos por las diatomeas
Visto:. Sansone C, Braca A, Ercolesi E, G Romano, Palumbo A, Casotti R, et al. (2014) de la diatomea-Derivado poliinsaturadas aldehídos activar la muerte celular en líneas celulares de cáncer humano, pero no las células normales. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10.1371 /journal.pone.0101220
Editor: M. Srinivasa Srinivasula, IISER-TVM, India
Recibido: 14 Enero, 2014; Aceptado: 4 Junio 2014; Publicado: 3 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Sansone et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Estación Zoológica Anton Dohrn y por el Proyecto Operativo Nacional italiano de Estudio PON01_02093 de las nuevas tecnologías y plataformas tecnológicas para la mejora de los procesos de producción de principios activos farmacéuticos de interés industrial y la búsqueda de nuevas moléculas bioactivas a partir de fuentes naturales. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores confirman que el co-autor Adrianna Ianora es un editor de PLoS One académico, sino que esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
las diatomeas son algas microscópicas, unicelulares que representan los organismos fotosintéticos dominantes en los océanos del mundo. Su papel beneficioso como alimento para rumiantes fue desafiado hace más de una década después del descubrimiento de que algunas especies de diatomeas producen compuestos teratogénicos, tales como aldehídos poliinsaturados (PUA) que inducen abortos, defectos de nacimiento, pobre desarrollo y la elevada mortalidad crías en planctónicas depredadora e invertebrados bentónicos [ ,,,0],1] - [3]. Aplicaciones no deseadas son los productos finales de una vía metabólica liasa lipoxigenasa /hidroperóxido [4] iniciado por el daño a las células de algas, como ocurre a través de pastoreo de los depredadores. El daño celular activa las enzimas lipasa que liberan ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) a partir de las membranas celulares que se oxidan inmediatamente y se escinde dentro de segundos para formar aplicaciones no deseadas y una plétora de otros compuestos denominados colectivamente oxilipinas [4], [5]. Numerosas funciones se han propuesto para aplicaciones no deseadas, tales como: grazer defensa [6], [7]; alelopatía [8], [9], célula a célula de señalización [10], la actividad antibacteriana [11], [12] y de terminación de la floración [13], [14]. Por lo tanto, los mismos metabolitos secundarios tienen múltiples funciones de pastoreo defensa para señalar moléculas que median varias interacciones de plancton.
En primer lugar se describe en las diatomeas marinas por Miralto et al. [15] que mostró que el PUA 2 a
trans, España 4 a
cis
, 7-
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-decatrienal, 2-
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, 4 a
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, 7-
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-decatrienal y 2 a
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, 4,
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-decadienal (DD) detenidos en el desarrollo embrionario copépodos y erizos de mar, y tuvieron efectos antiproliferativos y apoptóticos en la línea celular de adenocarcinoma humano CaCo2. Sucesivamente, tanto estudios de laboratorio y de campo han demostrado un impacto perjudicial de las dietas de diatomeas en copépodos herbívoro éxito reproductivo [6], [16] - [19]. Aplicaciones no deseadas puede ser secuestrado durante el desarrollo de ovocitos y se hace pasar por vía materna al embrión, o puede actuar directamente sobre embriones. Por lo que la ruta, el momento de la reproducción en relación con la abundancia de diatomeas tóxica tendrá consecuencias importantes para el reclutamiento de invertebrados [6].
compuestos similares son producidos por las plantas con flores más altas que se cree que desempeñan un papel fundamental en la defensa de las plantas porque actúan como atractores químicos (por ejemplo, feromonas, atracción de polinizadores) o señales de alarma contra el ataque de herbívoros (por ejemplo, en las interacciones tritróficas) y los compuestos de protección (antibacteriano, cicatrización de heridas) [20]. oxilipinas diatomeas también muestran una alta similitud con los compuestos orgánicos volátiles liberados a partir de algas marrones que son sugeridos estar involucrados en la señalización química y la atracción de feromonas entre los gametos de diferente sexo [20] y parecen ser productos intermedios para la inmunidad innata [21].
el PUA DD es el metabolito más estudiado de este grupo y por lo tanto se ha convertido en un aldehído modelo para estudios experimentales sobre los efectos de oxilipinas sobre los organismos marinos (revisado en [1], [3]). Sin embargo, varias diatomeas marinas han demostrado que producen aplicaciones no deseadas que no sean DD, incluyendo
Skeletonema marinoi
, formando una diatomea floración cosmopolita que produce 2 a
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, 4 a
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-heptadienal (HD), 2 a
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, 4 a
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-octadienal (OD) y 2-
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, 4 a
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, 7-octatrienal (octatrienal) [22], [23]. De estos, el más común es HD [13], [24]. Ceballos y Ianora [25] llevaron a cabo experimentos que evaluaron los efectos de la DD, OD y HD en el huevo de copépodos éxito de eclosión que muestran que cuanto mayor sea la longitud de la cadena de la PUA, más fuerte será la actividad biológica de estas moléculas, según ha confirmado [26] en bacterias, algas, hongos, equinodermos, moluscos y crustáceos, y [27] utilizando huevos de erizo de mar. Ribalet et al. [9] también encontraron una reducción dependiente de la concentración en la tasa de crecimiento del fitoplancton marino, pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos, expuestos a aplicaciones no deseadas con aldehídos-cadena más larga que tienen mayores efectos sobre el crecimiento de aldehídos-cortos encadenados.
Aquí se comparan los efectos de diferentes aplicaciones no deseadas, incluyendo DD, OD y HD en el adenocarcinoma de pulmón línea celular A549, adenocarcinoma de colon metastásico derivado de ascitis COLO 205 línea celular, y el pulmón /almuerzo normal de células epiteliales línea BEAS-2B. Aplicaciones no deseadas se sabe que causan la apoptosis [15], [28] - [29], pero en un estudio anterior [6] se demostró que ejercen efectos dramáticos solamente en la proliferación, las células indiferenciadas. Por lo tanto, se utilizaron dos líneas de células tumorales altamente agresivos para comprender mejor las vías de señalización implicadas en la muerte celular y una normal para evaluar una acción específica hipotético contra la proliferación de tipos de células. Otro objetivo importante fue comparar los efectos de la DD, un modelo PUA en experimentos toxicológicos, pero no la PUA presente más común en el fitoplancton marino (en una encuesta de 51 especies de diatomeas marinas, DD era el menos detectaron PUA, [24]) con la más frecuente HD diatomea aplicaciones no deseadas y OD. Estos son más propensos a causar insidiosos (sensu [15]) efectos antiproliferativos sobre planctónicas y bentónicas herbívoros
In situ
durante las floraciones de diatomeas naturales tales como los reportados por [3] y las referencias en él.
material y Métodos
Los cultivos de células y el tratamiento
El A549 (ATCC CCL185) adenocarcinoma de pulmón humano y COLO 205 (ATCC CCL-222) adenocarcinoma de colon líneas celulares derivadas metastásicas ascitis se mantuvieron en DMEM ( medio de Dulbecco modificado de Eagle) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades ml
-1 penicilina y 100 mg ml
-1 estreptomicina. Las células se incubaron en un CO 5%
2 cámara humidificada a 37 ° C para el crecimiento. Las células A549 y COLO 205 (2 × 10
4 células bien
-1) fueron sembradas en una placa de 24 pocillos y se mantuvo durante la noche para la unión. Al día siguiente el medio se sustituyó por medio fresco con tres concentraciones (2, 5 y 10 micras) para cada una de las tres aplicaciones no deseadas (DD, OD y HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) probados; Se dejó que las células crecieran durante 24, 48 y 72 h. Después de la incubación, se retiró el sobrenadante y se examinaron las células adherentes para la viabilidad. Las células A549 utilizados para el análisis de proteínas /extracción de RNA y del ciclo celular 2 × 10
6 se sembraron en placas de Petri (90 mm de diámetro) y se trató como se informó anteriormente.
En un experimento independiente, células A549 (2 x 10
3 células bien-1) fueron sembradas en una placa de 96 pocillos y se mantuvo durante la noche para la unión. Al día siguiente el medio se sustituyó por medio fresco con tres concentraciones (2, 5 y 10 micras) para cada una de las tres aplicaciones no deseadas (DD, OD y HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) a prueba y con la caspasa-3 inhibidor (C
30H
41FN
4O
12, SC-3075, Santa Cruz) en 9,7 M; Se dejó que las células crecieran durante 24, 48 y 72 h. Después del tratamiento aldehído, se evaluaron células viables como se describe a continuación. El BEAS-2B (ATCC CRL-9609) de pulmón /almuerzo línea de células epiteliales normales se mantuvo en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con suero de 50% de bovino fetal (FBS), 100 unidades ml
-1 penicilina y 100 mg ml
-1 estreptomicina. Las células se incubaron en un CO 5%
2 cámara humidificada a 37 ° C para el crecimiento. BEAS-2B (2 × 10
3 células bien
-1) se sembró en una placa de 96 pocillos y se mantuvo durante la noche para la unión. Al día siguiente el medio se sustituyó por medio fresco con tres concentraciones (2, 5 y 10 micras) para cada una de las tres aplicaciones no deseadas (DD, OD y HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) probados; Se dejó que las células crecieran durante 24, 48 y 72 h. Después de la incubación, se retiró el sobrenadante y se examinaron las células adherentes para la viabilidad
Ensayos de viabilidad
Se realizaron dos tipos de ensayos de viabilidad:. MTT y el ensayo de azul de tripano. Nosotros aquí elegimos para representar los datos más significativos obtenidos con uno o el otro tipo de prueba en función de las características de las células tratadas. En las células normales particulares (BEAS-2B) que no fueron afectadas por el tratamiento aplicaciones no deseadas (y por lo tanto no hubo células muertas) fueron examinados con el ensayo colorimétrico MTT, mientras que 205 células A549 y COLO fueron coloreadas con azul de tripano que tiñe células sólo muertos. Además, las células A549 tratadas con aplicaciones no deseadas en presencia de caspasa-3 inhibidor también se examinaron con el ensayo de MTT para evaluar la inhibición de la toxicidad.
Para azul Trypan, A549 y las células COLO 205 (2 × 10
4 /pocillo) se sembraron en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se mantuvo durante la noche para la fijación en presencia de medio de Dulbecco. El día siguiente, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene 0, 2, 5 o 10 mM de DD, OD o HD. Se incubaron las células tratadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la incubación, se recogió y se desechó el sobrenadante, mientras que las células adherentes se trataron con una solución de azul de tripano al 0,4% (Hyclone, Lote Nº JRH27098) de acuerdo con el ensayo de exclusión de azul de tripano colorante [30]. Después de la coloración, las células fueron separadas con tripsina, se centrifugaron y el sedimento se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS); 10 l de esta solución se colocó en una cámara de recuento Bürker. células azules (que indican las células muertas) se contaron en cada área y se compararon con controles para el cálculo de la viabilidad celular%.
Para MTT, las células A549 y BEAS2B fueron sembradas en placas de 96 pocillos (2 x 10
3 células /pocillo), después de tiempos de tratamiento, y se incubaron con 10 l (10 mg /ml) de MTT (3- [4,5-metiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazoliumbromide, Applichem A2231). Se evaluó el número de células viables después de aldehído (DD, OD, HD) de tratamiento mediante el ensayo de MTT espectrofotométrico de acuerdo con el protocolo del fabricante y se calcula como la relación entre el promedio de absorbancia (λ = 570 nm) de la muestra y la media de la absorbancia del control y se expresó como porcentaje de viabilidad.
La naranja de acridina /bromuro de etidio prueba doble tinción para el análisis morfológico
control y células A549 tratadas adherentes se trataron con tripsina y se recogieron por centrifugación a 500 g durante 5 min. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se detectaron cambios en la morfología celular con la prueba de tinción con naranja de acridina /bromuro de etidio. Las células se resuspendieron en 25 l de medio de contraste (100 mg ml
-1 de naranja de acridina y 100 mg ml
-1 de bromuro de etidio preparados en PBS y se mezcló suavemente). 10 l de las células teñidas se colocaron en un portaobjetos de microscopio, cubierta con un cubreobjetos y se examinaron con un microscopio confocal (Zeiss LSM510, láser 488 con filtro LP505 para fluorescencia verde; láser 543 con LP 560 de filtro para fluorescencia roja) con 25 × objetivo. La naranja de acridina penetra tanto las células muertas que emiten fluorescencia verde cuando intercalado en ácidos normales de doble cadena nucleicos (ADN) y fluorescencia roja cuando se une con los ácidos nucleicos de cadena sencilla dañados vida y trabajo. El bromuro de etidio penetra sólo las células muertas con membranas dañadas que emiten fluorescencia roja. Cuatro tipos de células se identificaron de acuerdo con [31] sobre la base de la emisión de fluorescencia y el aspecto morfológico de condensación de la cromatina en los núcleos teñidos: (1) células viables con núcleos uniformemente color verde brillante y una estructura organizada (control); (2) células apoptóticas temprana con núcleos irregulares verdes con cromatina condensada y con cuerpos apoptóticos teñidos de rojo, (3) las células apoptóticas con fines de naranja a rojo núcleos con cromatina muy fragmentado; (4) de manera uniforme naranja a rojo núcleos con una estructura organizada atribuible a las células necróticas.
El aislamiento de ARN y RT
2 Profiler PCR matrices
Después del tratamiento, las células se lavaron A549 en cultivo de tejidos plato mediante la adición de PBS frío y meciéndose suavemente. Se lavaron las células directamente en una placa de cultivo mediante la adición de 1 ml de reactivo Trizol (Life Technologies, Cat. 10296-010) por placa de 10 cm de diámetro y raspando con rascador de células. El ARN se aisló de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de ARN y la pureza se evaluó mediante el NanoDrop nanophotomer (Euroclone). ARN (400 ng) se sometió a reacción de transcripción inversa utilizando la RT
2 kit de primeros hebra (Qiagen, cat.330401) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para evaluar la expresión de genes de apoptosis, real tiempo transcripción inversa cuantitativa PCR (QRT-PCR) se realizó utilizando la RT
2 Profiler PCR matrices kit (Qiagen, cat.330231). Los experimentos se realizaron por triplicado para la línea de células A549 tratadas con aplicaciones no deseadas en 5 concentración mu M durante 2 horas de tiempo de exposición.
Las placas se ejecutan en un 7 (Applied Biosystems 384 bloques bien), protocolo Fast Standard ViiA PCR de ciclo con 10 volúmenes de reacción mu l. Las condiciones de ciclación utilizadas fueron - iniciación 1 ciclo a 95,0 ° C durante 10 min y seguido de la amplificación durante 40 ciclos a 95,0 ° C durante 15 s y 60,0 ° C durante 1 min. datos de amplificación se recogieron por medio de ViiA 7 OBA Software (Applied Biosystems). Los valores de Ct se analizaron con el programa de PCR datos de la matriz de análisis en línea (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).
La extracción de proteínas
lisado de células A549 , después del tratamiento, se preparó mediante el raspado de las células de cada placa de Petri en 1 ml de tampón de lisis RIPA (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, EDTA 5 mM, 0,5% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1 % SDS), complementado con inhibidores de la proteasa (PMSF 1 mM y tabletas completas de cóctel inhibidor de la proteasa, Roche, Monza, Italia) y los inhibidores de la fosfatasa (Tablas de coctel PhosSTOP, Roche). El lisado se incubó en hielo durante 15 min y luego se clarificó por centrifugación a 14.000 g durante 20 min. La concentración total de proteína se determinó usando un Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Milán, Italia) con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. El extracto de proteína se almacenó a - 80 ° C hasta su uso
La electroforesis
Antes de la electroforesis, las muestras de proteína se incubaron a 100 ° C durante 5 min.. Tras 10% SDS-PAGE, los geles se tiñeron con Coomassie o se transfirieron a nitrocelulosa membrana (Hybond, GE Healthcare). Las membranas se bloquearon durante 1 h en 1X Tris Buffered Saline (TBS), con 0,1% de Tween-20 con 5% w /v de leche descremada en polvo, y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios diluidos en 1X TBS, 0,1% Tween -20 con 5% de BSA. Los anticuerpos primarios fueron de la muerte Receptor Anticuerpo Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S) incluyendo anti-TNFR1 (1:1000), anti-TNFR2 (1:1000), anti-FADD (1:1000), anti-RIP (1 :1000), anti-Fas /FasL (1:1000). Anti-activa Cas-3 (1:1000) comprado a Biovision. Control positivo se obtuvo mediante el uso de anticuerpo anti-actina (1:500) (Sigma). Actina se utilizó como control para cada proteína analizada. Aquí sólo mostramos un gel representativo de actina. Después de la incubación, las membranas se lavaron tres veces durante 5 min cada una con 15 ml de TBS /Tween y después se incubaron con HRP-conjugado anticuerpo secundario anti-conejo (1:2000, Cell Signaling Technology) con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las membranas se lavaron tres veces durante 5 min cada una con 15 ml de TBS /Tween. Las membranas fueron borrados immunodetected utilizando ECL Western Blot reactivo Primer detección (GE Healthcare). Las proteínas se visualizaron con Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). El análisis densitométrico de las bandas immunopositive se realizó utilizando el software Image J.
Análisis del ciclo celular
Se recogieron las células A549 a partir de placas utilizando 1 ml de tripsina-EDTA (Lonza, Italia), fijado en el 70% etanol y se almacenan a -20 ° C. Las células fueron lavadas dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS que contiene 1 mg ml
-1 RNasa A (Qiagen, Cat.19101), se incubaron a 37 ° C durante 45 min y después se tiñeron con yoduro de propidio (PI, 10 mg ml
-1) durante 15 minutos. La distribución de ADN dentro de las células se estima entonces utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EE.UU.). El porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular se calculó utilizando ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.).
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticas entre las células tratadas y de control para los recuentos de viabilidad celular se determinó por ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Dunn con valores de p ≤ 0,05 significativos utilizando GraphPad
Los datos de expresión génica se analizaron por PCR de datos de matriz Prism (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.). software en línea de análisis (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Los histogramas muestran proporciones de expresión relativa de los genes analizados con respecto a los controles sin aplicaciones no deseadas. Sólo expresión valores superiores a una diferencia 1,55 veces con respecto a los controles se consideró significativo.
expresión de la proteína de inmunotransferencia se calculó como el porcentaje de área integral de cada banda de gel individual con respecto al área total carril gel, representado como píxeles. Las diferencias estadísticas entre tratados y controles fueron determinados por el análisis T-estudiante con valores de p significativos ≤0.05. Los datos significativamente diferentes de los controles, con valores de p & lt;. 0.001 están marcados con 2 asteriscos en las figuras
Resultados
Viabilidad de A549 y líneas celulares de cáncer COLO 205, y normal de las células BEAS-2B tras el tratamiento con el decadienal PUA (DD)
Tal como se muestra en la Fig. 1A-1B, el tratamiento de A549 y las células COLO 205 con 2, 5 o 10 mM de DD resultó en una dosis significativa y la reducción dependiente del tiempo en la viabilidad celular en comparación con los controles (p & lt; 0,05). Después de 24 h, se observó una disminución en el porcentaje de células A549 viables con todas las dosis probadas (70%, 50% y 18% de células viables a los 2, 5 y 10 micras concentraciones DD, respectivamente). Se obtuvieron resultados similares con células COLO 205 (80%, 44% y 26% de células viables a los 2, 5 y 10 micras concentraciones DD, respectivamente). Después de 48 h de tratamiento, se observó una reducción adicional, sobre todo a altas concentraciones DD de 5 y 10 mM para las células A549; COLO 205 viabilidad disminuyó más lentamente (67%, 43% y 23% de células viables a los 2, 5 y 10 micras concentraciones DD, respectivamente). En 10 micras células A549 mostraron alteraciones morfológicas evidentes, tales como la pérdida de adherencia de contacto con otras células, así como con el sustrato de placa. Después de 72 h, la viabilidad celular A549 se redujo a 0% con DD 5 y 10 mM y a 26% con DD 2 M; la viabilidad celular COLO-205 fue de 30%, 21% y 13% con 2, 5 y 10 DD mu M, respectivamente.
(D) Efecto de la DD en la línea celular A549 en presencia del inhibidor de la caspasa-3 ( 9,7 M). Porcentaje de células viables para A549 y COLO 205 calculados con el ensayo de viabilidad con azul de Trypan y para BEAS-2B con el ensayo MTT viabilidad. Los valores se presentan como media ± S.D. en comparación con los controles (100% de viabilidad); ▴ 2 micras; ▪ 5 M, ♦ 10 mM.
El tratamiento de células BEAS-2B con 2, 5 o 10 mM de DD no redujo significativamente la viabilidad celular en comparación con los controles (Fig. 1C). Después de 24 h de tratamiento DD BEAS-2B viabilidad celular disminuyó ligeramente (74%, 65% y 85% de células viables a los 2, 5 y 10 concentraciones M DD, respectivamente), pero después de 48 y 72 h de la viabilidad celular se recuperó y fue comparable a los controles , que indican efectos tóxicos leves después de sólo 24 h. Por último, para evaluar el efecto citotóxico específico registrado para la línea celular A549, el experimento de ensayo MTT se realizó en presencia de un inhibidor de la caspasa-3 para todos los tratamientos aldehído. La Figura 1D muestra que el porcentaje de viabilidad celular es comparable a las células tratadas con aplicaciones no deseadas sin inhibidor a 2 mM; a los 5 y 10 micras hay una disminución más lenta en la viabilidad celular en comparación con el tratamiento sin la caspasa-3 inhibidor después de 48 h (figura 1A), pero después de 72 h las mismas concentraciones indujo un aumento en la muerte celular.
Viabilidad de A549 y líneas celulares de cáncer COLO 205 y normal línea celular BEAS-2B después del tratamiento con el PUA octadienal (OD)
el tratamiento de células A549 con 2, 5 o 10 mM de OD inhibe la proliferación celular con el tiempo, especialmente a concentraciones más altas (10 mM) cuando la viabilidad celular se redujo a 35% después de 72 h (Fig. 2A). A los 2 M concentraciones, el efecto sobre la viabilidad celular después de 24 h no fue significativamente diferente en comparación con los controles, pero se hizo tan después de 72 h (p & lt; 0,05). Considerando COLO 205 viabilidad de las células después de 24 h no disminuyó significativamente (Fig. 2B), los efectos citotóxicos se hizo más fuerte después de 72 h para los tres OD concentraciones (60%, 60% y 41% de células viables a concentraciones de DO 2, 5 y 10 micras , respectivamente, p & lt;. 0.05)
(D) Efecto de la OD en la línea celular A549 en presencia de caspasa-3 inhibidor (9,7 M). Porcentaje de células viables para A549 y COLO 205 calculados con el ensayo de viabilidad con azul de Trypan y para BEAS-2B con el ensayo MTT viabilidad. Los valores se presentan como media ± S.D. en comparación con los controles (100% de viabilidad); ▴ 2 micras; ▪ 5 mM, 10 mM ♦.
El tratamiento de células BEAS-2B con 2 y 5 micras de diámetro exterior no redujo significativamente la viabilidad celular en comparación con los controles después de 24, 48 y 72 h (Fig. 2C ), mientras que a las 10 OD M, la viabilidad celular BEAS-2B se redujo ligeramente después de 72 horas (75% de células viables). El tratamiento de células A549 con DO en presencia de inhibidor de la caspasa-3 no dio lugar a diferencias significativas en la viabilidad celular en porcentaje (Fig. 2D).
viabilidad de A549 y COLO 205 líneas celulares de cáncer y normales BEAS-2B línea celular después del tratamiento con la PUA heptadienal (HD)
Tal como se muestra en la Fig. 3A, el tratamiento con 2, 5 y 10 mM de HD en células A549 proliferación celular ligeramente inhibido después de 24 h, pero el efecto todavía fue significativamente diferente con respecto a los controles (p & lt; 0,05). El efecto fue más evidente con el tiempo. En particular, en 10 mM sólo el 10% de las células eran viables después de 48 h y 0% después de 72 h. tratamiento HD en las células COLO 205 también causó una reducción en la viabilidad celular, pero el efecto no era tan fuerte como con células A549. Después de 48 y 72 h (Fig. 3B), se observó un efecto significativamente tóxico en concentraciones altas (HD 40% y 28% de viabilidad celular a las 10 M HD).
(D) Efecto de la HD en células A549 línea en presencia de caspasa-3 inhibidor (9,7 M). Porcentaje de células viables para A549 y COLO 205 calculados con el ensayo de viabilidad con azul de Trypan y para BEAS-2B con el ensayo MTT viabilidad. Los valores se presentan como media ± S.D. en comparación con los controles (100% de viabilidad); ▴ 2 micras; ▪ 5 mM, 10 mM ♦.
Al igual que en el caso de DD y OD, el tratamiento de células BEAS-2B con HD no indujo toxicidad (Fig. 3C). El tratamiento de células A549 con HD en presencia de inhibidor de la caspasa-3 no dio lugar a diferencias en el porcentaje de células viables en mayores concentraciones de HD (5 y 10 mM) (Fig. 3D). En 2 M, hubo un aumento significativo de la mortalidad celular en presencia de la caspasa-3 Inhibidor después de 72 h (Fig.3D).
efectos morfológicos de la diatomea aplicaciones no deseadas DD, OD y HD en la línea celular A549
para observar los cambios morfológicos en las células tratadas con DD, OD y HD y para verificar si la viabilidad disminuyó después del tratamiento se correlaciona con la inducción de la apoptosis, duplicamos las células teñidas con los tintes fluorescentes para ácidos nucleicos, naranja de acridina (AO) y bromuro de etidio (EO) después de 48 h de tratamiento. Las células viables se identificaron por los núcleos verdes brillantes en células intactas (AO). A principios células apoptóticas se identificaron por los núcleos verdes irregularmente estructuradas con cromatina condensada y naranja o parches de color rojo claro. Fines de células apoptóticas contenían tiñeron positivamente núcleos con ambos colorantes (EB) y AO, que aparecen de color rojo naranja o la luz, junto con los cuerpos apoptóticos. Los núcleos de las células necróticas tenían cromatina intacta y aparecieron rojo. Todos los núcleos de control aparecieron verde con una estructura esférica regular y organización de la cromatina a excepción de unas pocas células senescentes en una etapa necrótico que mostraban núcleos fluorescente roja (Fig. 4A). En 10 mM DD, todas las células estaban en la etapa de apoptosis tarde y se caracterizaron por doble tinción de color amarillo-naranja (AO /EB) debido a la condensación de la cromatina y la pérdida de integridad de la membrana (Fig. 4B). En 10 OD mu M, el daño celular fue menos evidente con distintos cambios en la morfología y la presencia de tinción con rojo en algunas células, lo que indica la progresión de la apoptosis celular (flechas en la Fig. 4C). En 10 mM HD, la morfología celular se alteró sustancialmente con cromatina dispersa en los núcleos que aparecieron ampliada. Los sellos de finales de la apoptosis tales como la fragmentación nuclear también fueron visibles (flechas en la Fig. 4D).
Control y células tratadas doble teñidas con naranja de acridina y bromuro de etidio después de 48 M DD, OD y HD observa en el microscopio confocal . Los números indican (1) células normales; (2) células apoptóticas temprana; (3) células apoptóticas tarde; (4) células necróticas (ver materiales y métodos para más detalles). Las flechas indican las células con núcleos fragmentados.
análisis de inmunotransferencia de los receptores de muerte (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) y los efectores (caspasa-3) en la línea celular A549 tratadas con aplicaciones no deseadas (DD, OD y HD )
Después de 24 h de tratamiento, DD indujo un aumento dependiente de la dosis en la expresión de receptor del factor de necrosis tumoral 2 (TNFR2), especialmente al 5 y 10 mM, en comparación con los controles, como se revela por análisis densitométrico de la hoja fotográfica (Fig. 5A) de la membrana de inmunotransferencia. Por el contrario, los receptores de factores asociados TNF (TRAF1 y TRAF2) no se activaron indica la ausencia de una vía de supervivencia. Por otra parte, DD indujo una activación de TNFR1 en las células tratadas con 5 y 10 mM concentraciones (Fig. 5A). Las aguas abajo Fas asociada a la proteína con dominio de muerte (FADD) también se activa con fuerza a los 10 M concentraciones, mientras que los niveles de la proteína receptora que interacciona (RIP) se redujo drásticamente en las tres concentraciones DD (Fig. 5A). La reducción de la expresión de RIP representa una muerte temprana vía de señalización, como se indica por la ausencia de proteínas adaptadoras tales como necrosis tumoral de tipo receptor del factor de la proteína 1 asociada a la muerte de dominio (TRADD) o factores de TNF receptor asociado TRAF1 y TRAF2 (datos no mostrados). DD también activa la caspasa-3 que confirma la muerte celular por apoptosis después de 24 h (Fig. 5A). Otros receptores de muerte implicados en la apoptosis vía extrínseca (Fas, DR3, DR4, DR5), así como algunos de los factores activados en las vías intrínseca de apoptosis (Akt1, Akt2, PARP, APAF1) no estaban implicados en la respuesta celular a DD (datos no mostrados ).
El análisis por inmunotransferencia muestra que aplicaciones no deseadas inducir la señalización de TNF después de 24 (DD y HD) y 48 h (DO) de tratamiento con la actina. Asterisco indica aumento significativo en los niveles de proteína medidos. ** P = 0.05 versus control; barras de error representan ± SD.
Se observó la misma vía OD después del tratamiento, pero sólo después de 48 h. expresión TNFR2 aumentó ligeramente en comparación con los controles, pero la diferencia no fue significativa. TNFR1 y FADD mostraron una respuesta significativa a las concentraciones más altas (5 y 10 mM) (Fig. 5B). En contraste con DD, las células tratadas-OD mostraron una expresión fuerte y persistente de RIP, lo que indica la coexistencia de una supervivencia y muerte de señalización de respuesta (Fig. 5B). Caspasa-3 también se activó como con DD (Fig. 5B).
HD no aumentó significativamente la expresión de TNFR2 (Fig. 5C) y no provocó ninguna respuesta en TNFR1 después de 24 h y 48 h. Después de 24 h HD incrementado fuertemente la expresión del receptor Fas (Fas /FasL-ligando System) de una manera dependiente de la dosis. Se observó un efecto máximo de HD en Fas a los 5 y 10 mM concentraciones (Fig. 5C). HD también aumentó la expresión de FADD y se activa la caspasa-3 (Fig. 5C). Por el contrario, los niveles de PIR disminuyeron drásticamente después de 24 h (Fig. 5C). Por otra parte, APAF1 no fue revelado después del tratamiento HD a las 24 y 48 h (datos no mostrados).
Análisis de la expresión de genes que codifican para receptores de muerte (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) y los efectores (caspasa-3, AIFM1) en la línea celular A549 tratados con
para entender mejor los efectos tóxicos a nivel molecular, se analizaron las células A549 después de 2 h de tratamiento aplicaciones no deseadas (PUA DD, OD y HD), ya que todas las proteínas de DD y HD ya se expresaron y se activa después de 24 h. Se optó por utilizar una concentración 5 mM desde al efecto de las concentraciones más altas eran demasiado graves.
genes de control para qPCR en tiempo real fueron actina-beta (ACTB), Beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT1