Extracto
La activación de los receptores Notch se basa en su proteólisis intracelular por el complejo de la gamma-secretasa. Esta escisión libera el dominio intracelular de Notch (NIC) lo que permite la translocación de NIC hacia el núcleo de montar en una plataforma de la transcripción. Hay poca información disponible sobre las medidas reguladoras que operan en el NIC después de su lanzamiento desde el receptor transmembrana hasta su asociación con los socios de la transcripción. Interferir con estas medidas regulatorias podrían potencialmente influye en el resultado nuclear de señalización Notch. Este estudio también explora un modelo fiable para estudiar los eventos moleculares que ocurren posterior a la escisión NOTCH1. En las células de cáncer de páncreas, el pulso de activación NOTCH1 condujo a una mayor expresión de los genes diana NOTCH es decir HES1 y c-MYC. Hemos descubierto que, en su lanzamiento, el dominio intracelular NOTCH1, NIC1, sufre una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen la fosforilación. Lo más interesante, encontramos que la activación de la vía MEK /ERK promueve la expresión HES1. La inhibición del complejo gamma-secretasa impidió la expresión HES1 inducida por ERK MEK /lo que sugiere un mecanismo de Notch-dependiente. Por último, los niveles más altos de la NIC1 se encuentran asociados con sus socios de la transcripción [CBF1, Su (H) y GAL-1] (CSL) y cerebro tipo 1 (MAML1) tras la activación de MEK /ERK que proporcionan un mecanismo potencial por el que el MEK /ERK vía promueve la expresión de los genes diana de Notch. Por primera vez, nuestros datos expuestos una vía de señalización, a saber, la MEK /ERK vía con un impacto positivo sobre el resultado nuclear Notch.
Visto: Tremblay I, Paré E, D Arsenault, Douziech M, Boucher M-J (2013) El MEK /ERK promueve la señalización Notch en las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10.1371 /journal.pone.0085502
Editor: Irina Lebedeva V, Universidad de Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2013; Aceptado: 27 Noviembre 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tremblay et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (IC1-102949 y RP-106456 a MJB). MJB es un estudioso del Fonds de Recherche Santé Québec (FRQ-S) y miembro del financiados-S FRQ Centro de Investigación Clínica Étienne-Le Bel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los receptores Notch orquestan una serie de procesos de desarrollo además de asegurar la homeostasis de los tejidos adultos [1,2]. Esta vía de señalización altamente conservada tiene una arquitectura molecular relativamente simple. Tras la unión del ligando, los receptores transmembrana Notch (muesca 1-4) se someten a las divisiones secuenciales de ADAM-metaloproteasas y el complejo de la gamma-secretasa. Este último, bloqueado por los inhibidores de la gamma-secretasa, los estrenos de la muesca de dominio intracelular (NIC) que está libre de trasladar hacia el núcleo de colaborar con la proteína de unión al ADN [CBF1, Su (H) y GAL-1] (CSL) y el cerebro-LIKE co-activador 1 (MAML1) para modular la expresión génica. Los genes diana mejor caracterizados de la vía de Notch son sin duda los miembros del potenciador peludos de la familia SPLIT (HES), ellos mismos reguladores de la transcripción [1-3]. Una característica distintiva de la ruta de señalización Notch es por lo tanto la doble función del receptor, es decir la detección de la señal y el logro de la respuesta. Poco se sabe acerca de las medidas reguladoras que operan en el NIC después de su lanzamiento desde el receptor transmembrana a su acción transcripcional. Sin embargo, el resultado nuclear de la señalización de Notch es, muy probablemente, estrechamente controlada con el fin de asegurar la regulación precisa de la intensidad de señal y la duración. Otros estudios están por lo tanto evidente que se necesitan para desentrañar los mecanismos por los que el receptor escindido coordina la expresión génica. Además, la identificación del potencial modulador de la señalización Notch debería mejorar nuestra comprensión de esta vía simplista aparente.
señalización Notch aberrante ha demostrado desempeñar un papel importante en neoplasias hematológicas [4] y algunos tumores sólidos [2] como adenocarcinoma ductal pancreático (PDA). De hecho, se observa temprano en PDA patogénesis reactivación de la señalización de Notch y persiste a través de la progresión de la enfermedad [5-8]. secuenciación del exoma de los tejidos humanos PDA proporciona apoyo adicional de un papel crítico para la señalización Notch en la carcinogénesis pancreática [9]. Curiosamente, el bloqueo de la señalización de Notch con inhibidor de gamma-secretasa impidió la progresión de las lesiones pancreáticas premalignas a PDA en un modelo de ratón de PDA inducida por KRAS [10,11]. señalización corriente abajo Digno de mención, KRAS juega un papel crítico en la carcinogénesis pancreática como la mutación oncogénica en KRAS se encuentran en 95% de PDA [9,12]. Además, la reducción de la señalización de Notch en líneas celulares de cáncer de páncreas humano correlacionados con las tasas de proliferación reducida, aumento de la apoptosis, la disminución de crecimiento independiente de anclaje y la disminución de las propiedades de invasión [11,13-16]. Esta conexión entre la primera y la señalización RAS no es exclusivo de las células de cáncer de páncreas. De hecho, RAS y de señalización Notch, se mostró a cooperar en la promoción de la carcinogénesis en células de cáncer de mama, melanoma y leucemia [17-19]. A nivel mundial, la orientación de señalización Notch aparece una nueva estrategia terapéutica atractiva sobre todo para los pacientes con TPA [20]. Sin embargo, una mejor comprensión de la vía es crítica para el desarrollo de inhibidores y /o antagonistas eficaz de muesca ya que los inhibidores de la gamma-secretasa, aunque útiles, no son de primera específica e indiscriminadamente afectar todas las vías de señalización reguladas por el complejo gamma-secretasa además de instigar gastrointestinal toxicidad [21-23].
En este estudio, hemos explotado un modelo fiable para estudiar los eventos moleculares que ocurren después de la escisión del receptor transmembrana NOTCH1 hasta la localización nuclear del fragmento escindido NOTCH1 (NIC1). Hemos descubierto que, después de su liberación, NIC1 sufre fosforilación jerárquica en células de cáncer pancreático que se correlaciona con la expresión de los genes diana NOTCH como HES1. Lo más interesante, encontramos que la activación de la vía MEK /ERK promueve la expresión HES1 través de mecanismos de Notch-dependiente.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y procedimiento de activación de Notch
El HEK293T y las líneas celulares de cáncer de páncreas humano MIA Paca-2 y BxPC-3 se obtuvieron a partir de ATCC y se cultivaron como se describe anteriormente [24].
Para inducir un pulso de activación de Notch, agregamos ácido etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) -
N, N, N
',
N'-tetraacético
(EGTA) (4 mM) durante 15 minutos a las células en crecimiento exponencial MIA PaCa-2. EGTA se retiró a continuación mediante la sustitución de los medios de comunicación con los medios de cultivo normal fresco (DMEM).
Anticuerpos y Reactivos
El anticuerpo específico que reconoce sólo el NOTCH1 escindido (D3B8) (NIC1) se obtuvo a partir de la célula Señalización. Los anticuerpos contra (activo) ERK1 fosforilados de doble /2 (pERK1 /2), CSL, MAML1 y GAPDH se adquirieron de señalización celular. anticuerpo HES1 fue de Abcam. De anticuerpos para la detección de ERK1 Total /2 era de Santa Cruz. anticuerpos MYC y HA se obtuvieron de Roche. La gamma-secretase inhibidor de N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] - S-fenilglicina
t
butil éster (DAPT) y la MEK1 /2 inhibidor U0126 se adquirieron de Calbiochem . Todos los demás materiales eran de Sigma a menos que se indique lo contrario.
Western Blot
Como se publicó anteriormente [24], las células se lisaron en tampón Triton (1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 mM de ortovanadato, 40 mM β-glicerofosfato, fluoruro de sodio 50 mM, 10% de glicerol, 1 mM de PMSF, 0.5μg /ml de leupeptina, 1μg /ml de pepstatina y 0.5μg /ml de aprotinina) y se aclaró de restos celulares por centrifugación. La misma cantidad de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) y las proteínas se detectaron inmunológicamente después de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa.
transitorios Transfections
Los experimentos se realizaron como se describe anteriormente [24-26]. Brevemente, las células HEK293T fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. El vector que codifica una versión MYC-etiquetados del dominio citoplásmico de ratón
Notch1
(Plia-NIC1) se obtuvo de Addgene (plásmido 15131). HA-etiquetados de tipo salvaje MEK1 (MEK1 WT) y mutante constitutivamente activa de MEK1 (MEK1 CA) que codifica los ADNc fueron amablemente proporcionados por N. Rivard (Université de Sherbrooke, Canadá) y se describieron anteriormente [27]. Las células se lisaron veinticuatro horas después de la transfección y se prepararon para transferencia de western.
inmunoprecipitación, fosfatasa y Ensayos de quinasa
Las inmunoprecipitaciones se realizaron esencialmente como se describe anteriormente [25,26]. Brevemente, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, se lisaron en tampón de Triton y se aclaró de restos celulares por centrifugación. El anticuerpo primario se añadió a 2 mg de lisados de células despejadas y se incubó durante 3 horas a 4 ° C bajo agitación. NIC1 endógena se inmunoprecipitó con el anticuerpo anti-NOTCH1 escindido (NIC1) mientras que el anticuerpo anti-MYC se utilizó para immunoprecipate la NIC1 sobreexpresada (MYC-tagged). Proteína G-Sepharose (GE Healthcare) se añadió posteriormente durante 1 hora a 4 ° C bajo agitación. Los inmunocomplejos se lavaron tres veces con tampón de Triton enfriado con hielo. A partir de entonces, ya sea inmunocomplejos se desmanteladas por adición de tampón de muestra Laemmli 4X (1X = 62,5 mm Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 10% de glicerol, 1 mM de PMSF, 0,005% de azul de bromofenol y 5% β-mercaptoetanol) o utilizarse para la fosfatasa y ensayos de quinasa.
Para los ensayos de la fosfatasa, los inmunocomplejos se lavaron adicionalmente dos veces con 1X paquete NEBbuffer para Protein MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) suplementado con 1 mM de MnCl
2 y 1 mM de PMSF, 0.5μg /ml de leupeptina, 1μg /ml pepstatina y 0.5μg /ml de aprotinina. Las perlas se dividieron por igual en dos tubos Eppendorf. 400 unidades de la proteína fosfatasa lambda (New England Biolabs Inc.) se añadieron a una de ellas y los dos tubos se incubaron durante 30 minutos a 30 ° C. La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de muestra Laemmli 4X.
Para los ensayos de quinasa, inmunocomplejos se lavaron-Tritón se lavó adicionalmente dos veces con tampón de reacción ERK1 (25 mM Tris pH 7,5, 0,02 mM EGTA, 0,2 mM ortovanadato, 1 mM PMSF, 0.5μg /ml de leupeptina, 1μg /ml de pepstatina y 0.5μg /ml de aprotinina). Las perlas se dividieron por igual en dos tubos Eppendorf y se incubaron 30 minutos a 30 ° C en tampón de reacción ERK1 suplementado con 10 mM de acetato de magnesio, ATP 0,1 mM y 2μCi [γ-
32P] ATP que contiene o no 0.1μg de ERK1 activa ( Millipore). La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de muestra Laemmli 4X. Radiomarcado NIC1 se separó por SDS-PAGE y se procesa para autorradiografía.
Datos Presentación
Todos los experimentos se llevaron a cabo en al menos tres experimentos independientes. Se muestran transferencias de Western típico. Los análisis densitométricos se realizaron utilizando el software Image J 1.42.
Resultados
El calcio quelación activa el receptor de NOTCH1
Para la activación NOTCH1 oportuno estudio, que explota un modelo que permite la activación del receptor síncrono NOTCH1. Debido a la naturaleza de los receptores Notch que se componen de dos subunidades unidas de forma no covalente por interacciones dependientes de calcio [1,2], se demostró previamente que el calcio se disocia de agotamiento y activa los receptores Notch [28]. Esta estrategia se probó un método fiable para la activación de NOTCH [29-34]. Por lo tanto, se procedió a un pulso de activación de Notch mediante la exposición de las células que expresan NOTCH1 cáncer de páncreas a la EGTA quelante de calcio. Como era de esperar, a 15 minutos pulso de EGTA resultó en la escisión del receptor [28,31] que conduce a una mayor expresión de la NIC1 fragmento escindido (Figura 1A). Después de la exposición EGTA, se retiró el medio y se devolvieron las células para diferentes periodos de tiempo (es decir, 30 a 240 minutos) a su condición cultivaron normal, que contenía calcio. Se observaron aumento de los niveles de expresión de proteínas de genes diana NIC1 HES1 y c-MYC, aunque con un poco diferente perfil temporal (Figura 1A). Esta observación está de acuerdo con un reciente estudio que demuestra los perfiles de ARN distintas de Notch genes de respuesta; miembros de la
E gratis (
spl
) genes de la familia (los
Drosophila
homólogos de la humana
HES
familia) que son propias de la rapidez de su respuesta a la activación NOTCH [30].
A. se dejaron MIA PaCa-2 células sin tratar (-) o se trataron con EGTA (4 mM) durante 15 min (+). medio que contiene EGTA-fue removido y reemplazado por un medio de cultivo normal (Ca
2 +) para los períodos de tiempo indicados. Se pretrataron células de B. MIA PaCa-2 (+) o no (-) con DAPT (25μM) durante 30 min. Las células fueron entonces expuestos a EGTA (4 mM) durante 15 min (+). medio que contiene EGTA-fue removido y reemplazado por medio de cultivo normal (Ca
2 +) que contiene DMSO (-) o DAPT (25μM) durante 90 min. se dejaron C. MIA PaCa-2 células sin tratar (-) o se trataron con EGTA (4 mM) durante 15 min (+). medio que contiene EGTA-fue removido y reemplazado por los medios normales de cultivo (Ca
2 +) que contiene DMSO o actinomicina D (1μg /ml) durante los períodos de tiempo indicados. Western blot análisis se realizaron utilizando los anticuerpos apropiados.
Para apoyar los mecanismos de Notch-dependiente implicados en la expresión inducida por HES1 EGTA, que tratan previamente las células con el inhibidor DAPT gamma-secretasa, bien conocido para bloquear la escisión de Notch. El tratamiento previo de las células con DAPT impidió la NIC1 EGTA inducida, HES1 y expresiones de proteína c-myc (Figura 1B y datos no presentados) el apoyo que los impactos EGTA Hes1 expresión a través de la activación de los receptores Notch. También, la adición del inhibidor de la transcripción actinomicina D exposición siguiente EGTA no impactó significativamente en la expresión inducida por NIC1 EGTA pero impidió la expresión de HES1 y c-MYC (Figura 1C y los datos no se muestra). Tomados en conjunto, nuestros datos están en línea con lo que se ha mostrado anteriormente en otras líneas celulares [29-34] es decir, la exposición transitoria a EGTA conduce a la activación NOTCH1 por la liberación de la NIC1 dominio intracelular, lo que le permite translocan hacia el núcleo para modular la transcripción génica . Fraccionamiento subcelular confirmó que NIC1 se encuentra predominantemente en el núcleo después de la exposición EGTA (Figura S1).
NIC1 es fosforilada en células de cáncer pancreático
Curiosamente, se detectó diferentes formas de peso molecular de NIC1 después de un impulso de activación NOTCH1 por EGTA con formas principalmente de alto peso molecular observadas gradualmente con el tiempo (Figura 1A ). Digno de mención, 240 minutos después de la exposición EGTA, la expresión NIC1 volvió a niveles comparables a las células no tratadas que sugiere una rápida rotación de la NIC1 posterior a su acción transcripcional. En consecuencia, HES1, una proteína de corta duración [3], se sólo se expresa de forma transitoria, alcanzando un máximo de 90-120 minutos después de la exposición EGTA y volviendo sobre los niveles de control después de 240 minutos.
Para explicar el perfil de peso molecular diferente de la NIC1, hemos probado si NIC1 sufre modificaciones posteriores a la traducción después de su lanzamiento desde el receptor transmembrana. Más específicamente, se analizaron los niveles de fosforilación de la NIC1 en las células de cáncer de páncreas es decir, MIA Paca-2 y BxPC-3. Estas líneas celulares muestran la activación basal de los receptores de NOTCH1 como se indica mediante la expresión de la NIC1 fragmento escindido NOTCH1 (Figura 2). en crecimiento exponencial MIA Paca-2 células notables, muestran un menor nivel de activación NOTCH1 en comparación con BxPC-3. ensayos de fosfatasa revelaron que NIC1 se fosforila en MIA PaCa-2 y BxPC-3 células (Figura 2) en crecimiento exponencial. Por otra parte, la activación subsiguiente NOTCH1 EGTA inducida en MIA Paca-2, NIC1 se encuentra predominantemente en un estado fosforilado (Figura 2).
NIC1 se inmunoprecipitó (IP NIC1) a partir de lisados totales de crecimiento exponencial MIA Paca-2 (MIA), MIA Paca-2 células tratadas con EGTA (4 mM) durante 15 minutos y luego regresó a su medio de cultivo normal durante 90 min, o en crecimiento exponencial BxPC-3 (Bx). Después de inmunoprecipitación NIC1, se realizaron ensayos de fosfatasa (+), utilizando la fosfatasa lambda (λ fosfatasa). La NIC1 IP no se incubaron con la fosfatasa lambda se indica como pNIC1. Se muestra un Western blot representativo que usa un anticuerpo contra la NIC1.
En nuestro esfuerzo por identificar quinasas potenciales que modulan la fosforilación NIC1, se procedió a transfecciones transitorias en células HEK293T. Curiosamente, se observó formas de peso molecular más altos de un NIC1 exógeno cuando las células fueron co-transfectadas con una forma activa constitutiva de MEK1 (MEK1 CA) que conducen a la activación de ERK1 /2 (Figura 3A). Los ensayos de fosfatasa presentó pruebas de que NIC1 es fosforilada cuando se expresa en células HEK293T (Figura 3B izquierda, NIC1 + MEK1 WT). Sin embargo, los niveles de fosforilación NIC1 se incrementaron en gran medida cuando la vía MEK /ERK se activa por la presencia de un MEK1 CA (Figura 3B derecha). se detectaron estados de fosforilación NIC1 similares cuando las células fueron co-transfectadas con un RAS oncogénico (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la vía MEK /ERK puede influir en los niveles de fosforilación de NIC1. La ERK1 /2 son bien conocidos para fosforilar una serie de proteínas citoplasmáticas y nucleares, incluyendo reguladores de la transcripción [35,36]. Por lo tanto, hemos probado si NIC1 podría ser un objetivo directo de la ERK1 /2. Curiosamente, una ERK1 activo fue capaz de fosforilar NIC1 en
in vitro
ensayos quinasa (Figura 3C). En conjunto, nuestros resultados sugieren que NIC1 es fosforilada en células de cáncer pancreático. De acuerdo con nuestra observación de que NIC1 estados de fosforilación aumentaron con el tiempo después de la exposición EGTA tiempo que se disminuye la expresión, es tentador especular que NIC1 podría someterse a eventos de fosforilación jerárquicos después de su lanzamiento desde el receptor transmembrana que coordinan la expresión NIC1 así como la activación de la transcripción NIC1 dependiente y la atenuación. Por otra parte, como consecuencia de nuestros resultados, la posible participación de la vía MEK /ERK en la regulación de la función NIC1 sin duda merece una mayor atención.
A. HEK293T fueron transfectadas con Plia-NIC1 (MYC-etiquetados) construir junto con un ADNc que codifica una de tipo salvaje (WT) o (CA) versión constitutiva activa de MEK1 (HA-tagged). Las células se lisaron 24 horas después de la transfección. expresión NIC1 se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-myc. El nivel de expresión de la MEK1 exógeno se evaluó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-HA. los niveles de ERK1 /2 fosforilada de expresión-duales y en total se evaluaron utilizando anticuerpos específicos. La forma de peso molecular más alto inducida por CA MEK1 de NIC1 se indica con un asterisco *. B. HEK293T fueron transfectadas con Plia-NIC1 construir junto con un ADNc que codifica MEK1 WT o MEK1 CA. Las células se lisaron y NIC1 se inmunoprecipitó (IP NIC1) utilizando un anticuerpo anti-myc. Se llevaron a cabo ensayos de fosfatasa entonces (+), utilizando la fosfatasa lambda (λ fosfatasa). Las formas fosforiladas de NIC1 se denotan pNIC1. La forma de peso molecular más alto inducida por CA MEK1 de NIC1 se indica con un asterisco *. expresión NIC1 se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-myc. C. NIC1 se inmunoprecipitó (IP NIC1) de Plia-NIC1 HEK293T transfectadas utilizando un anticuerpo anti-myc. Se realizaron luego ensayos de quinasa tal como se describe en los procedimientos experimentales. Se muestra la autorradiografía que representa NIC1 fosforilada (pNIC1). Después de la electrotransferencia del gel, la cantidad de NIC1 inmunoprecipitado se confirmó mediante transferencia de western (WB) utilizando un anticuerpo anti-myc.
activación de la vía MEK /ERK promueve NOTCH señalización
Seguidamente se dirigió a si la MEK /ERK vía podría influir en la señalización de Notch en particular en nuestro modelo de células de cáncer pancreático MIA Paca-2, que muestra la expresión NOTCH1 activación /NIC1 basal, pero la activación NOTCH1 inducible (véase la Figura 1A). Digno de mención, como la mayoría de las células de cáncer de páncreas, MIA Paca-2 células albergan una mutación KRAS que conduce a la activación basal de ERK1 /2, siendo este último esencial para la proliferación celular MIA Paca-2 y la supervivencia [37]. Para estimular fuertemente y de manera sostenible la vía MEK /ERK, se trataron las células MIA Paca-2 con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Como se muestra en la Figura 4A, la adición de PMA llevó rápidamente a sostenido activación ERK1 /2, que se correlaciona con un aumento de HES1 y c-Myc los niveles de expresión de proteínas. Para asegurar que el efecto era Notch-dependiente, que tratan previamente las células con DAPT a caer expresión NIC1 (Figura 4A) y muy probablemente inhibir la escisión de los otros receptores Notch. El tratamiento previo con DAPT previno de manera significativa la expresión HES1 inducida por PMA, mientras que el impacto en c-myc fue parcial (Figura 4A). Esto podría explicarse por el hecho de que, a pesar de c-MYC se ha identificado como un NOTCH1 gen diana directa [38,39], c-MYC también se sabe que está regulada directamente por la ERK1 /2 [35,36]. Por lo tanto, podría ser posible que c-MYC se regula por ambos mecanismos Notch y ERK-dependientes en nuestro modelo. Digno de mención, en nuestro modelo, DAPT completamente derogada la expresión inducida por PMA HES1 lo que sugiere que la PMA promueve en gran medida la expresión HES1 a través de los receptores Notch en contraste con estudios previos que sugiere una regulación independiente Notch-MEK-dependiente de la HES1 [40,41].
A. MIA PaCa-2 células fueron tratadas previamente (+) o no (-) con DAPT (25μM) durante la noche. Las células fueron tratadas con PMA (100 nM) durante los períodos de tiempo indicados. se dejaron B. MIA PaCa-2 células sin tratar (-) o se trataron con EGTA (4 mM) durante 15 min (+). medio que contiene EGTA-fue removido y reemplazado por un medio de cultivo normal (Ca
2 +) que contiene DMSO, PMA (100 nM) o PMA + U0126 (10μM) para los períodos de tiempo indicados. A. y B. Las células se lisaron y los análisis de transferencia de Western se realizaron con los anticuerpos indicados. C. A partir de experimentos similares presentadas en B., una representación gráfica que representa la expresión relativa HES1, para cada período de tiempo, en las células tratadas (PMA, PMA + U0126) en comparación con las células control (tratados con DMSO) se muestra. D. A partir de experimentos similares presentadas en B., una representación gráfica que representa la expresión relativa c-MYC, para cada período de tiempo, en las células tratadas (PMA, PMA + U0126) en comparación con las células de control (tratadas con DMSO) se muestra. C. y D. Los resultados son la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,005, *** p & lt; 0,0005 en comparación con el período de tiempo correspondiente en las células tratadas con DMSO.#P & lt; 0,05, ## p & lt; 0,005, ### p & lt; 0,0005 en comparación con el período de tiempo correspondiente en las células tratadas con PMA.
Para explorar también la influencia de la activación de ERK1 /2 después de un impulso de activación NOTCH1, que añadió PMA en los medios de comunicación después de lavar a cabo EGTA. La adición de PMA promovió la HES1 inducida por EGTA y la expresión de c-myc, un efecto que fue abrogada por la presencia del inhibidor de MEK U0126 (Figura 4B-D). Vale la pena mencionar que denotamos un aumento de ERK1 /2 fosforilación que se redujo con el tiempo después de sustituir el medio de las células tratadas con EGTA con medios de cultivo normal (ver control (células tratadas con DMSO); Figura 4B). Este ligero incremento podría representar una limitación del método (que requiere la eliminación de EGTA) y sólo podría ser consecuente de la sustitución de los medios de comunicación EGTA que contiene con medio de cultivo fresco, ERK1 /2 fosforilación de ser bastante sensibles a cambio de medio. Se excluyó un papel para la señalización de Notch en la modulación de ERK1 /2 actividades porque i) el tratamiento DAPT impidió la expresión NIC1 EGTA inducida (Figura 1B), sin afectar ERK1 /2 fosforilación (datos no mostrados) y ii) la inhibición de la señalización de Notch por tratamiento DAPT no modular significativamente ERK1 /2 fosforilación (Figura 4A). Tomados en conjunto, nuestros resultados apuntan hacia una regulación positiva de la expresión HES1 Notch-dependiente por la vía MEK /ERK.
Hemos establecido que la expresión inducida por HES1 EGTA requeridos eventos de transcripción (Figura 1C) que soporta un modelo en el que la NIC1 liberado se transloca hacia el núcleo de impactar la expresión génica (
HES1
). Inherente a esta, la asociación de NIC1 con su CSL pareja de unión a ADN y el MAML1 co-activador, por lo tanto, la formación de una unidad de transcripción funcional, es sin duda un requisito previo para la modulación de genes [1,2]. Por lo tanto, para comenzar a delinear los mecanismos que dan cuenta de los efectos positivos de la vía MEK /ERK en la señalización de Notch, se investigó si la activación de la vía MEK /ERK podría promover la asociación de NIC1, ya sea con o CSL MAML1. A diferencia de NIC1, CSL y los niveles de expresión MAML1 no fueron modulados por tratamiento EGTA (Figura 5A). En consecuencia, immunoprecipitated CSL y MAML1 y probamos asociación NIC1. Después de un pulso de activación NOTCH1, se encontraron niveles más altos de NIC1 asociado ya sea con CSL o MAML1 (Figura 5B) de nuevo reforzando nuestro modelo en el que, tras la activación NOTCH1 mediada por EGTA, la NIC1 liberado se ensambla en un complejo transcripcional activo para modular la expresión génica. Curiosamente, en comparación con células tratadas con DMSO, el tratamiento con PMA promovido por casi 2 veces la asociación de NIC1 con cualquiera de CSL (Figura 5C) o MAML1 (Figura 5D). La adición de U0126 impidió tanto la NIC1 /CSL inducida por PMA y asociación NIC1 /MAML1 (Figura 5C-D) el apoyo a los mecanismos de MEK-dependientes.
MIA PaCa-2 células se dejaron sin tratar (-) o tratadas con EGTA (4 mM) durante 15 min (+). medio que contiene EGTA-fue removido y reemplazado por medio de cultivo normal (Ca
2 +) que contiene DMSO, PMA (100 nM) o PMA + U0126 (10μM) durante 90 min. A. NIC1, MAML1 y los niveles de expresión de CSL se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando los anticuerpos apropiados. B. CSL y MAML1 se inmunoprecipitaron (IP) antes de los análisis Western blot utilizando los anticuerpos indicados. C. CSL se inmunoprecipitó (IP) seguido por análisis de Western blot de NIC1 (izquierda). Una representación gráfica que representa la cantidad relativa de NIC1 co-inmunoprecipitó con CSL (NIC1 /CSL) se muestra (derecha). D. MAML1 se inmunoprecipitó (IP), seguido por análisis de Western blot de NIC1 (izquierda). Una representación gráfica que representa la cantidad relativa de NIC1 co-inmunoprecipitó con MAML1 (NIC1 /MAML1) se muestra (a la derecha). C. y D. Los resultados son la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con células tratadas con DMSO.
Discusión
De acuerdo con estudios anteriores [29-34], nuestros resultados demuestran que una exposición transitoria a EGTA es un modelo útil y confiable para la activación oportuna NOTCH1 estudio en NOTCH1- las células que expresan. De hecho, nos ha permitido descubrir que, después de la liberación del receptor transmembrana, NIC1 sufre una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen la fosforilación. También corrobora el concepto establecido con anterioridad por el que NIC1 es una proteína de corta duración [1] que, dentro de un marco de tiempo 4h, la expresión de la NIC1 recién escindida desapareció casi por completo. Junto con el aumento de expresión NIC1, modificaciones post-traduccionales y la rotación, hemos sido capaces, por primera vez, para detectar el aumento de expresión de los objetivos de NOTCH endógenos que sugieren que la expresión NIC1 EGTA inducida se traduce en una unidad de transcripción funcional en células de cáncer de páncreas. La principal novedad de nuestra investigación es la demostración de que la vía MEK /ERK promueve la expresión de HES1 objetivo de la muesca. Aunque sin duda se necesitan más estudios para determinar si los /ERK consecuencias de la activación de MEK todos o sólo un subconjunto de los objetivos de Notch, nuestros datos proporcionan evidencia de que la vía MEK /ERK fortalece la expresión HES1 probablemente a través de mecanismos dependientes de los receptores Notch porque pre tratamiento de las células con un inhibidor de gamma-secretasa (DAPT) impidió la expresión HES1 inducida por PMA. Estudios anteriores también informaron impacto de la vía RAS en señalización Notch [18,42]. Estos estudios, realizados principalmente bajo la activación del SRA prolongados o inhibición de MEK, sugirieron que la señalización RAS promueve la escisión del receptor NOTCH1 /activación. Nuestros hallazgos son innovadores ya que revelan que la vía de señalización de MEK /ERK es eficiente, minutos después de la escisión NOTCH1, influyen directamente en la NIC1 función transcripcional. Una hipótesis que surge de nuestros resultados es que la vía MEK /ERK promueve el ensamblaje de una unidad transcripcional NIC1 funcional con CSL y MAML1. Sin embargo, se necesitan más estudios para delinear los mecanismos precisos por los cuales la vía MEK /ERK promueve la señalización de Notch
.
Curiosamente, se sugirió previamente que las modificaciones posteriores a la traducción, en particular de fosforilación, es casi seguro que modulan la NIC1 dependiente la transcripción [1]. Inicialmente, en
Drosophila
[43], pero más tarde en los mamíferos, se detectó la hiperfosforilación del dominio intracelular de NOTCH1 y NOTCH2 tras su liberación del receptor transmembrana [44,45]. , La hiperfosforilación de la NIC1 se asoció con i) NIC1 acumulación nuclear de destacar [45-48], ii) la interacción con CSL NIC1 [44], iii) el aumento de CSL dependiente de la transcripción [44,47,48] y iv) la capacidad de transformación NIC1 [ ,,,0],48]. Estos resultados sugieren que la fosforilación NIC1 podría promover el potencial transcripcional del complejo NIC1 /CSL. Sin embargo, hasta la fecha, la mayoría quinasas que regulan negativamente la función NIC1 han sido identificados: se demostró AKT promover NIC1 localización citoplasmática [49], la fosforilación de la NIC1 por DYRK1A atenuada señalización Notch [50], y la fosforilación NIC1 NLK dependiente disminuyó la formación de el complejo NIC1 /CSL [51]. grupo capobianco recientemente proporcionó evidencia de que antes o durante la NIC1 /CSL /MAML1 asociación compleja, NIC1 es fosforilada por CK2 que permite el acceso a un sitio de fosforilación posterior [52]. Ambos eventos de fosforilación parecían necesarios para la disociación del complejo de ADN. Además, se cree que el complejo /CDK8 CYCC jugar un papel importante en peligro el NIC1 /CSL /MAML1 mediante la fosforilación NIC1 dentro de su dominio C-terminal PLAGAS subsiguiente ubiquitinación NIC1 mediada por Fbw7 y la degradación [53]. Sin embargo, hasta la fecha, no se han identificado los reguladores positivos NIC1 (quinasas) y casi todos los sitios de fosforilación en NIC1 no se habían determinado. Nuestros resultados proporcionan ahora la base para investigar la contribución positiva de la vía MEK /ERK en la señalización de Notch en particular en el contexto de las células del cáncer pancreático. Digno de mención, se demostró previamente que la expresión forzada de NIC1 en el epitelio de páncreas de ratón promueve la formación de lesiones pancreáticas premalignas iniciadas por un oncogénico
KRAS
[54] lo que sugiere que KRAS y Notch de señalización cooperar para promover la carcinogénesis pancreática.