Extracto
Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) son prometedores agentes terapéuticos que se utilizan actualmente en combinación con quimioterapia agentes en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Sin embargo, los mecanismos subyacentes a sus actividades antitumorales siendo difícil de alcanzar. Estudios anteriores demostraron que la inhibición de HDAC6 induce daño en el ADN y sensibiliza las células transformadas agentes antitumorales tales como etopósido y doxorrubicina. Aquí, hemos demostrado que el agotamiento de HDAC6 en dos líneas celulares de NSCLC, H292 y A549, células sensibilizadas a cisplatino, uno de los de primera línea agentes quimioterapéuticos usados para tratar el NSCLC. Hemos sugerido que el agotamiento de HDAC6 aumento de la citotoxicidad inducida por cisplatino se debió al aumento de la apoptosis a través de la activación de la vía ATR /Chk1. Además, se demostró que los niveles de proteína HDAC6 se correlacionaron positivamente con cisplatino IC
50 en 15 líneas celulares de cáncer. Por último, el agotamiento de HDAC6 en xenoinjertos de H292 prestados disminuyó el peso del tumor y el volumen y exhibió aumento de la apoptosis basal en comparación con los controles en un modelo de xenoinjerto de ratón. En resumen, nuestros resultados sugieren que HDAC6 se asocia positivamente con la resistencia a cisplatino en CPCNP y revelar HDAC6 como una potencial diana terapéutica para el CPCNP refractario platino
Visto:. Wang L, S Xiang, Williams KA, Dong H, Bai W, Nicosia SV, et al. (2012) El agotamiento de HDAC6 Mejora el daño del ADN inducida por cisplatino y la apoptosis en células de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (9): e44265. doi: 10.1371 /journal.pone.0044265
Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: May 4, 2012; Aceptado: 31 de julio de 2012; Publicado: 5 Septiembre 2012
Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud, bajo el premio número R01CA164147, subvención Nueva Investigador (09KN-17) de la Florida James y Programa Biomédica rey Esther, la concesión piloto Fundación Marsha Rivkin, Ovarian Cancer Research Fund (OCRF ), la subvención desarrollo de la carrera de H. Lee Moffitt Cancer Center de cáncer de pulmón SPORE a XZ y USF Graduate Student Fellowship éxito de la diversidad de KAW. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer
pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en los hombres y las mujeres en los Estados Unidos, reclamando más vidas al año que los próximos tres causas de muerte por cáncer (cáncer de mama, colon y próstata) combinado [1 ]. NSCLC representa más del 80% de todos los cánceres de pulmón. Las tasas de supervivencia para los pacientes con NSCLC siguen siendo extremadamente baja, con sólo el 16% de los pacientes vivos 5 años después del diagnóstico de cáncer de pulmón. Aunque este mal pronóstico se explica en parte por el gran número de pacientes que se presentan con enfermedad avanzada, incluso los pacientes identificados en una experiencia de etapa temprana altas tasas de recaídas a pesar de la resección quirúrgica adecuada [2].
Varios grandes ensayos aleatorios han demostrado mejoras modestas en la supervivencia a largo plazo con quimioterapia basada en cisplatino adyuvante [3] - [6]. Sobre la base de estos estudios, la quimioterapia adyuvante se ha convertido en el estándar de cuidado para los pacientes con estadio II y III NSCLC. Teniendo en cuenta que una población relativamente pequeña parece beneficiarse de la quimioterapia, muchos pacientes son sometidos a tratamiento tóxico sin beneficio clínico. Se requiere una mejor comprensión de los mecanismos de resistencia a la quimioterapia basada en platino y se necesitan estrategias para identificar a los pacientes con pocas probabilidades de beneficiarse del tratamiento. Nuevos métodos de superación de la resistencia de platino pueden ser dirigidos a estas poblaciones.
HDAC, una clase de enzimas que eliminan grupos acetilo de ε-N-acetil aminoácido lisina en las histonas y otras proteínas no histonas, juegan un papel importante en el crecimiento celular, apoptosis, daño en el ADN, etc. Las HDACs de mamíferos se dividen en cuatro clases: clase I (HDAC 1, 2, 3 y 8), clase II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9, y 10 ), clase III (sirts 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7), y la clase IV (HDAC11) [7], [8]. HDACs de clase I se localizan principalmente en el núcleo y se encuentran en complejos de represión, tales como Sin3, NuRD, CoREST, PRC2, N-CoR y SMRT complejos, que desacetilar histonas y otras proteínas nucleares. Las HDAC de clase II se dividen además en subclases IIa y IIb, y estos miembros exhiben expresión específica de tejido. miembros de la clase III están relacionados con el Sir2 NAD
+ - desacetilasas dependientes. HDAC11 es el único miembro de la familia de la clase IV debido a su baja similitud de secuencia con la clase I y clase II miembros.
HDAC6 pertenece a la clase IIb HDAC. Se clonó como un homólogo de mamífero de HDA1 levadura de ratón y humanos, respectivamente [9], [10]. Excepcionalmente, HDAC6 contiene dos dominios tándem deacetilasa funcionales, denominados DAC1 y DAC2, o DD1 y DD2, así como un dominio ZnF-UBP, que es una región que contiene dedos de zinc que es homólogo con el dominio no catalítico de varias proteasas específicas de ubiquitina (USPS) [11]. dominio HDAC6 ZnF-UBP es capaz de unirse mono o poli-ubiquitina, así como proteínas ubiquitinated [11] - [13]. Sustratos de HDAC6 incluyen proteínas citosólicas tales como α-tubulina, hsp90, Cortactin, etc [14] - [16]. HDAC6 también actúa en la autofagia dependiente de ubiquitina al permitir que el procesamiento o degradación de agregados de la proteína [17]. Además, HDAC6 está involucrado en misfolded proteína inducida por el estrés celular [18]. HDAC6 se considera ahora como un regulador maestro de la respuesta de las células a las agresiones citotóxicos [19]. Un informe reciente ha demostrado que HDAC6 está involucrado en agentes que dañan el ADN inducidos por el estrés genotóxico [20]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes están lejos de ser clara.
HDAC expresiones están alterados en numerosos tipos de cáncer. Por ejemplo, la sobreexpresión de HDAC1, HDAC2, HDAC3, y HDAC6 se ha observado en el colon, mama, próstata, cervical y cáncer gástrico [21] - [28]. Inhibir las enzimas HDAC de los inhibidores de HDAC se ha convertido en un enfoque prometedor para el tratamiento de tipos de cáncer [29] - [31]. inhibidores de HDAC alteran el estado de acetilación de la cromatina y otras proteínas no histonas, lo que resulta en cambios en la expresión génica, inducción de la apoptosis, la detención del crecimiento, y el terminal de la diferenciación celular [31]. En particular, los inhibidores de HDAC son prometedores fármacos adyuvantes usados en combinación con quimioterapia basada en platino en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón [32].
En este estudio, hemos demostrado que HDAC6 confiere resistencia a cisplatino en líneas celulares de cáncer. Desmontables de HDAC6 o inhibición de la actividad de HDAC6 por HDAC6-específica tubastatin inhibidor A en CPNM líneas celulares A549 y H292 sensibiliza las células para el tratamiento con cisplatino. Además, una correlación positiva y significativa entre el nivel de proteína HDAC6 y IC
50 de cisplatino se encontró en 15 líneas celulares de NSCLC. Por otra parte, H292 xenoinjertos con depleción de HDAC6 muestran más pequeño el peso del tumor y el volumen, así como aumento de la apoptosis basal en comparación con xenoinjertos de control. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el desarrollo de inhibidores selectivos de HDAC6 pertinentes clínicos será beneficioso para ser utilizado en combinación con la terapia basada en platino en el CPNM.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
una solución madre 10 mM de vorinostat (productos químicos Selleck) se preparó en dimetilsulfóxido (DMSO) y se diluyó como las concentraciones necesarias en medio de cultivo celular. Tubastatin A se adquirió de BioVision. Una solución madre 15 mM de tubastatin A se preparó en DMSO. El cisplatino y paclitaxel fueron adquiridos de Sigma. El cisplatino se preparó como una solución mM de stock 50 en dimetilformamida (DMF) y paclitaxel como una solución madre 10 mM en DMSO. Los anticuerpos contra la fosforilación de la histona H2AX (γH2AX) (20E3), ATR fosforilada (Ser428) (# 2853), fosforilada Chk1 (Ser296) (# 2349), p53 fosforilada (Ser15) (16G8), anti-ATR (# 2790), anti-caspasa 3 (8G10), PARP-1 (# 9524S), y α-tubulina (1S10) fueron adquiridos de Cell Signaling Technology, mientras que anti acetilado tubulina y anti-β-actina fueron de Sigma. Anti-Chk1 (2G1D5), anti-p53 (DO-1) y anti-HDAC6 (H-300) anticuerpos fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology.
Líneas celulares y la Generación del Scramble y HDAC6 Derribo H292 de la célula líneas
líneas celulares de cáncer ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122, H2172 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC ). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y suero bovino fetal al 10% (FBS) y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. desmontables A549 HDAC6 (A549-HD6KD) y el control (A549-SUP) líneas celulares estables fueron amablemente proporcionados por el Dr. Pang TSO-Yao como se describe por Kawaguchi et al. [18]. H292 scramble y líneas celulares estables desmontables HDAC6 fueron seleccionados por clonación de 0,5 mg /ml de puromicina. En primer lugar, H292 células fueron transfectadas transitoriamente con pRS de control de vector o vector de ARNhc contra HDAC6 (reconocer secuencia de 5-AGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGC-3 ', Identificador de tubo: TI349960, Origene) (Cat#TR20003.). Veinticuatro horas después de la transfección, se dividieron las células para duplicar las placas de 1:20 en medio RPMI1640 que contiene 0,5 mg /ml de puromicina. Puromicina se repone cada 2 días para mantener un nivel suficiente de presión de selección. Los clones individuales bien aisladas se transfirieron a placas de 24 pocillos. El efecto knockdown se verificó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-HDAC6.
MTT ensayos
El crecimiento celular y la viabilidad se evaluó por el ensayo MTT. Brevemente, las células fueron sembradas en sextuplet en placas de 96 pocillos de fondo plano a una densidad de 5 x 10
3 células /pocillo. Se añadieron los fármacos en las concentraciones indicadas de 24 h después de la siembra mientras el vehículo se añadió como control. En los días indicados, las células se incubaron con 3- (4, 5-dimethylthiszol-x-il) -2, bromuro de 5-diphenytetrazolium (MTT) solución (Sigma) durante 4 h, a continuación, suplementado con 100 l de DMSO y se agitó durante 15 minutos. La absorbancia de las culturas cisplatino expuesto se midió utilizando un espectrofotómetro de múltiples pocillos a 550 nm con una referencia de 630 nm. Los resultados se presentaron como porcentaje de absorbancia en relación con los cultivos de control de vehículo.
Ciclo Celular Análisis
H292 células se recogieron y se resuspendieron suavemente en suspensión de células individuales en la fluorescencia de células activadas Ordenando tampón (FACS) (PBS que contiene 2% de FBS). Las células se lavaron con PBS dos veces y se fijaron en etanol frío durante la noche 70%. Las células fueron lavadas dos veces con PBS frío de nuevo, se resuspendieron en 50 l de PBS más 3,3 l de solución de RNasa A (30 mg /ml) y se incubaron durante 30 min a 4 ° C. La suspensión se añadió con 450 l de tampón FACS y 25 l de yoduro de propidio (PI, 1 mg /ml), seguido de incubación a 4 ° C durante 30 minutos. Las células se analizaron a continuación con la máquina de FACS inmediatamente. Los resultados se analizaron con el software FlowJo v8.3.3.
Análisis de inmunotransferencia
extractos de células enteras se prepararon mediante la adición de tampón RIPA (Tris-HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% NP desoxicolato -40, 1% de sodio, 0,1% SDS, y la proteasa cóctel inhibidor). La concentración de proteína de todas las muestras se determinó por el reactivo de Bradford (Bio-Rad). Las proteínas se resolvieron en 8% o 12% en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpos primarios y peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (GE Healthcare). Por último, las manchas de transferencia se visualizaron usando el kit de detección quimioluminiscente (Pierce).
Comet Ensayos
Después del tratamiento con cisplatino, las células de control H292-PRS o HD6-KD se irradiaron con 10 Gy de radiación gamma para introducir fragmentos de hebras simples aleatorias. Básicamente, los más reticulaciones introducidas por el cisplatino, el menor número de hebras simples se pueden detectar en las células irradiadas. Los ensayos cometa se realizaron utilizando un kit de OxiSelect ™ Comet Assay (Cell Biolabs, Inc.) según el protocolo del fabricante.
Inmunofluorescencia microscopía
Las células cultivadas en portaobjetos de cámara (cámara Lab-System Slide TekII) se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente. La fijación se detuvo con PBS que contiene 1% de glicina. Las células se permeabilizaron usando solución X-100 1% de glicina /0,5% de Triton a temperatura ambiente durante 15 min. Después de bloquear con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 h, se incubaron las células en PBS que contenía 0,2% de Triton X-100, 1% de BSA, y el anticuerpo anti-γH2AX (20E3) durante la noche a 4 ° C. Después, las células se lavaron con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween) seguido de incubación con anticuerpo secundario (en PBS que contenía 1% BSA) durante 45 min. Finalmente, las células se lavaron con PBS que contiene 0,1% de Tween y luego PBS solo. Los portaobjetos se secaron y se montaron con Vectashield® medio que contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Montaje
Colonia ensayo de formación de
resumen, las células se sembraron por triplicado (1.000 células por 60 mm placa de cultivo de tejidos) y se incubaron durante la noche a 37 ° C permitiendo que las células se unan a los platos. Las células se trataron luego con control de vehículo o cisplatino durante 8 días. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min, y se tiñeron con violeta cristal (0,5% de cristal violeta, 1% de paraformaldehído y 20% de metanol en PBS) durante 30 min. Las colonias sobre cada placa se contaron y la supervivencia celular después del tratamiento con cisplatino se expresó como un porcentaje del número de colonias supervivientes en las placas de control.
crecimiento tumoral
Todos los procedimientos con los ratones se realizaron bajo una protocolo titulado: Papel de HDAC6 en la resistencia de platino de células no pequeñas de cáncer de pulmón que fue aprobado por un Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional (IACUC) en la División de Investigación de Integridad y cumplimiento de la Universidad del Sur de Florida en 10/19/2011 (Protocolo#R4064). El 5 a 6 semanas de edad, los ratones hembra desnudos atímicos (nu /nu) con un peso de ~ 20 g se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Se inyectaron células de control H292-PRS (5 × 10
6 células /100 l en medio RPMI 1640 más 50% de Matrigel) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo y la misma cantidad de células H292-HD6KD en el flanco derecho. Los tumores se dejaron crecer durante seis semanas. tamaños de los tumores se registraron cada semana. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = (L x W
2) x 0,5 (V = volumen, L = longitud, W = ancho) [33]. El peso medio del tumor también se calculó después de cosechar los tumores.
tinción inmunohistoquímica
H292 control y xenoinjertos de HDAC6 desmontables se recogieron y se fijaron en formalina, a continuación, se incluyeron en parafina y se seccionaron. microarrays de tejidos de 12 xenoinjertos de H292-PRS y pares H292-HD6KD fueron preparados por facilidad de la base histología Moffitt usando Beecher Instrumento Arrayer tejido. Los portaobjetos se tiñeron utilizando un sistema de Ventana Descubrimiento XT automático (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) según el protocolo del fabricante con los reactivos de propiedad. En pocas palabras, las diapositivas se deparaffinized en el sistema automatizado con solución EZ Prep (Ventana). método de recuperación de antígeno inducida por calor se utilizó en la célula acondicionado 1 (Ventana). El anticuerpo primario de conejo que reacciona a la caspasa 3 escindida, (# 9661, Cell Signaling, Danvers, MA) o Ki67 (# M3060, Spring Bioscience) se utilizó a una concentración 1:400 o 1:100 en diluyente de anticuerpo Dako (Carpenteria, CA) y se incubó durante 60 min. El anti-anticuerpo secundario de conejo Ventana se utilizó para 16 min. El sistema de detección utilizado fue el kit Ventana OmniMap y diapositivas fueron counterstained con hematoxilina. Las diapositivas fueron deshidratados y coverslipped según el protocolo normal de laboratorio.
A los microarrays de tejidos (TMA) muestra teñida contra la caspasa 3 escindida ha sido digitalmente escaneada utilizando la Aperio ™ (Vista, CA) XT ScanScope con una 200x /0.75 NA lente del objetivo a un ritmo de 4 minutos por portaobjetos a través de Basler tri-lineal-matriz. Análisis de imágenes se realizó utilizando un algoritmo optimizado Aperio PositivePixelCount ® v9.0 con los siguientes umbrales optimizados [HueValue = 0,1; HueWidth = 0,5; Iwp (alta) = 220; Iwp (bajo) /Ip (alta) = 175; Ip (bajo) /ISP (alta) = 100; ISP (baja) = 0; Inp (alta) = -1] para segmentar píxeles positivos de diversas intensidades. El porcentaje de positividad se ha cuantificado por el número de células que presentan tinción positiva como un porcentaje del recuento total de células tumorales. La intensidad de la tinción fue thresholded como parametertized anterior en negativo (0), baja (1+), moderada (2+) y fuerte positivo (3+) por la densidad de la mancha media (0-255 rango dinámico) para cada núcleo TMA. El algoritmo de entrenamiento desarrollada fue la calidad controlada por un patólogo practicar.
Análisis estadístico
Todos los ensayos se realizaron por lo menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± SEM, y las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de Dunnet. Un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. coeficiente de Spearman y
p-valor
para la correlación entre el nivel de HDAC6 y cisplatino IC
50 fueron calculados por el software de SAS.
Resultados
HDAC6 se asocia con cisplatino la citotoxicidad inducida en líneas celulares de NSCLC
Para caracterizar el papel de HDAC6 en la resistencia al cisplatino, se establecieron dos pares de líneas celulares de HDAC6 desmontables de H292 y A549 (Figura 1A y 1D). La citotoxicidad del cisplatino en el control y HDAC6 pares desmontables (H292 y H292-PRS-HD6KD; A549-A549-Sup y HD6KD) se midieron mediante ensayos de MTT. Como se muestra en la Figura 1B y 1E, las células A549 y H292 empobrecido de HDAC6 visualizan aumentada su citotoxicidad después del tratamiento con cisplatino durante 3 días, en comparación con los de las células de control. Para determinar el efecto a largo plazo de HDAC6 caída en la supervivencia celular, se realizaron ensayos de formación de colonias. Como se muestra en la Figura 1G y 1H, el agotamiento de HDAC6 disminuyó significativamente el número de formación de colonias en células H292 por tratamiento con cisplatino. Curiosamente, desmontables de HDAC6 no aumenta la citotoxicidad paclitaxel inducida en las células A549 y H292, lo que sugiere que el aumento de la sensibilidad a cisplatino por el agotamiento de HDAC6 era específica de drogas (Figura 1C y 1F). Para examinar si el agotamiento de HDAC6 puede volver a sensibilizar las células resistentes a cisplatino, línea celular C13, una línea celular de cáncer de ovario resistente a cisplatino derivado de OV2008 [34], se transfectó de forma estable con control o HDAC6 shRNA para establecer líneas celulares de HDAC6 desmontables control y. Como se muestra en la Figura S1, el agotamiento de HDAC6 en células C13 reduce drásticamente el cisplatino IC
50 en comparación con las células de control. Con el fin de ampliar nuestros hallazgos, que mide el nivel de HDAC6 y cisplatino IC
50 en 15 líneas celulares de cáncer. Como se muestra en la Figura 1I y S2, el nivel de proteína HDAC6 correlacionó positivamente con cisplatino IC
50. El coeficiente de Spearman (0,64875) y
p-valor
(0,0089) sugirieron que esta correlación fue estadísticamente significativa. A continuación pregunta si el agotamiento de HDAC6 en las células no transformadas podría sensibilizar a las células al cisplatino. Como se muestra en la figura S3, cisplatino IC
50 se redujo significativamente en fibroblastos de embriones de HDAC6 knockout (MEFs) en comparación con MEFs de tipo salvaje. En general, nuestros resultados indican que HDAC6 confiere resistencia a cisplatino.
, H292 células fueron transfectadas con shRNA scramble o shRNA contra HDAC6 para generar H292-H292-PRS o HD6KD clon estable, respectivamente. HDAC6 expresión en el control (H292-PRS) HDAC6 o desmontables células (H292-HD6KD) fue detectado por el anti-HDAC6 Western Blot análisis (panel superior). Western Blot anti-β-actina se realizó para garantizar la igualdad de carga de proteínas (panel inferior). B, desmontables de HDAC6 sensibilizado H292 al tratamiento con cisplatino. ensayos de MTT se realizaron utilizando H292-PRS o células H292-HD6KD expuesto a control de vehículo (0 M cisplatino) o indicado concentraciones de cisplatino durante 3 días. C, desmontables de HDAC6 no sensibiliza a las células H292 tratamiento con paclitaxel. MTT ensayos se realizaron con células tratadas con vehículo de control (0 nM paclitaxel) o indique concentraciones de paclitaxel durante 3 días H292-H292-PRS o HD6KD. D, HDAC6 se agota de manera eficiente en las células A549. expresión HDAC6 en control (A549-Sup) o células de HDAC6 desmontables (A549-HD6KD) se detectó por análisis de transferencia Western anti-HDAC6 (panel superior). También se realizó el análisis de Western blot anti-β-actina para asegurar la igualdad de carga (panel inferior). E, desmontables de células A549 HDAC6 sensibilizados a tratamiento con cisplatino. MTT ensayos se realizaron con células tratadas con el control del vehículo o concentraciones indicadas de cisplatino durante 3 días A549-A549-Sup o HD6KD. F, desmontables de HDAC6 no sensibilizar a las células A549 a tratamiento con paclitaxel. ensayos de MTT se realizaron con células tratadas con vehículo de control o concentraciones indicadas de paclitaxel durante 3 días A549-Sup o A549-HD6KD. G, los ensayos de formación de colonias se llevaron a cabo con células H292-PRS y H292-HD6KD durante 8 días con vehículo de control (0 M cisplatino) o indicado concentraciones de cisplatino. H, Los resultados cuantitativos se obtuvieron mediante el cálculo de las colonias de G.
Columnas, significa partir de tres o seis duplicados; bares, SEM (*, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001)
. I, los niveles de HDAC6 correlacionan positivamente con cisplatino IC
50 en un panel de líneas celulares de cáncer. los niveles de proteína HDAC6 se obtuvieron mediante análisis de transferencia de Western de 15 líneas de NSCLC (ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 y H2172) y se cuantificaron mediante Cantidad Uno software. El cisplatino IC
50 se calcula a partir de ensayos de MTT después del tratamiento de estas células durante 3 días. La correlación entre el nivel de la proteína HDAC6 y cisplatino IC
50 fue analizada por el software SAS. Un gráfico de puntos se utiliza para ilustrar la correlación positiva entre el nivel de HDAC6 y cisplatino IC
50. coeficiente de Spearman fue 0,64875 y
p-valor
fue 0,0089.
El agotamiento de HDAC6 aumenta la apoptosis inducida por cisplatino-
Para determinar si desmontables de HDAC6 aumentada su citotoxicidad cisplatino es debido a la apoptosis de las células, se examinó la escisión PARP1 en H292 y H292-pRS-HD6KD par. Como se muestra en la Figura 2A, PARP1 escindido fue elevado en las células H292-HD6KD en comparación con la de las células H292-PRS después de 5 mM o 10 mM tratamiento con cisplatino. Además, como se muestra en la Figura 2B, la banda PARP1 escindido apareció antes (día 1) en células H292-HD6KD en comparación con células de control (día 2). Resultados similares se obtuvieron utilizando el tipo salvaje y HDAC6 nocaut MEFs par (figura S4) y A549 y A549-Sup-HD6KD par (datos no mostrados). Para confirmar nuestros resultados, la citometría de flujo se utilizó el análisis para detectar la población de apoptosis en las células expuestas a cisplatino. Como se muestra en la Figura 2C y 2D, la población sub-G1, que indica las células apoptóticas [35], se incrementó dramáticamente en las células H292-HD6KD comparación con las células H292-PRS expuestos a cisplatino 5 o 10 mM. Por lo tanto, el agotamiento de HDAC6 aumento de la apoptosis inducida por cisplatino. Para examinar si la apoptosis fue dependiente de la caspasa 3, detectamos los niveles de caspasa 3 escindida en células H292-HD6KD expuestos a cisplatino H292-PRS o. Como se muestra en la Figura 2E, los niveles de caspasa 3 escindida se incrementaron en las células HD6KD cuando se exponen a 1, 5 o 10 cisplatino mu M, en comparación con las células de control. En general, nuestros resultados sugieren que el agotamiento de HDAC6 aumenta la apoptosis dependiente de caspasa en el tratamiento de cisplatino en células de NSCLC.
, H292-PRS o células H292-HD6KD se trataron con las concentraciones indicadas de cisplatino durante 24 horas. Anti-PARP1 y análisis de transferencia Western anti-beta-actina se llevaron a cabo. B, H292 y H292-PRS-HD6KD células fueron tratadas con 5 mM cisplatino para los días indicados. Se realizaron anti-PARP1 y análisis de transferencia Western anti-beta-actina. C, la población sub-G1 se determinó en células H292-HD6KD tratados con vehículo (0 M cisplatino) o cisplatino mediante análisis FACS H292-PRS o. CDDP representa cisplatino. D, presentación cuantitativa de los porcentajes de células en fase sub-G1 de C. E, células H292-H292 HD6KD-PRS o se trataron con dosis indicada de cisplatino, y la caspasa 3 y los análisis de transferencia Western anti-β-actina fueron anti-escinde realizado.
Desmontables de HDAC6 exacerba daño del ADN inducida por cisplatino
Para explorar las funciones de HDAC6 en el daño del ADN inducida por cisplatino, H292 y H292-pRS-HD6KD fueron examinados por sola célula ensayo cometa, una técnica estándar para evaluar el daño del ADN. Después del tratamiento con cisplatino, tanto las células se expusieron a 10 Gy de radiación ionizante para inducir roturas de la cadena al azar individuales (indicada por colas de los cometas). La eficacia de la reticulación inducida por cisplatino fue mostrado por el acortamiento de las colas de los cometas [36]. Como se muestra en la figura 3A, a la izquierda dos paneles, después de irradiación se observaron cometas distintas similares tanto en las células de control y HD6KD expuestos al control del vehículo. Sin embargo, tras el tratamiento con cisplatino, se observaron colas más acortadas en las células HD6KD en comparación con las células control (Figura 3A, derecha dos paneles), lo que sugiere que el agotamiento de HDAC6 sensibilizado H292 células al daño del ADN inducida por cisplatino. El análisis cuantitativo de la prueba del cometa se muestra en la Figura 3B. El cisplatino también puede estimular la fosforilación de H2AX en serina 139 (γH2AX) cuya formación de focos se puede utilizar para analizar los daños del ADN [37] - [39]. Por ello, utilizó la tinción de inmunofluorescencia para determinar la formación de focos γH2AX. Después del tratamiento con cisplatino, más focos γH2AX se identificaron en células H292-HD6KD comparación con las células control (Figura 3C). Los focos en el núcleo se clasificaron en tres grupos: Foci & gt; 20, Foci = 1~20 y focos = 0. El porcentaje de células que caen en los tres grupos anteriores se cuantificaron. Como se muestra en la Figura 3D, un mayor porcentaje de células HD6KD tratados con cisplatino pertenecían a los focos & gt; 20 grupo, en comparación con la de las células de control, lo que sugiere que el agotamiento de HDAC6 estimuló el daño del ADN inducida por cisplatino. Del mismo modo, en A549-Sup y HD6KD o C13-RP y pares HD6KD, más focos & gt; 20 grupo se encuentra en las células de HDAC6 desmontables (datos no mostrados). En consonancia, el análisis de transferencia Western mostró que los niveles de γH2AX sobre 5 o 10 mM tratamientos cisplatino fueron mayores en células H292-HD6KD en comparación con células de control H292-PRS (Figura 3E). Además, los niveles γH2AX fueron mayores en desmontables células H292 HDAC6 expuestos a cisplatino 5 M durante 1, 2 y 3 días en comparación con las células control (Figura 3F). Resultados similares se observaron también en el control A549 y A549 par desmontables HDAC6 (Figura S5). A continuación utiliza inhibidores farmacológicos tales como vorinostat (pan-inhibidor de HDAC) y tubastatin A (inhibidor selectivo HDAC6-) para validar que la supresión de la actividad HDAC6 aumenta el daño del ADN inducida por cisplatino en las células NSCLC. Como se muestra en la figura 4A y 4B, co-tratamiento de vorinostat y cisplatino aumentó drásticamente los niveles de γH2AX en células A549 o H292 en comparación con las células tratadas con cisplatino o vorinostat solo. Los resultados similares se obtuvieron también en las células A549 y H292 utilizando tubastatin A para reemplazar vorinostat (Figura 4C y 4D). Tanto vorinostat y tubastain A puede aumentar drásticamente los niveles de tubulina acetilada, lo que sugiere que la actividad fue HDAC6 inhibe eficazmente. Curiosamente, la apoptosis se detectó como la PARP1 escindido en células H292 tratadas con cisplatino y vorinostat en combinación o cisplatino y tubastatin A en combinación, pero no en las células A549 (Figura 4). Estos datos sugieren que las células H292 son más sensibles a estos fármacos que las células A549. los niveles de proteína HDAC6 se vieron afectados por el tratamiento farmacológico (Figura 4). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la inhibición de la actividad de HDAC6 sensibiliza el daño del ADN inducida por cisplatino.
células A, H292-PRS o H292-HD6KD fueron tratados con vehículo (0 M cisplatino) o cisplatino durante 24 horas, a continuación, irradiados con 10 Gy de radiación gamma para introducir fragmentos de hebras simples aleatorias. Se llevaron a cabo ensayos de Comet como se describe en los métodos. B, el ADN no reticulado fue evaluado por un software de alta capacidad Lados Analysis System (HCSA) (Coats Associates, Inc.).
Columnas, quiere decir a partir de 40 células individuales; bares, SE (***, P & lt; 0,001): perfil C, tinción de inmunofluorescencia de γH2AX focos en células H292-HD6KD tratados con vehículo (0 M cisplatino) o cisplatino H292-PRS o como se indica.. D, la representación cuantitativa de γH2AX focos en células anteriores.
Columnas, quiere decir a partir de 600 células.
E, H292 y H292-PRS-HD6KD se trataron con las concentraciones indicadas de cisplatino durante 24 horas, y anti-γH2AX y anti-β-actina análisis de transferencia Western fueron entonces realizado. F, Las células anteriores fueron tratados con vehículo o 5 M cisplatino para los días indicados y anti-γH2AX y análisis de transferencia Western anti-β-actina se llevaron a cabo.
, las células A549 fueron tratados con el control del vehículo , cisplatino solo, vorinostat solo, o cisplatino y vorinostat en combinación durante 24 horas, a continuación, anti-γH2AX, anti-acetilado tubulina, se realizaron anti-PARP1, anti-HDAC6, y los análisis de transferencia Western anti-beta-actina. B, H292 células fueron tratadas con el control del vehículo, cisplatino solo, vorinostat solo o cisplatino y vorinostat en combinación durante 24 horas, a continuación, anti-γH2AX, anti-acetilado tubulina, anti-PARP1, anti-HDAC6, y anti-β-actina Western se realizaron análisis Blot. La punta de flecha indica la banda PARP1 escindido. C, las células A549 se trataron con control de vehículo, cisplatino solo, tubastatin A solo o cisplatino y tubastatin A en combinación durante 24 horas, a continuación, anti-γH2AX, anti-acetilado tubulina, anti-PARP1, anti-HDAC6 y anti-β-actina se realizaron análisis de transferencia de Western. D, H292 células se trataron con control de vehículo, cisplatino solo, tubastatin A solo o cisplatino y tubastatin A en combinación durante 24 horas, y anti-γH2AX, anti-acetilado tubulina, anti-PARP1, anti-HDAC6 y anti-β-actina se realizaron análisis de transferencia de Western. La punta de flecha indica la banda PARP1 escindido.
Desmontables de HDAC6 Aumenta la fosforilación de daño del ADN proteínas de señalización Tras el tratamiento con cisplatino
Los principales sensores moleculares de daño en el ADN incluyen ATM (ataxia telangiectasia mutada) y ATR (ataxia telangiectasia y relacionado con Rad3) [40], [41]. En respuesta al daño del ADN, estas quinasas se reclutar y activar otras proteínas de señalización, tales como Chk1 y Chk2, induciendo la detención del ciclo celular o apoptosis. Todas estas quinasas, ATM, ATR, Chk1 y Chk2 pueden fosforilar y activar p53 que conduce a las células sometidas a la apoptosis después de daño en el ADN. Para determinar si la reducción de HDAC6 podría mejorar la señalización después del tratamiento con cisplatino daño en el ADN, se probaron las proteínas clave. H292 y H292-PRS-HD6KD fueron tratados con vehículo (0 M cisplatino) o cisplatino durante 24 horas.