Extracto
El objetivo de este estudio es evaluar la expresión de citoquinas por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I y para confirmar estos patrones de expresión mediante la exposición de PBMC a las células de cáncer de pulmón
in vitro. Cinco citoquinas alteradas en pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (CCL3, IL8, IL1β, CXCL10, sIL2Rα) se identificaron en plasma de sujetos (n = 15) antes y después de la resección mediante un panel de ensayo de la proteína 30-plex. Se llevaron a cabo estudios de expresión génica utilizando RT-qPCR en PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (n = 62) antes y después de la resección, y en comparación con los pacientes sin cáncer (n = 32) antes y después de la cirugía para la enfermedad benigna. experimentos de co-cultivo que expusieron las PBMC de donantes sanos a las células de cáncer de pulmón
in vitro
se realizaron para evaluar el efecto sobre la expresión de citoquinas PBMC. PBMC expresión génica de CCL3, IL8 y IL1β fue mayor en los pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los mismos pacientes en cada uno de cuatro puntos de tiempo secuenciales después de la eliminación de sus tumores, mientras que CXCL10 y IL2Rα fueron esencialmente sin cambios. Este patrón también se detectó cuando los pacientes de cáncer de pulmón se compararon con pacientes sin cáncer. Cuando los pacientes no cancerosas se sometieron a cirugía para enfermedades benignas, estos cambios en la expresión de citoquinas no eran demostrables. líneas celulares de cáncer de pulmón, pero no las células epiteliales bronquiales benignas, los cambios inducidos similares en genes de citoquinas y la expresión de la proteína por PBMC de donantes sanos en un
in vitro
sistema de co-cultivo in. Llegamos a la conclusión de que PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I poseen distintos patrones de expresión de citoquinas en comparación con los dos pacientes que no tienen cáncer y pacientes con cáncer de pulmón después de la extirpación del tumor. Estos patrones de expresión se replican por PBMCs de donantes sanos expuestos a líneas celulares de cáncer de pulmón, pero no las células epiteliales bronquiales benignas
in vitro
. Estos resultados tienen implicaciones para la comprensión de la respuesta inmune al cáncer de pulmón
Visto:. Chang DH, Rutledge JR, Patel AA, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) El efecto de cáncer de pulmón en la expresión de citoquinas en Las células mononucleares de sangre periférica. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10.1371 /journal.pone.0064456
Editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Octubre, 2012; Aceptado: April 15, 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación del hospital Valle. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, y se espera dar cuenta de más muertes en 2012 que colorrectal, mama y próstata combinados [1]. Aunque el cáncer de pulmón ha sido considerado como una enfermedad maligna poco inmunogénico, varias líneas de evidencia sugieren una influencia del sistema inmune del huésped en la alteración de desarrollo del cáncer de pulmón y la progresión. Estos incluyen informes de aumento de la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón con infecciones postoperatorias [2], el aumento de las tasas de recurrencia entre los pacientes que reciben transfusiones de sangre perioperatoria [3], [4], y mayores tasas de incidencia entre los individuos inmunodeprimidos, como los que dan positivo para el Virus de la Inmunodeficiencia humana (VIH) [5]. A pesar de estas observaciones, el papel del sistema inmune del huésped en el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón sigue siendo poco clara.
Las citoquinas y quimioquinas (citoquinas quimiotácticas) son importantes reguladores endógenos del sistema inmune y son secretadas por las células inmunes, así como por el tumor. En el paciente con cáncer, estas moléculas poseen diversas y complejas papeles en la función y el tráfico de las células inmunes y otras, incluyendo las células progenitoras endoteliales [6]. redes de citoquinas y quimioquinas también pueden ser "secuestrado" por las células cancerosas para proporcionar un entorno propicio para el crecimiento del tumor [6], [7].
Dado el papel poco claro de la inmunidad antitumoral en pacientes con cáncer de pulmón, combinado con la importancia global de citocinas y quimiocinas a la respuesta inmune, la hipótesis de que el cáncer de pulmón tendría efectos específicos sobre la expresión de citoquinas /quimioquinas y la secreción por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). A este respecto, el propósito del presente estudio es triple. En primer lugar, para determinar si los pacientes con estadio I presentan cáncer de pulmón la expresión de citoquinas circulantes alterado en plasma y PBMC antes de la resección potencialmente curativa, en comparación con después de la resección, y para identificar las citocinas expresadas diferencialmente. En segundo lugar, para confirmar esta expresión diferencial en PBMCs obtenidas a partir de una cohorte más amplia de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I, y comparar estos resultados con una cohorte de pacientes sometidos a cirugía torácica para enfermedades benignas. En tercer lugar, para determinar si se activa esta expresión de citoquinas diferencial cuando PBMC de donantes sanos están expuestos a las células del cáncer de pulmón
in vitro
.
Materiales y Métodos
Población de pacientes
Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del hospital Valle y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes del estudio. Se investigaron dos grupos de pacientes. El grupo de pacientes de cáncer de pulmón incluyó individuos sometidos a lobectomía pulmonar curativa y la disección ganglionar mediastínica, con el estado de la etapa I confirmada patológicamente. El grupo de pacientes control incluyó pacientes no oncológicos sometidos a cirugía torácica para condiciones benignas, como neumotórax espontáneo, la resección de diagnóstico de un nódulo pulmonar benigno, enfermedad bullosa pulmonar, bronquiectasias, quistes mediastínicos /pulmonares, y la reparación de la hernia de hiato.
los pacientes fueron excluidos del estudio si estaban recibiendo tratamiento crónico con esteroides, encontró que tenía cáncer de pulmón avanzado (estadio II, III, IV) patológicamente después de la resección, tenía otros tipos de cáncer concomitantes distintos de cáncer de piel no melanoma, adyuvante requerido o la quimioterapia neoadyuvante , radioterapia o ambas, o tenían antecedentes de infección por el VIH, la hepatitis B o C u otras enfermedades inmunosupresoras o mieloproliferativas. Control de los pacientes fueron excluidos si fueron sometidos a cirugía torácica para condiciones inflamatorias /infecciosas (empiema, enfermedad pulmonar intersticial, neumonitis o activo) o tenían antecedentes de otros tipos de cáncer.
Se recogieron muestras de sangre preoperatorios durante dos ventana de la semana antes de la cirugía, mientras que las muestras postoperatorias se obtuvieron a 3 (2-4 meses), 6 (5-7 meses), 9 (8-10 meses) y 12 (11-13 meses) después de la cirugía a menos que se indique lo contrario.
Recogida de muestras y procesamiento de sangre
pulmonar y el control de la sangre del paciente se extrae por punción venosa periférica en BD Vacutainer CPT Preparación de células tubos con heparina sódica (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). el procesamiento de sangre se realizó según el protocolo del fabricante. pellets de PBMC se recogieron y se almacenaron a -80 ° C para la extracción de RNA y los ensayos posteriores. El plasma también se salvó y se almacena a -80 ° C.
leucocitos de la sangre de donantes sanos (capa leucocitaria) utilizado en el
in vitro
experimentos fueron adquiridos de la Comunidad de Servicios de Sangre (Paramus, NJ) . Estos PBMCs se prepararon por centrifugación de sangre en Ficoll-Paque PLUS medio de gradiente de densidad (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) durante 30 minutos a 805 ×
g
fcr (fuerza centrífuga relativa) a temperatura ambiente. PBMCs aisladas se recuperaron y se lavaron dos veces en PBS mediante centrifugación durante 15 y 10 min a 453 ×
g
a 4 ° C. Las PBMC aisladas se utilizaron luego para el
in vitro
ensayos de co-cultivo.
Luminex Ensayo
El ensayo Luminex es un inmunoensayo basado en perlas múltiplex, que permite la simultánea medición de múltiples analitos (por ejemplo, citoquinas) utilizando una biblioteca de perlas de anticuerpo junto con códigos de color (llamadas microesferas). Para el examen inicial de las proteínas plasmáticas, se recogió el plasma de pacientes 15 Etapa I El cáncer de pulmón antes de la operación y 3-7 meses después de la operación. Las muestras de plasma se analizaron a continuación mediante el panel de citoquinas Humano 30-plex, LHC6003, (plataforma Luminex; Life Technologies, Carlsbad, CA). Los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante con la excepción de que las muestras, perlas y el tampón se incubaron durante la noche a 4 ° C. Las reacciones se realizaron utilizando el instrumento Luminex 100 (Luminex, Austin, TX), se generaron las curvas de calibración, y se recogieron y se analizaron usando Luminex 100 Integrated Software versión 2.3 de datos. Los sobrenadantes de la
in vitro
experimentos de co-cultivo también se evaluaron usando el ensayo Luminex, de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Para los estudios iniciales de cribado plasma, los niveles de proteína relativos se expresaron mediante el cálculo de la relación de las veces el cambio medio en la expresión de la proteína (antes de la operación después de la operación a), y la transformación de los valores en el registro
2 escala. Los pacientes con al menos un punto de datos de expresión que presenta por encima del nivel de detección mínimo Luminex se incluyeron en los cálculos de la relación.
PBMC expresión de genes de la base de datos
La expresión de genes en PBMC de seis casos de cáncer de pulmón, antes y 2-5 meses después de la resección curativa se obtuvo utilizando Affymetrix U133 + microarrays 2.0, utilizando ARN aislado de lisados de células PBMC en lugar de muestras de plasma. Este trabajo ha sido descrito previamente [8]. las intensidades de hibridación se utilizaron para calcular las diferencias de plegado entre preoperatoria y muestras postoperatorias.
Extracción de ARN y Evaluación de la Calidad
ARN fue extraído a partir de lisados de PBMC utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones. gránulos congelados PBMC se lisaron directamente en tampón RLT para reducir al mínimo la degradación del ARN. Los lisados celulares se pasaron a través QIAshredder (Qiagen) antes de la purificación posterior tal como se describe en el protocolo. Se utilizó-Ribonculease libre de DNasa (Qiagen) durante la digestión en columna de ADN para minimizar la presencia de ADN genómico residual.
calidad del ARN y la concentración se evaluaron utilizando chips de ARN Nano con el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, de Santa Clara, CA), y se analizó usando el software 2100 de Expertos (Agilent). El RIN (ARN Número Integridad) para el ARN extraído estuvo en el intervalo de 7,0 a 10,0 con la media de 8,8 ± 0,68 para todas las muestras de ARN utilizados en este estudio.
cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa PCR (RT -qPCR)
los experimentos de RT-qPCR se realizaron con el instrumento 7500 PCR en tiempo real de Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Todos los materiales y protocolos se obtuvieron de Applied Biosystems. Primer sonda conjuntos (Tabla S1) fueron diseñados utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems) siguiendo el conjunto estándar de criterios de diseño establecidos por el software. Conjuntos abarcaron un intrón y puenteados una unión exón-exón y se hicieron a la especificación por cualquiera de Applied Biosystems o de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los cebadores y las sondas se ensayaron empíricamente para la ausencia de interferencia antes de ser utilizados para la multiplexación. El control de normalización utilizado para todos los experimentos de RT-qPCR era β-actina (ACTB símbolo de genes), que se utilizó como gen de referencia para todos los cálculos. RT-qPCR ensayos multiplex que constan de tres a cuatro juegos de cebadores y sondas (entre ellos el de ACTB.) Se realizaron [9].
La reacción de RT se realizó con 2 g de ARN por reacción utilizando ARN de alta capacidad a kit de ADNc (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). reacción de PCR cuantitativa se realizó utilizando 30 ng de cDNA por triplicado. Pliegan cálculos de cambio se realizaron utilizando el "método comparativo C (T)" establecida por el fabricante [10]. C (T), el umbral de ciclo, también se conoce como Cq valor (ciclo de cuantificación). Para el cálculo, se utilizó el promedio de los valores Cq por triplicado para el análisis. cq valores se normalizaron a los de ACTB.
Cultivo de células y
in vitro
experimento de co-cultivo
El A549 y HCC827 líneas celulares de cáncer de pulmón humano se adquirieron de ATCC ( Manassas, VA). Las células A549 se cultivaron en medio F12K, HCC827 células en RPMI. Ambos medios de cultivo se complementaron con suero bovino fetal al 10%, 0,028% HEPES (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), 0,02% de piruvato sódico, 0,02% de penicilina /estreptomicina, y 0,004% de gentamicina. Todos los reactivos utilizados para el cultivo celular se adquirieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las células primarias humanas bronquiales epiteliales (NHBE), medio de cultivo BEBM (complementado con el kit bullet BEGM) correspondientes, y los reactivos se compraron de Lonza (Allendale, NJ). cultura NHBE y subcultivo se realizó de acuerdo con el protocolo del proveedor (Lonza). Los cultivos de células se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2.
A549, se cultivaron células HCC927 y NHBE durante dos días en 3 ml de medio en 35 mm (6 pocillos) platos (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) a 80-90% de confluencia. Después de dos días, 0,4-micras insertos Transwell (Corning Corp, Corning, NY) se colocaron en los pocillos y 5 × 10
6 de PBMCs de donantes sanos, se suspendieron en 3 ml de medio de cultivo de células correspondiente, se añadieron a cada transwell . controles de co-cultivo consistieron en los pocillos que contenían solamente medio completo de cultivo celular (F12K, RPMI o BEBM, suplementado como se describe anteriormente) sin las células epiteliales malignos o benignos. Los co-cultivos se incubaron a continuación durante 6 y 18 horas. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células, se centrifugaron (453 ×
g
RCF, 4 ° C, 15 min), y las alícuotas se almacenaron a -80 ° C para el ensayo Luminex. Para el análisis de la expresión génica, los insertos transwell se retiraron y se lisaron inmediatamente PBMCs
in situ
usando tampón RLT (kit RNeasy; Qiagen) y, o bien se almacenó a -80 ° C o se utiliza inmediatamente para la extracción de ARN para RT-qPCR. Para el análisis de citometría de flujo de la expresión de proteínas, 10 horas después de la adición de PBMC a los insertos transwell, se añadió 1 l /ml de Golgi-Plug /Brefeldina A (BD Biosciences) para inhibir el transporte de proteínas. PMA (forbol-12-miristato-13-acetato, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se añadió a pocillos seleccionados como control positivo al mismo tiempo con GolgiPlug. Después de 8 horas más de incubación, las PBMC se recogieron y se utilizan para la citometría de flujo para detectar citoquinas intracelulares.
Citometría de Flujo
Para definir las poblaciones de células PBMC, la sangre del paciente se vio envuelta en BD Vacutainer más el plástico K
2EDTA al mismo tiempo que se recogió para la extracción de RNA. poblaciones de células inmunes se caracterizan por citometría de flujo siguiendo los procedimientos normalizados de trabajo establecidos por el Laboratorio de Patología Clínica del Hospital Valle. Citometría de flujo se realizó utilizando un Beckman Coulter FC500 Cytomics y CXP citómetro de software. El análisis de datos se realizó utilizando el software de Kaluza de Beckman Coulter. Los reactivos para citometría de flujo se adquirieron de diversas fuentes: Anti-humano-CD11b-PECF594, anti-humano-IL8-PE, anti-humano-CD14-FITC y anti-humano-IL1β-PE de BD Biosciences; anti-humano-CD8-PE-Cy5, anti-humano-CD56-PE-Cy7, y anti-humano-CCL3-PE de eBioscience (San Diego, CA); anti-humano-CD3-ECD y anti-humano-CD45-PE-Cy7 de Beckman Coulter (Brea, CA); anti-humano-CD4-FITC y anti-humano-CD19-PE-Cy5 de Dako (Carpinteria, CA).
En el
in vitro experimentos
de co-cultivo, tinción intracelular de citoquinas fue a cabo siguiendo el protocolo de Cytofix /Cytoperm de BD Biosciences. Brevemente, se recogieron las PBMC de los experimentos de co-cultivo, se lavaron y se tiñeron para los marcadores de superficie celular. Después de la tinción de la superficie, se lavaron las células, se fijaron con Cytofix /Cytoperm y se tiñeron para CCL3 intracelular, IL8, y IL1β. Después de la tinción, las células se lavaron de nuevo antes de los análisis.
Análisis estadístico
Las diferencias en los niveles de expresión de medias entre los pacientes de cáncer y pacientes de control y los cambios en los niveles de expresión de medias a lo largo del tiempo eran evaluarse simultáneamente usando análisis de medidas repetidas de la varianza (ANOVA). Este tipo de ANOVA representa el efecto simultáneo de ambos factores en la expresión [11]. La comparación de los pacientes de cáncer y pacientes de control evalúa esencialmente el efecto de la presencia de tumores en los niveles de expresión, mientras que la evaluación de la expresión como una función del tiempo evalúa el efecto que someterse a un procedimiento quirúrgico tenía en cada paciente en el estudio.
Los valores de p ≤0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Estadísticas de software de IBM-SPSS (versión 19) se utilizó para todos los análisis estadísticos.
Resultados
Análisis inicial de plasma desde la etapa I pacientes con cáncer de pulmón para los niveles de citoquinas proteína
Para evaluar si citocinas y quimiocinas son expresados diferencialmente en el plasma de los pacientes en estadio I cáncer de pulmón (n = 15) antes y después (3-7 meses después de la operación) de la resección curativa se utilizó un inmunoensayo múltiplex humana, y los resultados se muestran en la Tabla 1. de los 30 objetivos de citoquina /factor de quimioquinas /crecimiento inmunes originales ensayadas por Luminex, los niveles de 21 metas estaban por encima del límite de detección en muestras de plasma de los pacientes de cáncer de pulmón "(Tabla 1), mientras que los niveles de expresión de 9 de las metas (Factor de Necrosis tumoral alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL17, granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias, interferón gamma) estaban por debajo del límite de detección, tanto en el preoperatorio y postoperatorio muestras (datos no mostrados).
identificación de los 5 genes para investigaciones
para corroborar los hallazgos iniciales de los 21 objetivos identificados por el ensayo Luminex, y para ayudar a definir los objetivos para una mayor investigación, se interrogaba una base de datos de microarrays previamente generado en nuestro laboratorio que compara los patrones de expresión génica en PBMCs obtenidas de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I antes y después de la resección curativa. De manera similar a los datos de proteínas, la expresión génica para la mayoría de estas 21 citocinas fue mayor antes de la resección curativa del cáncer de pulmón en estadio I, en comparación con después de la resección (Tabla 1).
Se seleccionaron cinco citoquinas para una mayor investigación por examinar los datos de proteínas de plasma de detección inicial y la base de datos de microarrays (ARNm) en paralelo, centrándose en objetivos que fueron significativamente arriba /downregulated (p & lt; /= 0,05). Como se muestra en la Tabla 1, de los cuatro citoquinas (proteínas) que fueron detectados en el plasma en los niveles más altos
antes
a la etapa I de la resección del cáncer de pulmón (CCL3 (quimiocina CC con motivo ligando 3), IL-8 (interleuquina 8), IL6 (interleucina 6), IL1β (interleucina 1 beta)), tres fueron corroborado por los datos de expresión génica PBMC de la base de datos de microarrays (
CCL3, IL8, IL1β
) en el ARNm. Del mismo modo, las dos citoquinas (proteínas) que se encontraron en los niveles más bajos
antes
a la etapa I de la resección del cáncer de pulmón (CXCL10 y IL2Rα soluble) fueron corroborados por tanto los datos de expresión génica PBMC de la base de datos de microarrays. Figura S1 representa gráficamente los resultados de proteínas plasmáticas de cribado que se resumen y las conclusiones de bases de datos PBMC de mRNA de los 5 genes seleccionados para el estudio adicional:.
CCL3, IL8, IL1β, CXCL10, España y
IL2Rα
Confirmación por RT-qPCR expresados diferencialmente de citoquinas después de la resección de la Etapa I del cáncer de pulmón
Para validar y ampliar los resultados obtenidos a partir de los datos iniciales Luminex y microarrays, la expresión génica PBMC se evaluó en cohortes mucho más grandes de los pacientes en estadio I de cáncer de pulmón (n = 62) y pacientes de control sometidos a cirugía torácica para las enfermedades benignas (n = 32). características demográficas de estos dos cohortes de pacientes se muestran en la Tabla S2.The cinco genes diana seleccionados,
CCL3, IL8, IL1β, CXCL10, España y
IL2Rα, España se investigaron aún más por el real ensayo de tiempo de RT-qPCR. De los 62 pacientes de la cohorte de cáncer de pulmón que se sometieron a la flebotomía antes de la resección, 58 habían sacado sangre para el análisis durante el período postoperatorio, al igual que 16 de los 32 pacientes del grupo control. La Figura 1 muestra los cambios relativos en la expresión detectados para los 5 genes en el postoperatorio para el cáncer de pulmón y los pacientes de control. Curiosamente, la expresión de genes CMSP para las tres citoquinas (
CCL3, IL8, IL1β
) detectado en el plasma a niveles elevados
antes
a la resección del cáncer de pulmón en el cribado inicial se consideró downregulated
después de la resección
cáncer de pulmón en todos los puntos de tiempo. Además, el mismo patrón no se detectó en los pacientes de control sometidos a cirugía torácica para las enfermedades benignas. Por último, la expresión de genes PBMC para las 2 citocinas (
CXCL10, IL2Rα
) que no fueron detectados en el plasma a niveles elevados
antes
a la resección del cáncer de pulmón durante la selección inicial no eran significativamente diferentes
después de la resección
(Figura 1). Tras el análisis de estos datos mediante ANOVA de medidas repetidas, se hace evidente que
IL8
y
IL1β
expresión se downregulated significativamente después de la resección de cáncer de pulmón en estadio I, un hallazgo que no se asocia con el efecto de cirugía torácica en pacientes sin cáncer.
CCL3
también parece ser downregulated de una manera similar, en la medida que se aproxima a la significación estadística (Figura 2). Además, la citometría de flujo de PBMCs muestra una población uniforme de subtipos de linfocitos a través de todas las cohortes de pacientes, lo que sugiere que los cambios en la expresión génica no parecen ser debido a las diferencias en la representación de células en las poblaciones de linfocitos PBMC, aunque estos datos no eliminan la posibilidad de cambios sutiles en subpoblaciones (figura S2).
La expresión de genes de citoquinas 5 seleccionados en PBMCs de cáncer de pulmón en estadio I (círculos cerrados) y el control de los pacientes no oncológicos (círculos abiertos) después de la cirugía se demuestran. Cada punto representa la media postoperatoria (+/- SEM) veces el cambio en la expresión en ese punto de tiempo designado postoperatoria en comparación con el nivel preoperatorio, expresada en log
2 escala. Los valores preoperatorios (preoperatoria) se muestran como cero para fines de referencia. Los cambios menores que cero representan regulación a la baja después de la cirugía. Para los pacientes de cáncer, el número de muestras utilizadas en los cálculos son: preoperatorio: n = 58; 3 mes: n = 48; 6 meses: n = 43; 9 meses: n = 40; 12 meses: n = 40. Para los pacientes de control, el número de muestras utilizadas en los cálculos son: preoperatorio: n = 16; 3 mes: n = 11; 6 meses: n = 9; 9 meses: n = 6; 12 meses: n = 7.
A medidas repetidas se utilizó un análisis de varianza para aislar el efecto de la presencia o ausencia de cáncer de pulmón en la expresión de
CCL3 gratis (p = 0,07),
IL8 gratis (p = 0,01),
IL1β gratis (p = 0,004),
CXCL10 gratis (p = 0,4) y
IL2Rα gratis ( p = 0,69). Cada barra representa la media (+/- SEM) veces el cambio relativo de cada uno de citoquinas que incorpora todos los datos postoperatorias en comparación con la expresión antes de la cirugía, expresada en log
2 escala. A veces el cambio relativo negativo indica regulación a la baja después de la resección del cáncer de pulmón en estadio I.
Expresión de
CCL3, IL8
y
IL1β
es mayor en PBMCs de pulmón en estadio I Los pacientes con cáncer en comparación con los pacientes sin cáncer de pulmón
para determinar si PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I tienen altos niveles de expresión de
CCL3, IL8
y
IL1β
que los pacientes sin pulmonar cáncer, se compararon los resultados de RT-qPCR de las muestras de PBMC preoperatorios del cáncer de pulmón en estadio I (n = 62) y las cohortes de control (n = 32). Como se muestra en la Figura 3, la media de expresión en pacientes con cáncer de pulmón fue significativamente más alta en relación con los controles para
CCL3
y
IL1β
(10 y 29 veces, respectivamente). Aunque no es estadísticamente significativa, la media de expresión de
IL8
era 6 veces mayor en los pacientes con cáncer de pulmón en relación con los controles. Por el contrario, aunque estadísticamente significativa,
IL2Rα
expresión fue sólo de 2 veces mayor en los pacientes con cáncer de pulmón, mientras que
CXCL10
expresión era esencialmente sin cambios. Es importante destacar que, a los tres y doce meses después de la cirugía, los niveles de expresión parecen igualar entre el cáncer y las cohortes de control (Figura 3).
A. la expresión de genes preoperatoria PBMC en pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (n = 62) en comparación con los pacientes que no tienen cáncer a ser sometidos a cirugía torácica para la enfermedad benigna (n = 32).
CCL3
: p = 0,003;
IL8
: p = 0,23;
IL1β
: p = 0,05;
CXCL10
: p = 0,55;
IL2Rα
: p = 0,01. B. Tres meses de postoperatorio expresión génica PBMC en pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (n = 48) en comparación con los pacientes sin cáncer (n = 11).
CCL3
: p = 0,79;
IL8
: p = 0,3;
IL1β
: p = 0,1;
CXCL10
: p = 0,8;
IL2Rα
: p = 0,29. C. Doce meses postoperatorios expresión génica PBMC en pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (n = 40) en comparación con los pacientes sin cáncer (n = 7).
CCL3
: p = 0,76;
IL8
: p = 0,52;
IL1β
: p = 0,87;
CXCL10
: p = 0,22;
IL2Rα
: p = 0,58. Para todos los paneles, cada barra representa la relación de la media del nivel de expresión en los pacientes de cáncer más el nivel de expresión media en los pacientes de control, expresada en log
2 escala. Un valor positivo indica que la expresión es mayor en los pacientes con cáncer en comparación con los pacientes de control. Se utilizaron dos pruebas t de muestras para determinar la significación de las diferencias en la expresión.
El perfil de citocinas de CMSP de donantes sanos Imita
in vivo
hallazgos tras la co-cultivo con cáncer de pulmón Líneas celulares
Para extender el análisis de los efectos del cáncer de pulmón en la expresión de citoquinas PBMC, se utilizó un
in vitro
sistema de co-cultivo in, tal como se describe en Materiales y Métodos. Dos líneas celulares de cáncer de pulmón humanos diferentes se usaron en las cámaras transwell inferiores: A549, una línea celular de carcinoma de pulmón que alberga una mutación K-Ras y HCC827, una línea celular de adenocarcinoma de pulmón con una mutación de EGFR (E746-A750 del). Como control adicional, también se utilizaron células NHBE benignos en las cámaras transwell inferiores. PBMCs, utilizado en los cultivos polarizados superiores, se preparó a partir de donantes sanos sin historia conocida de cáncer de pulmón.
La exposición de las PBMC de donantes sanos durante 6 y 18 horas a cualquiera A549 o HCC827 células inducidas regulación positiva de
CCL3, IL8
y
IL1β
ARNm de una manera dependiente del tiempo en comparación con el tratamiento simulado expuestas PBMC (Figuras 4A y 4B). Aunque
IL2Rα
mRNA también se reguló, la medida es mucho menor que la observada para
IL8
y
IL1β
. Por el contrario,
CXCL10
expresión no cambió o se downregulated después de co-incubación con las líneas celulares de cáncer de pulmón. Curiosamente, este patrón de expresión génica de citocinas no se observó en el co-cultivadas con las células NHBE benignos (Figura S3) PBMC. Además, las mismas capas leucocitarias utilizados para el co-cultivo de células NHBE y PBMC (que no muestra respuesta de citoquinas) también fueron expuestos a células A549 y HCC827 de cáncer de pulmón en una respuesta similar a la demostrada en la Figura 4 fue apreciado (datos no mostrados) .
líneas celulares de cáncer de pulmón fueron co-cultivadas con donante sano PBMC como se describe en Materiales y Métodos. la expresión de genes PBMC y los niveles de proteína de sobrenadante fueron evaluados para cada uno de 5 citocinas seleccionadas. expresión de genes en A. PBMC expuesto a células A549. B. expresión de genes en PBMC expuesto a HCC827 células. Para los paneles A y B, cada barra representa la media (n = 8 donantes sanos) veces el cambio relativo (+/- SEM) de células de cáncer de pulmón entre PBMC expuesta y PBMC expuestos a medio solo, expresada en log
2 escala. bares cerrados indican las 6 horas de co-cultivo, mientras que las barras abiertas indican 18 horas de co-cultivo. C. Citoquinas niveles de proteína en el sobrenadante a través de co-cultivo de las células A549 con donante sano PBMC. los niveles de proteína D. de citoquinas en el sobrenadante a través de co-cultivo de células HCC827 con donante sano PBMC. Para los paneles C y D, cada barra representa la media (n = 8 donantes sanos) veces el cambio relativo (+/- SEM) de células de cáncer de pulmón entre expuesta PBMC (18 horas de co-cultivo) y PBMC expuestos a medio solo, expresada en log
2 escala. Se utilizaron Uno pruebas t de muestras para determinar el significado de la media observada doblar cambios. En todos los paneles, un asterisco indica p & lt; 0,05. ND indica que los datos por debajo del nivel de detección.
Para evaluar los niveles de proteína de citoquinas en el sistema de co-cultivo, se recogieron los sobrenadantes tras 18 horas de co-cultivo con las líneas celulares de cáncer de pulmón, y se evaluaron utilizando el ensayo Luminex (Figuras 4C y 4D). Mientras IL8, CXCL10 y concentraciones sIL2Rα imitaban los correspondientes datos de expresión génica (Figura 4A y 4B), los niveles de CCL3 y IL1β estaban por debajo de los límites de detección en todas las muestras para ambas líneas celulares. Para hacer frente a esta falta de CCL3 detectable y IL1β en los sobrenadantes de cultivo, las PBMC se evaluó mediante citometría de flujo para detectar la presencia intracelular de CCL3, IL8 y IL1β. Como se muestra en la Figura 5A, CCL3 intracelular, IL8 y IL1β se detectaron en la fracción de CD3 + (células T) de PBMCs de donantes sanos que habían sido co-cultivadas con línea celular de cáncer o bien de pulmón, pero no en las cultivadas en ausencia de cáncer de pulmón Células. Se obtuvo un resultado similar para la fracción CD14 + PBMC (monocitos), que se muestra en la Figura 5B. Por el contrario, los (células NK) CD19 + de la fracción (células B) y CD56 + de la fracción no mostraron aumento en los niveles intracelulares de estas citoquinas (datos no mostrados).
Después de co-cultivo, las PBMC se fijaron y se evaluaron usando citometría de flujo de citocinas intracelulares (CCL3, IL8 y IL1β). Se muestra es representante de un donante sano (de 3 a cabo). A. CD3 + fracción de células. La abscisa representa la tinción de CD3, mientras que la tinción de citoquinas individuo se refleja a lo largo de la ordenada. El porcentaje de células con tinción doble se representa en la esquina superior derecha de cada subpanel. fracción de células B. CD14 +. La abscisa representa la tinción de CD14, mientras que la tinción de citoquinas individuo se refleja a lo largo de la ordenada. El porcentaje de células con tinción doble se representa en la esquina superior derecha de cada subpanel.
Discusión
El papel de las citocinas en la biología del tumor maligno humano es complejo, pero gran parte de la interacción entre las células tumorales y las células inmunitarias del huésped se piensa que es mediado por esta gran familia de proteínas y glicoproteínas [6]. Como resultado, hay un creciente cuerpo de literatura que evalúa los niveles séricos de citoquinas con respecto a las características clínico-patológicas de ambos tumores sólidos y hematológicos, incluyendo el cáncer de pulmón. Muchos de estos estudios, sin embargo, sólo se compararon los niveles de citoquinas en suero de pacientes con cáncer a los de voluntarios sanos, con el énfasis puesto en la utilidad potencial de estas mediciones como un biomarcador [12], [13].