Extracto
La variante del gen plasmocitoma translocación 1 (
PVT1
) es un lncRNA que ha sido designado como un oncogén debido a su contribución al fenotipo de múltiples tipos de cáncer. Aunque el mecanismo por el cual
influye PVT1
procesos de la enfermedad se ha estudiado en múltiples tipos de cáncer, su papel en la tumorigénesis cervical sigue siendo desconocido. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para investigar el papel de
PVT1
en el cáncer cervical
in vitro
y
in vivo
.
PVT1
expresión se midió por PCR cuantitativa (qPCR) en 121 muestras cervicales invasivos de carcinoma (ICC), 30 muestras normales del cuello uterino, y las líneas de células del cuello uterino. Los ensayos funcionales se realizaron utilizando tanto siRNA y desmontables LNA mediada para examinar los efectos
PVT1 '
s sobre la proliferación de células de cáncer cervical, la migración y la invasión, la apoptosis y la resistencia a cisplatino. Nuestros resultados demuestran que
PVT1
expresión es significativamente mayor en el tejido de la CPI contra el cuello uterino normal y que una mayor expresión de
PVT1
se correlaciona con peor supervivencia global. En líneas celulares de cáncer de cuello uterino,
PVT1
caída resultó en una disminución significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión, mientras que la apoptosis y la citotoxicidad cisplatino se incrementaron significativamente en estas células. Finalmente, se muestra que
PVT1
expresión se ve aumentada en respuesta a la hipoxia y la estimulación respuesta inmune y que esta lncRNA asociados con la proteína multifuncional y de respuesta al estrés, nucleolina. En conjunto, nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia de un papel oncogénico de
PVT1
en el cáncer de cuello uterino y dar información sobre los mecanismos potenciales por los cuales
PVT1
sobreexpresión ayuda a impulsar la carcinogénesis cervical.
Visto : Iden M, Fye S, Li K, T Chowdhury, Ramchandran R, Rader JS (2016) el lncRNA
PVT1
contribuye al cáncer de cuello del útero Fenotipo y Asociados con el pronóstico del paciente pobre. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10.1371 /journal.pone.0156274
Editor: Bibekanand Mallick, Instituto Nacional de Tecnología, Rourkela, India
Recibido: 15 de agosto de 2015; Aceptado: 11-may de 2016; Publicado: 27 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Iden et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Salud de la Mujer en el Colegio Médico de Wisconsin (http://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en ninguna parte de la preparación de este manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ARNs no codificantes largo ( lncRNAs) proporcionan objetivos importantes para el diagnóstico del cáncer y la terapéutica debido a su papel fundamental en numerosos procesos celulares, tales como cambios epigenéticos, potenciador del gen supresor de tumores y la actividad, y el secuestro de miRNA. LncRNAs son omnipresentes en el genoma, con frecuencia muestran de tipo celular y la regulación temporal específica de la expresión génica, y pueden influir en muchos procesos celulares a través de múltiples mecanismos dispares [1]. Plasmocitoma variante translocación 1 (
PVT1
) es un muy conservadas lncRNA ~ 50 kb aguas abajo de
MYC
que ha atraído una atención significativa desde el campo del cáncer debido a su frecuente co-amplificación con
MYC
en varios tumores sólidos [2]. Los primeros estudios que prueban que los
PVT1
puede contribuir a la carcinogénesis demostraron translocaciones frecuentes en plasmacitoma de ratón [3,4] y los linfomas de Burkitt humanos [5-7]. Los efectos oncogénicos de
PVT1
se han destacado más por estudios más recientes que demuestran su sobreexpresión y amplificación en múltiples tipos de cáncer [8-17]. Más importante aún,
PVT1
expresión se ha correlacionado significativamente con las características clínicas, tales como el riesgo, la recurrencia y la supervivencia en varios tipos de cáncer [8,11-13,18].
A pesar de la riqueza de conocimientos respecto a las propiedades oncogénicas de
PVT1 Hoteles en múltiples tipos de cáncer, se sabe muy poco acerca de su función biológica precisa. De hecho, el puñado de los estudios que proporcionan
PVT1
datos de mecanismos muy sugieren que ejerce sus efectos en un tipo de célula y /o la forma específica de la enfermedad. Por ejemplo,
PVT1
función se ha atribuido a su unión y estabilización de la Myc [19] y NOP2 [17] en las proteínas de mama y carcinoma hepatocelular, respectivamente. En células de cáncer gástrico,
PVT1
actúa para reprimir la expresión de p15 y p16 a través de su interacción física con la proteína del grupo Polycomb, EZH2 [20]. También a través de la contratación y la regulación de los receptores de la hormona estimulante de la tiroides EZH2,
PVT1
induce la proliferación de células de cáncer de tiroides [21]. Por último, el análisis computacional de
PVT1
sugiere que puede actuar mediante la unión y el secuestro de miembros de la familia miR-200 en el tejido de cáncer de mama [14]. Debido a su complejidad y amplitud de los resultados, estos estudios hacen hincapié en la importancia de la investigación específica de la enfermedad de
mecanismos PVT1
.
Nuestro interés en
PVT1
originó a partir de nuestro trabajo y demostrando de otros que es un sitio frecuente de integración HPV en cáncer de cuello uterino, lo que sugiere una importante función biológica [22-24]. Por lo tanto, hemos tratado de definir mejor el papel de los
PVT1
en la carcinogénesis cervical mediante el examen de
PVT1
patrones de expresión en tumores de cáncer de cuello uterino y las líneas celulares y los efectos funcionales de este lncRNA en los procesos relacionados con el cáncer tales como la proliferación, la motilidad celular, la apoptosis y la quimiorresistencia. Por último, debido a que muchos lncRNAs se basan en proteínas asociados para llevar a cabo sus efectos, se empleó cromatografía de afinidad ARN y secuenciación de espectrometría de masas para dilucidar células específicas de cáncer de cuello uterino
PVT1
parejas de unión.
el protocolo de estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional del Colegio Médico de Wisconsin IRB (PRO00011466; Caracterización molecular del cáncer de cuello del útero).
cultivo de células
SiHa (ATCC® HTB35 ™), HeLa (líneas cervical humano ATCC® CCL2 ™), y DoTc2 4510 (ATCC® CRL-7920 ™) de células de cáncer y VPH 16 E6 /E7 transformadas, las células normales exocervicales (Ect1 /E6E7; ATCC® CRL-2614 ™ ) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células de cáncer cervical se mantuvieron en ya sea mínimo medio de Eagle Esencial (EMEM; SiHa y HeLa) o Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (MEM; DoTc2) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS; ATCC). Ect1 /E6E7 células se mantuvieron en medio libre de queratinocitos de suero (GIBCO) con 0,1 ng /ml de EGF humano recombinante, 0,05 mg /extracto de pituitaria bovina ml, y adicional de cloruro de calcio 44,1 mg /L. La ATCC autentica todas las líneas celulares mediante el examen de sus perfiles de ADN repetición corta en tándem (STR). Las células se mantuvieron a 37 ° C en alta humedad con una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO
2. Las células se recogieron usando tripsina-EDTA (0,25% tripsina, EDTA 0,53 mM; ATCC) y se contaron usando azul de tripano al 0,4% Solución (Amresco, Solon, OH) y cámara de recuento hemacitómetro. Para algunos experimentos, cisplatino (1 mM; Sigma, St. Louis, MO) se reconstituyó en agua destilada y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. Las células se expusieron a cisplatino a una concentración de 10 mM, 50 mM y 100 mM en el medio de crecimiento durante 4 horas en medio de cultivo. medios de cultivo que contienen cisplatino se retiró y se reemplazó con medio de cultivo fresco 4 h más tarde y las células se incubaron a 37 ° C durante la noche. Para los experimentos de investigación de
PVT1
expresión siguiente hipoxia y la estimulación respuesta inmune, las células SiHa fueron tratados respectivamente con cloruro de cobalto (150 M; Sigma) o interferón alfa (IFN-α; 10 M; Sigma) durante 48 h antes de la La extracción de RNA (siguientes métodos). Por último, otras células SiHa se trataron con ciclohexamida (10 M; Sigma). Para diferentes puntos de tiempo antes de ser sometida a la lisis para transferencia Western Myc
transfecciones
Las células (2,0 x 10
5) células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células fueron transfectadas con 2 pequeños ARN de interferencia (siRNA) diseñado contra
PVT1
combinado en una relación equimolar (20 o 40 nM; FlexiTube Hs_PVT1_5 y Hs_PVT1_6; Qiagen, Valencia, CA) o un control negativo siRNA (AllStar control negativo; Qiagen) conjugado con Alexa Fluor 488. las transfecciones se llevaron a cabo usando DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) por las instrucciones del fabricante. La eficacia de transfección fue monitorizada a través de microscopía de fluorescencia y se confirmó mediante PCR cuantitativa (qPCR) 48 h después de la transfección. transfecciones siRNA se realizaron en ambas líneas celulares cervical SiHa y HeLa y se utilizan en la proliferación, la apoptosis y la muerte celular, y los ensayos de migración y la invasión.
Para el ácido nucleico bloqueado (LNA) de oligonucleótidos transfecciones, las células (2,0 x 10
5) se sembraron en una placa de 6 pocillos y el día siguiente se transfectaron con 10 nM PVT1_10 o PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, MA) o un control mezclado LNA (control negativo a, Exiqon) utilizando DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) a una concentración de 0,2 l por 100 l medio de crecimiento. Las secuencias de PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA y el Control Negativo A son 5'-AACACGTCTATACGC-3 ', 5'-AGATCACTGTAAATCC-3' y 5'-GGCAGGATCTATGGCA-3 ', respectivamente. el medio de transfección se reemplazó con medio de crecimiento nuevo 24 h después de la transfección y los ensayos de aguas abajo realizan 48 h más tarde. Se utilizaron células SiHa LNA transfectadas para confirmar los efectos de los siRNA transfección en la proliferación celular, para determinar los efectos de
PVT1
caída en la capacidad de respuesta de cisplatino, los experimentos de degradación Myc, y efectos sobre la expresión mRNA nucleolina-dependiente.
El aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y la PCR cuantitativa (qPCR)
se aisló el ARN utilizando mirVana miARN Kit de aislamiento (Ambion, Austin, TX) y el ADNc sintetizado utilizando ARN de alta capacidad a cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para algunos experimentos, viven las células cultivadas se lavaron con 1 x PBS y se separaron en porciones de ARN citoplásmico y nuclear mediante el uso de detergentes no iónicos siguientes las instrucciones del kit de París (Life Technologies). Se aisló ARN de cada porción y DNasa tratada usando ADN libre Kit (Life Technologies). La expresión de
PVT1
,
MYC
y control
RPS18
se evaluó mediante qPCR EvaGreen Mastermix (MidSci, St. Louis, MO) en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus ( Life Technologies). El programa de ciclo térmico incluye una etapa inicial de activación de enzimas a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos que consisten en una etapa de desnaturalización de 10 seg a 95 ° C, y una etapa de hibridación /extensión 1 min a 60 ° C para todos los cebadores. La intensidad de fluorescencia se midió a 62 ° C al final de cada ciclo. Cebadores directos e inversos para
PVT1
fueron 5'-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 'y 5'-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3', 5'-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 'y 5'-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3' para
MYC
, y 5'-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 'para
RPS18 gratis (para la normalización de datos) .s
PVT1
fueron 5'-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3' y 5'-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 ' , 5'-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 'y 5'-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3' para
MYC
, y 5'-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 'para
RPS18 gratis (para la normalización de datos).
La expresión de miRNAs se llevó a cabo utilizando ensayos TaqMan microARN (Life Technologies) para HSA-mir-1204 (002872), HSA-mir-1205 (002778), HSA-mir-1206 (002878), HSA-mir-1207 -3P (002.826), hsa-miR-1207-5P (241060_mat), HSA-mir-1208 (002880), y RNU48 (001.006; para la normalización de datos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN se aisló utilizando mirVana miARN Kit de aislamiento y el ADNc sintetizado utilizando el TaqMan MicroARN transcripción reversa kit (Life Technologies) con los cebadores proporcionados para cada miARN. a continuación, la amplificación qPCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus utilizando parámetros del fabricante. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado utilizando el método 2- ΔΔCt para la expresión de genes en relación, expresado como 2-ΔΔCt.
ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) e inmunocitoquímica
ViewRNA TIPO 6 sonda fija ( Affymetrix, Santa Clara, CA) diseñado teniendo en
PVT1 gratis (NR_003367.2) se utiliza para visualizar
PVT1
expresión
in vitro
. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante usando reactivos del kit de ensayo de células QuantiGene ViewRNA ISH (Affymetrix). Brevemente, se sembraron células SiHa a 12 mm cubreobjetos circulares y cultivadas a 70-90% de confluencia antes de ser fijadas con 4% de formaldehído. Las células fueron lavadas con PBS 1X y se incubaron durante 5 min en solución de detergente para la permeabilización. Las células se lavaron una vez más y se incubaron con la solución de trabajo de la proteasa para 25 min. Las sondas se diluyeron (1: 100) en pre-calentado Juego de sondas de diluyente y se incubaron con las células durante 3 horas a 40 ° C. Las células se lavaron, se hibridan con la Solución de Trabajo Mezcla preamplificador durante 30 minutos a 40 ° C, se lavaron de nuevo, y se hibridan con la Solución de Trabajo Amplificador mezcla durante 30 minutos a 40 ° C. Después de más lavado, las células se hibridaron con las sondas marcadas durante 30 minutos a 40 ° C. Después de esta incubación, los cubreobjetos se lavaron, se tiñeron con DAPI, y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las celdas eran imágenes con un microscopio confocal Zeiss LSM510 situado en Infantil Instituto de Investigación Imaging Core en el Colegio Médico de Wisconsin. Las imágenes fueron procesadas en Adobe Photoshop CS5.1
.
Para la co-tinción de nucleolina con
PVT1
ARN FISH, inmunocitoquímica se realizó antes de la tinción con DAPI paso anterior. Las células se lavaron 3 veces con PBS + 1% de BSA y 0,1% de Tween-20 y después se bloquearon a temperatura ambiente durante 2 h en tampón de bloqueo (PBS + 10% de BSA, 0% de suero normal de burro y 0,1% de Tween-20). Los cubreobjetos se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche en tampón de bloqueo que contiene un anticuerpo policlonal dirigido contra nucleolina (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Las células se lavaron de nuevo 3 veces y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente en solución de bloqueo que contiene un anticuerpo secundario conjugado con FITC para la visualización de nucleolina. Después de un lavado final, los cubreobjetos se montaron utilizando Vectashield Antifade medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y la imagen como se describe anteriormente.
se midió la proliferación de la célula de ensayo
La proliferación celular usando el la proliferación de células BrdU ELISA (colorimétrico) kit (Hoffmann-la Roche, Nutley, NJ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, 48 h después de la transfección, 1,0 x 10
4 Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células se marcaron a continuación con BrdU durante 2 h, se fijaron, y se incubaron con anti-BrdU-POD. conjugados de peroxidasa sin unir se eliminaron mediante lavado. Se añadió sustrato a continuación, y los valores de absorbancia (370 nM-492 nM) se midieron 15 min más tarde.
El ensayo de viabilidad celular PrestoBlue® también se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. células SiHa fueron transfectadas con LNA como se describe anteriormente. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (1,0 x 10
4 células /pocillo) y se expusieron a cisplatino (Sigma) en un rango de concentraciones entre 10-200 M durante 4 h. medios de cultivo El cisplatino fue removido y reemplazado con medio de crecimiento después de la exposición 4 h y después se incubó a 37 ° C durante la noche. Al día siguiente, los valores de fluorescencia se midieron después de la incubación de las células con el reactivo PrestoBlue® durante 1 hora a 37 ° C.
Ensayos
muerte celular y la apoptosis
La muerte celular fue ensayada mediante la muerte celular Detección Kit ELISA (Hoffmann-La Roche) según las instrucciones de fabricación. En resumen, 48 h después de la transfección, se recogieron y se lisaron 0,5 x 10
5 células. nucleosomas celulares estaban ligados a la placa ELISA preparada a través de componentes de las histonas. Se añadió anti-ADN-peroxidasa, y conjugados de peroxidasa sin unir se eliminaron por lavado. Después, se añadió sustrato y los valores de absorbancia se midió 15 minutos más tarde (405 nm-490 nm). La apoptosis se caracteriza por la medición activa la caspasa-3 (ng /mg de lisado total de células) usando el Humano caspasa-3 (activo) Kit ELISA (Life Technologies, Grand Island, NY). Setenta y dos horas después de la transfección, las células (1,0 x 10
6) se lisaron en tampón de extracción celular (Life Technologies) suplementado con inhibidor de la proteasa Cocktail (Sigma) y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (Sigma).
La migración celular y ensayos de invasión
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los medios que contienen suero se retiró y las células se lavaron con 1 x PBS y luego se cultivaron durante 24 h en EMEM libre de suero. Después del período de inanición, se recogieron las células utilizando HyQTase y se sembraron (1 x 10
5 células) y sobre Corning Transwell Apoyos permeable (Corning, Tewksbury, MA). Para los ensayos de migración, las membranas Transwell se igualaron en medios de cultivo 24 h antes de la siembra de células. Para ensayos de invasión, las membranas Transwell fueron recubiertas con Matrigel Matrix (Corning; 1: 6 en EMEM) y se secaron durante 6 horas a 37 ° C. Las células se cultivaron en presencia y en ausencia de quimioatrayente (EMEM + 20% FBS) y se recogieron 6 h o 48 h más tarde para el análisis de la migración y la invasión, respectivamente. Las células no migrantes fueron retirados de la cara superior de la membrana Transwell con un hisopo de algodón, mientras que las células migratorias se fijaron y tiñeron con violeta cristal (Merck Millipore, Billerica, MA) y se visualizaron /contaron usando microscopía de luz.
Western Blot
tejido cervical fresco congelado o 3.6 x 10
6 células se lavaron con 1 x PBS y lisadas durante 10 minutos en hielo usando la célula tampón de extracción (Life Technologies) suplementado con PMSF 1 mM (Sigma) y un cóctel inhibidor de la proteasa (Sigma). restos celulares no digerida se sedimentó por centrifugación a 10.000 RPM y lisado restante se cuantificó mediante el ensayo de Bradford (Sigma). El lisado (20 g) se agotó en un criterio en gel de poliacrilamida Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), se transfirieron a membranas de PVDF, se bloquearon con 1X TBS + leche descremada en polvo 10% a temperatura ambiente durante 1 h, y se incubaron con anticuerpo primario (Myc o nucleolina, 1: 1000; Cell Signaling Technology) durante la noche a 4 ° C. El día siguiente, las membranas se lavaron, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo de cabra conjugado con HRP IgG anti-conejo (1: 5000; Cell Signaling Technology), y se desarrolló usando ECL (Life Technologies). La quimioluminiscencia se midió utilizando Molecular Imager ChemiDoc XRS + (Bio-Rad Laboratories) y se visualizaron las bandas de proteína se cuantificaron utilizando el software Image Lab (Bio-Rad Laboratories).
cromatografía de afinidad ARN y espectrometría de masas secuenciación
varios de sentido y antisentido superposición de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla (ssDNA oligos; 100 nt de longitud) se generaron contra las secuencias completas de los exones 2 y 9 de
PVT1 gratis (NR_003367.3; Eurofins GTM Operon, Huntsville, AL) . Los exones 2 y 9 fueron elegidos en base a su mayor propensión a la unión como se determina
in silico
proteína. ssDNA se hibridó para obtener ADN de doble cadena (dsDNA), todos los cuales tenía una secuencia de promotor T7 en el extremo 5 '. El promotor T7 que contiene ADN de doble cadena fue
in vitro
-transcribed utilizando el kit MAXIscript T7 (Ambion) y el ARN resultante fue entonces 3'-biotina con el kit de Pierce Desthiobiotinylation (ThermoScientific). ARN Desthiobiotinylated se incubaron con perlas magnéticas de estreptavidina unida de Pierce magnética ARN-proteína desplegables Kit (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. Después del lavado, se añadieron 200 g de SiHa lisado de células enteras de las perlas magnéticas de estreptavidina de ARN unido y se incubaron a 4 ° C con agitación suave durante 90 min. Después de 3 lavados con tampón de lavado (Thermo Scientific 20164), las proteínas de ARN unidas se eluyeron en tampón de muestra SDS y se resolvieron por SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12%. Después de la tinción de plata, bandas de proteínas de interés fueron secuenciados en espectrometría de masas La espectrometría de masa Taplin Facility (Escuela de Medicina de Harvard, Boston, MA). La espectrometría de masa "éxitos" se analizaron para el número de péptidos únicos y totales obtenidos y el área bajo la curva. Cada golpe era
in silico
tripsina digerido y el número de péptidos obtenidos con
in silico
digestión se comparó con el número de péptidos obtenidos en los resultados de la espectrometría de masas. Sólo aquellas proteínas que tenían 20% o más de los fragmentos de tripsina digeribles presentes fueron considerados como verdaderos éxitos. Western Blot (como se describe más arriba) después de la cromatografía de afinidad de ARN se utilizó para validar aún más verdaderos éxitos.
ARN inmunoprecipitación
ARN inmunoprecipitación (RIP) Los ensayos se realizaron con la inmunoprecipitación de proteínas Magna RIP de unión al ARN Kit (EMD Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. lisado de células total de 1,7 x 10
células SiHa 7 se utilizó para la inmunoprecipitación con anticuerpos Myc y nucleolina (igual que para la transferencia Western). Como control IgG no específica, purificada IgG de conejo se llevó a cabo en paralelo. Después de la digestión de proteínas, se extrajo el ARN y DNasa tratada usando ADN libre Kit (Life Technologies). Los niveles de
PVT1
fueron cuantificados en la entrada y el ARN inmunoprecipitado.
Análisis de datos y estadísticas
Los experimentos se realizaron por triplicado y las diferencias entre medias se analizaron los datos utilizando Estudiante de
pruebas t (dos colas). Los resultados se han graficado como media ± error estándar de la media. curvas dosis-respuesta cisplatino se generaron utilizando un modelo de pendiente variable. Todos los análisis estadísticos y la representación gráfica de los datos se realizaron utilizando GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), excepto para el análisis de supervivencia, que se realizó con el programa SPSS11.0 (Chicago, IL). Kaplan-Meier de supervivencia se trazaron y se compararon mediante log-rank pruebas (Mantel-Cox). Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
PVT1
expresión es upregulated en tumores de pacientes con cáncer de cuello uterino y se correlacionó con una peor supervivencia
PVT1
es un gen multi-exón con su región genómica contigua que contiene un grupo de 6 microRNAs (miRNAs) anotados.
PVT1
y los niveles de expresión de los genes miARN locales fueron determinados por qPCR para los tejidos normales y cancerosas adyacentes de pacientes con cáncer de cuello uterino.
PVT1
expresión fue significativamente mayor en los tumores de pacientes con cáncer de cuello uterino en comparación con el tejido normal adyacente (n = 127 tumor; n = 30 normal adyacente; p & lt; 0,001; figura 1A). Expresión de miRNAs 1204 y 1206 (pero no 1205, 1207-3p, 1207-5p, o 1208; S1A-S1D Fig) fue significativamente mayor en tumor en comparación con el tejido cervical normal adyacente (Fig 1B y 1C). Es de destacar que, debido a
PVT1
y
MYC ¿Cuáles son co-amplificado con frecuencia en el cáncer, se analizó, además, la expresión de
MYC
en el cáncer de cuello de útero y los tejidos normales adyacentes. Aunque se observó una tendencia hacia un mayor
Hoteles en MYC cáncer en comparación con normal adyacente, la diferencia en la expresión media de
MYC
no fue estadísticamente significativa entre estos dos grupos (Fig S1E).
(a)
PVT1
expresión fue significativamente mayor en los tumores cervicales primarias (n = 127) en comparación con el tejido cervical normal adyacente (n = 30; p & lt; 0,001). Expresión de miRNAs 1204 (B; p & lt; 0,05) y 1206 (C; P & lt; 0,001), pero no otros miRNAs locales, también fue significativamente mayor en el tejido tumoral cervical (n = 38) en comparación con el tejido normal adyacente (n = 18) . (D) parcelas de Kaplan-Meier reveló una asociación de tumor más alta
PVT1
niveles con el tiempo de supervivencia significativamente más pobres en comparación con los más bajos
PVT1
niveles (p = 0,03).
los 127 pacientes con cáncer de cuello uterino se dividieron en grupos de alto y bajo
PVT1
que expresan, usando la mediana
PVT1
nivel de expresión, para investigar su correlación con el pronóstico. Utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y pruebas de log-rank, encontramos que la alta
PVT1
expresión se correlacionó significativamente con menor tiempo de supervivencia acumulada para los pacientes con cáncer de cuello uterino (p = 0,03; Figura 1D). En conjunto, estos datos sugieren que, en general,
PVT1
expresión es elevada en tumores de cáncer de cuello uterino y que cuanto mayor sea la expresión de
PVT1
, peor será el pronóstico.
PVT1
expresión en líneas celulares de cáncer de cuello uterino
Para empezar nuestro
in vitro
examen en el papel de
PVT1
en células de cáncer de cuello uterino, se determinó
PVT1
niveles de expresión en varias líneas de células del cuello uterino derivados disponibles en el comercio a través de qPCR (figura 2A). Fuera de 4 líneas de cuello uterino, las células SiHa HPV-16 positivas exhibieron la más alta
PVT1
expresión, mientras que el más bajo
se observó PVT1
expresión en el VPH 16 E6 células transformadas-E7 /derivado de exocérvix normales (Ect1 /E6E7). A continuación, hemos tratado de identificar los factores de estrés oncogénicos específicos que pueden impulsará mejoras en
PVT1
expresión en el cáncer de cuello uterino. Para este fin, se expusieron células SiHa (utilizado para el resto de nuestros estudios) a diversos estímulos de transformación antes de medir los efectos en
PVT1
expresión mediante qPCR. Curiosamente, se encontró que
PVT1
expresión en células SiHa se incrementó significativamente en respuesta a 48 h de incubación con INF-α o el mimético de hipoxia, cloruro de cobalto (CoCl
2; Figura 2B). Otros estímulos, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), similar a la insulina factor de crecimiento (IGF), forbol 12-miristato 13-acetato (proteína quinasa C activador), y la irradiación gamma no afectaron significativamente
PVT1
la expresión (datos no mostrados). Por último, se determinó la localización subcelular de
PVT1
utilizando ARN FISH y encontramos expresión de
PVT1
tanto en el citoplasma y en el núcleo de las células SiHa. Además, el control antisentido transfectadas SiHa (figura 2C) exhibieron similares nuclear y citoplasmática
PVT1
tinción, de los cuales estuvo ausente en
PVT1
desmontables células (Figura 2D). En resumen,
PVT1
se expresa en varias líneas celulares derivadas de cuello uterino humano, se puede aumentar por estímulos inmunes e hipóxicas, y se localiza a lo largo del núcleo y el citoplasma que sugiere que este lncRNA puede participar en diversos procesos celulares de cáncer de cuello uterino , posiblemente a través de más de un mecanismo único.
(a)
PVT1
expresión en líneas de células cervicales disponibles comercialmente. Más bajo
se observó PVT1
expresión en el VPH 16 E6 células /E7 transformadas derivadas de exocérvix normal (E6 /E7-Ecto), mientras que las células de cáncer de cuello uterino SiHa muestran la más alta
PVT1
expresión en comparación con otros 2 líneas de cáncer derivado de cuello uterino (HeLa y DoTc2). (B) Expresión de
PVT1 Hoteles en células SiHa se incrementó aún más tras el tratamiento 48h con INF-α (10 M) o el cloruro de hipoxia mimética de cobalto (CoCl
2; 150 mM). Imágenes representativas de experimentos de FISH de ARN en las células SiHa transfectadas con cualquiera de los LNA
PVT1 gratis (D) de control (C) o. células exhiben señales punteadas para
PVT1 gratis (rojo) tanto en el núcleo (teñido con DAPI en azul) y el citoplasma de control LNA-transfectadas. Tanto nuclear y citoplasmática
PVT1
tinción estuvo ausente en
PVT1
células transfectadas LNA. Fase imagen (panel inferior izquierdo) muestra la morfología celular. La barra de escala (blanco) = 10 micras. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01
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silenciamiento reduce la proliferación de células de cáncer de cuello uterino, la migración y la invasión
A continuación, las células transfectadas con SiHa
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-targeted siRNA (siPVT1) se utilizaron para examinar los efectos de esta lncRNA sobre la proliferación de células de cáncer cervical y la motilidad. La transfección con
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-targeting siRNAs dieron como resultado, en promedio, el 70% desmontables de
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en comparación células transfectadas con el control a (figura 3A). Además, no hubo diferencias significativas en los genes miARN local (1204-1208) o
MYC
la expresión de ARNm en siPVT1 frente a las células de control transfectadas revueltos (siCONT; S2 Fig). células SiHa transfectadas con siPVT1 exhibieron una disminución significativa en la incorporación de BrdU, una medida de las células que se replican, en 72 h después de la transfección en comparación con siCONT, lo que sugiere que
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juega un papel en la conducción de la proliferación celular (Fig 3B). Estos efectos de la
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caída en la proliferación SiHa también fueron confirmados por transfección con
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-targeted LNA. Finalmente, en comparación con las células siCONT, las células siPVT1 muestran una disminución significativa de la migración (Fig 3C) y el potencial de invasión (Fig 3D). Es de destacar que estos efectos de
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caída se imitan en otra línea celular de cáncer de cuello uterino, HeLa (Fig S3), con un mayor apoyo para un papel de esta lncRNA en la carcinogénesis cervical.
(A ) transfección de células de cáncer cervical SiHa con siRNAs dirigidos
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(siPVT1) resultó en un aproximado desmontables 70% en
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lncRNA expresión en comparación con células transfectadas con un control mezclado siRNA (siCONT) . las células (B) SiHa transfectadas con siPVT1 mostraron una disminución significativa en la proliferación en comparación con células siCONT. También se evaluaron células SiHa transfectadas para cambios en la migración (C) y (D) la invasión 6 h o 48 h después de la introducción de quimioatrayente (FBS), respectivamente. células siPVT1 mostraron una disminución significativa tanto en la migración celular y la invasión en comparación con células siCONT. Los resultados cuantitativos se representan a la izquierda, mientras que las imágenes son representativas de la derecha. *** P & lt; 0,001, **** p & lt; 0,0001
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silenciamiento aumenta la apoptosis y la respuesta al cisplatino en cáncer de cuello uterino células
Hasta la fecha, estrategias desmontables de siRNA mediada por la orientación
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han demostrado su papel en la sensibilidad a cisplatino en el mesotelioma pleural maligno [25] y células de cáncer gástrico [26]. Sin embargo, la firma anti-apoptótica inducida por
PVT1 Hoteles en otros tipos de células de cáncer [8,18,20,26] puede indicar que su contribución a la resistencia a cisplatino está de más largo alcance. Por lo tanto, nuestra siguiente experimentos fueron diseñados para investigar el papel de
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en la apoptosis y cisplatino sensibilidad en células de cáncer de cuello uterino. La extensión de los hallazgos anteriormente mencionados, nuestros resultados muestran que
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caída en células SiHa significativamente mayores niveles de fragmentos citoplasmáticos de las histonas asociadas al ADN (figura 4A) y activa la caspasa-3 (Figura 4B), lo que sugiere que
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también puede contribuir a la carcinogénesis cervical través de la inhibición de la muerte celular y la apoptosis. Además,
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desmontables por cualquiera de siRNA (Figura 4C) o los oligonucleótidos de LNA (Figura 4D) provoca un aumento de la capacidad de respuesta de las células SiHa al cisplatino. En conjunto, las características fenotípicas de células (pérdida de
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) datos funcionales sugiere que
se requiere PVT1 Opiniones de proliferación, el mantenimiento y la resistencia a cisplatino de las células de cáncer de cuello uterino.
Células
siPVT1 exhibieron un aumento significativo en la muerte celular (a) y la apoptosis (B) en comparación con las células siCONT. (C) Proliferación de células SiHa siPVT1 se redujo significativamente en respuesta a múltiples dosis de cisplatino. (D) la curva dosis-respuesta para el control y
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células SiHa LNA transfectadas siguientes 4 h de tratamiento con cisplatino.