ratón
Extracto
En un modelo de xenoinjerto en donde, las células de cáncer renal en vivo se implantaron bajo la cápsula renal en ratones, reveló un 30 veces aumento en el volumen del tumor durante un período de 26 días y esto fue acompañado con un aumento de 32 veces en el nivel de lactosilceramida (LacCer). Los ratones alimentados con D- treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (D-PDMP), un inhibidor de glucosilceramida sintasa y lactosilceramida sintasa (LCS: ß-1,4-GalT-V), mostró marcada reducción en el volumen del tumor. Esto fue acompañado por una disminución en la masa de lactosilceramida y un aumento en el nivel de glucosilceramida (GlcCer). Estudios mecanicistas revelaron que D-PDMP inhibió la proliferación celular y la angiogénesis mediante la inhibición de p44MAPK, p-AKT-1 vía y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR). Al vincular la síntesis de glicoesfingolípidos con el crecimiento tumoral, la progresión del cáncer renal y de regresión pueden ser evaluados. Por lo tanto la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos puede ser un objetivo de buena fe para evitar la progresión de otros tipos de cáncer
Visto:. Chatterjee S, N Alsaeedi, Hou J, Bandaru VVR, Wu L, Halushka MK, et al. (2013) El uso de un inhibidor glicolípidos para aliviar el cáncer renal en un modelo de ratón. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10.1371 /journal.pone.0063726
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Septiembre, 2012; Aceptado: 5 Abril 2013; Publicado: 9 Mayo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chatterjee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue financiado a través TEDCO, Estado de concesión de Maryland, el apoyo institucional de la Universidad Johns Hopkins y los Institutos nacionales de Salud de subvención PO-1-HL-107153-01. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SC sirve en el consejo asesor científico de Amalyte productos farmacéuticos y no recibir honorarios por sus servicios y dicha información se almacena en los registros EOPC institucionales. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Todos los demás autores no tienen intereses financieros en competencia
Introducción
Los estudios recientes sugieren que los esfingolípidos pueden inducir fenotipos tales como la proliferación, adhesión y angiogénesis los distintivos en el crecimiento tumoral y la metástasis [1] -. [ ,,,0],6]. La aplicación de fármacos que inhiben la síntesis de glicoesfingolípidos proporcionan una oportunidad para examinar el papel de estos compuestos en modelos animales de enfermedad humana. Aquí demostramos que mediante la vinculación de la síntesis de glicoesfingolípidos y su inhibición en un modelo de ratón de cáncer renal, es posible observar la huella de las interacciones entre fármaco y glicoesfingolípidos enzimas que metabolizan y para predecir el inicio de la progresión de la enfermedad /tumor y la regresión del tumor. El bloqueo de la glicosilación de ceramida para tratar el cáncer se ha documentado en la célula y en modelos animales [2], [3].
Los tumores requieren la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes (angiogénesis) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) juega un papel crítico en la inducción de la angiogénesis en una variedad de tumores [4], [5]. Por lo tanto, racionalizada que la orientación células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos del tumor, que se enriquecen con una isoforma de LCS puede tener varias ventajas teóricas tales como la orientación de administración de fármacos en varios tipos de cáncer. Nuestra razón surge de nuestros hallazgos anteriores en el que VEGF se demostró para estimular LCS: actividad β-1,4-GalT-V en las células endoteliales arteriales humanas para producir LacCer, y que dio como resultado la activación de la "sensibles al oxígeno" vía que conduce a la señalización angiogénesis [4]. Además, el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA) para hacer que LCS: ß-1,4-GalT-V ablación gen o la manipulación farmacológica mediante el uso de D-PDMP, un inhibidor de la uridina difosfato ceramida glucosiltransferasa glucosa (UGCG), y LCS [7], notablemente mitigado la angiogénesis inducida por VEGF [5]. Además, se observó que la D-PDMP puede significativamente (
P Hotel & lt; 0,0005) mitigar VEGF /angiogénesis inducida por β-FGF
in vivo en ratones desnudos
[4] e inhibir la metástasis experimentales de murino carcinoma de pulmón de Lewis [8].
El objetivo de este estudio fue determinar si la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos también inhibir la proliferación celular /reducir el volumen del tumor
in vitro
y
in vivo
. En este estudio se logró el objetivo de que la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos también inhibir la proliferación celular /reducir el volumen del tumor
in vitro e
in vivo
.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de Medicina Institucional de Cuidado y uso de Animales de Johns Hopkins, permiso#MO03M615. Los esfuerzos pertinentes adoptadas para aliviar el sufrimiento del animal incluyendo la anestesia (ketamina y xilazina) y post-cirugía de seguimiento (control periódico de los animales de hasta 8 horas después de la cirugía). El ungüento antibiótico se administró en el sitio de la incisión y se aplicó un ungüento óptica para evitar que sus ojos se sequen durante la cirugía.
Experimentos con ratones
El cáncer renal ratón (RENCA) suspensión celular fue cargada en una jeringa de 1 ml. Los ratones receptores (BALB /c ratones) fueron pre-anestesiados con i.p. inyección (100 uL) de una solución madre de ketamina /xilazina (8 mg /kg), se aseguró en una placa de puesta a tierra con la piel de la espalda afeitado y preparado de forma estéril. Se realizó una incisión en el flanco izquierdo y el riñón izquierdo y exteriorizó. 100 uL de tumor suspensión de células (1 × 10
6 células /inóculo) se inyectó en el espacio subcapsular del riñón izquierdo. A continuación, el riñón se colocó en la posición original y la incisión se cerró con clips de metal seguras estéril. El tratamiento experimental comenzó 2 días después de la implantación del tumor subcapsular. Los ratones fueron alimentados por vía oral por sonda D-PDMP (3 y 10 mg /kg de peso corporal) al día. D-PDMP se solubilizó en 5% de Tween-80 en solución salina. Diez ratones (N = 10) fueron utilizados en cada grupo.
El grupo placebo de los ratones que tienen el tumor implante recibido diaria, un volumen igual de 100 uL de vehículo. Después de este procedimiento, los animales se controlaron diariamente. punto de esta serie de experimentos final fue la evaluación del crecimiento del tumor en el riñón. el seguimiento del crecimiento tumoral en animales implantados ortotópicamente en el riñón se realizó por palpación manual de dos veces a la semana. Después de 4 semanas, (día 26-28 post-implantación del tumor), los animales fueron sacrificados con CO
2 y la autopsia. medición del crecimiento del tumor se realizó mediante la evaluación directa del peso del tumor al final del experimento.
Los estudios histológicos
Los tumores primarios fueron enviados a la histología (N = 4). Las secciones de tejido fueron teñidas con hematoxilina y -eosin con anticuerpos contra CD31 (un marcador importante para la angiogénesis) y la caspasa-3 (un marcador importante de la apoptosis). anticuerpo lactosilceramida (CD17) se adquirió de Ancell laboratorios y se utilizó para identificar la localización de LacCer en el tejido renal. Los tejidos se recogieron de los otros 4 ratones y se utilizan en Bioquímica /ensayos moleculares descritos en el texto.
se llevó a cabo extracción de D-PDMP y esfingolípidos
extracción de la muestra utilizando un Bligh y Dyer modificada procedimiento como se describe anteriormente [9]. Cada muestra se homogeneizó a temperatura ambiente en 10 volúmenes de agua desionizada. Tres volúmenes de 100% CH
3OH contiene mM HCOONH 53
4, 17 ng /ml C
12:00 ceramida, y 17 ng /ml C
12:00 esfingomielina (normas internas, ES se añadió), y se agitó en vórtex la mezcla. Cuatro volúmenes de CHCl
se añadieron 3, vortex, y después se centrifugaron a 1000 ×
g
durante 10 minutos. 100 l de la CHCl
3 se separó la capa, se secó bajo una corriente de nitrógeno, y el residuo se disolvió en metanol al 100% que contiene 10 ng /ml C
02:00 ceramida como un estándar interno para la cuantificación de D -PDMP. A continuación, las muestras se transfirieron a insertos de vial de vidrio para el análisis /MS /MS LC; 10 l se inyectó en el LC /MS /MS. Todos los disolventes y productos químicos fueron de grado HPLC. extracciones de lípidos se realizaron utilizando tubos de vidrio de borosilicato recubierto de pipetas, y para reducir la adhesión de los lípidos de las superficies.
análisis LC /MS /MS para los esfingolípidos y D-PDMP
Identificación de especies y esfingolípidos D-PDMP se realizó utilizando una cromatografía líquida de espectrómetro de masas en tándem de ionización por electrospray 3000 PE Sciex, operado en modo positivo (LC-ESI /MS /MS; Applied Biosystems, Thornhill, Ontario, Canadá), y de acuerdo con los métodos descritos en los estudios anteriores [ ,,,0],10]. El sistema consta de dos bombas conectadas a un HTC PAL auto-inyector (Análisis CTC, Zwingen, Suiza) equipado con un bucle de muestra de 50 l Perkin Elmer LC. tasa de flujo fue de 400 l /min para las ceramidas y 1 ml /min para esfingomielinas. El flujo de la inyector de muestras llevado a una columna de 2,6 micras C durante ceramidas y D-PDMP, y un 5 micras C
18 en la columna para esfingomielinas (Phenomenex, Torrance, CA). La columna se pre-equilibró durante 0,1 min con el solvente A que consistía en CH
3OH: dH
2O (85:15, v /v) con HCO mM 5
2NH
4, y la muestra se eluyó con disolvente B que consistía en CH
3OH: HCOOH (99:1, v /v) con HCO mM 5
2NH
4. La muestra eluida se introdujo automáticamente en la fuente de iones. Los parámetros del instrumento para LC-ESI /MS /MS se optimizaron por separado para cada especie de ceramida, la ceramida-1-fosfato, esfingosina, esfinganina, sphigosine-1-fosfato, esfingomielina, y D-PDMP por monitorización de reacción múltiple. Ceramidas y esfingomielinas se cuantificaron por área bajo la curva (AUC) de cuentas por segundo (cps) normalizados a estándares internos (ceramida C
12:00 y esfingomielina C
12:00). las concentraciones de D-PDMP se determinaron mediante la creación de una curva patrón que se construyó utilizando las relaciones de patrones de referencia (D-PDMP; 0,1 a 100 mg /ml) para IS (ceramida C
02:00; 10 ng /ml) trazada en contra de los ratios de referencia y es a partir de muestras experimentales. Todas las soluciones madre se almacenaron a -20 ° C y estable más de 6 meses.
ensayos de actividad glycosylhydrolase glicosiltransferasa y
actividad LCS en preparaciones renales se midió utilizando un protocolo detallado anteriormente [11] con el siguientes modificaciones. Brevemente, flash congelado tejido renal se homogeneizaron en tampón Tris-HCl (pH 7,4) que contiene Triton-X-100 y se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min. La masa de proteínas en el sobrenadante se midió y se usó 100 g de proteína de la muestra en los ensayos enzimáticos, por triplicado. 14C-UDP-galactosa (American radiomarcadores Company, St. Louis, MO) sirve como donante de galactosa. Y glucosilceramida (Matreya Chemicals, PA) sirve como aceptor en este ensayo. 14C-LacCer generada a partir de este ensayo se cuantificó por espectrofotometría de centelleo. actividad sintasa glucosilceramida se midió utilizando ceramida como aceptor y [3H] glucosa UDP- como donante de glucosa. actividad glucosilceramida hidrolasa se midió usando [3H] glucosilceramida (American radiomarcadores Company), como el sustrato de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente.
estudios de inmunotransferencia Western
Los riñones se recogieron de control, placebo, 3 MPK y el 10 de MPK-D PDMP alimenta vía oral y diariamente a los ratones. Los tejidos renales se homogeneizaron en tampón RIPA (Sigma Aldrich), se colocó en hielo durante 15 minutos, se centrifuga a 13.000 RPM, y se recogieron los sobrenadantes. Para determinar la concentración de proteína, se utilizó Ensayo de Bradford. Para un gel 4-15% (Bio-Rad Ready Gel), 45-90 g de muestras de proteínas y 10 l de patrón de proteína de bajo peso molecular (Bio-Rad color dual Precision Plus) se cargaron. Después de la electroforesis de gel durante 1,5 horas, las membranas de Immuno-Blot PVDF (Bio-Rad) se empaparon en metanol frío, dH
2O, y tampón de transferencia (Bio-Rad). A continuación, el gel se transfirió a una membrana de PVDF (Bio-Rad), en 30 V durante la noche. Las membranas fueron bloqueadas en 3% de leche, 1 × TBST (0,05% de Tween-20), se incubó en anticuerpos primarios contra: ß-1,4-GalT-V, actina beta, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (gliceraldehído 3- fosfato deshidrogenasa, US Biológica), p44MAPK (Thr202 y Tyr204), p-AKT-1 (Thr308) (Tecnologías de señalización Celular), y mTOR (Sigma-Aldrich) en 1 x TBS con dilución 1:200 y 0,5% de BSA, y se incubaron en anticuerpo secundario, de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma Aldrich) en 5% de leche, 1 × TBST con dilución 1:1000. Todos los anticuerpos primarios requieren incubación durante la noche a 4 ° C, mientras que los anticuerpos secundarios requiere 1 hora de incubación a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavaron en 1 x TBST durante 5-10 minutos y se repite 2 veces y se desarrolló usando el kit ECL (Amersham ECL Plus ™ Western Blot Detección Reactivos).
asistida por ordenador cuantificación de la caspasa-3 y CD31 células positivas
Todo immunohistochemically manchadas diapositivas fueron escaneadas digitalmente usando un Aperio CS ScanScope (Vista, CA). Para el análisis de la caspasa-3, se utilizaron el evento raro y algoritmos nucleares de la caja del kit de herramientas Aperio. El detector de evento raro identificado células positivas de caspasa que se confirmó con la mano-curación. Este valor se divide por el recuento total de células de la superficie determinada por el algoritmo nuclear. área de CD31 fue identificado por la división de un área de CD31 positivo máscara por el área de la máscara de tumor viable para cada diapositiva, tal como se describe de manera similar [12].
Los estudios estadísticos
Los datos se expresan como media ± desviación estándar y como una medida de ± error estándar medio. La diferencia significativa entre el control, el placebo y grupo experimental se evaluó usando del estudiante
t
prueba de ANOVA de una vía. se hizo par sabia comparación para determinar la significación entre los diferentes tratamientos. Las diferencias se consideraron significativas a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Hemos observado que la D-PDMP pero no la L-PDMP inhibieron el crecimiento de células RENCA (Ver Figura S1 ). Por lo tanto, la hipótesis de que la inhibición de la actividad de LCS y la reducción de la carga LacCer bien puede reducir el cáncer renal en ratones. En este estudio, se utilizó D-PDMP ya que no es tóxico y es absorbido por el riñón, el cerebro y el hígado cuando se administra por vía oral a ratones [13]. Además, se elimina rápidamente por el sistema del citocromo P450 como su t
medio es aproximadamente 50 minutos [13]. Aunque D-PDMP se sintetizó para mitigar la enfermedad de Gaucher mediante la inhibición de la actividad UGCG, demostramos que también inhibe la producción de la actividad LCS-LacCer y por lo tanto la angiogénesis
e in vitro
in vivo
, en ratones desnudos [5]. En esto, demostramos que la inhibición de la actividad de LCS y la producción LacCer específicamente son fundamentales para la señalización de eventos tales como la angiogénesis y la proliferación que conducen a una marcada reducción en el volumen del tumor en un modelo de ratón de cáncer renal.
Una semana después de la aplicación, el tumor primario fue visible macroscópicamente; después de la metástasis 10 días espontánea desarrollado en los ganglios linfáticos regionales, pulmón, el peritoneo, y el hígado, lo que permite el modelo RENCA que se realizaron de manera similar al carcinoma de células renales humano. El tiempo de supervivencia media de los ratones portadores de RENCA es de 32 días cuando se inyectan células 10
6 RENCA. Para determinar si la alteración en el perfil de glicoesfingolípidos es una característica importante en el cáncer renal, se comparó el nivel de estos lípidos en el riñón de control (no teniendo RENCA) frente a ratones placebo riñón (teniendo RENCA). Al mismo tiempo, se examinaron los efectos de la alimentación D-PDMP en los niveles de volumen del tumor y de lípidos en el tejido renal. Hemos observado que la implantación de las células RENCA en el espacio subcapsular en el riñón izquierdo (ratones placebo, y no hay tratamiento) contribuyó a aumento ~ 30 veces en el volumen del tumor, en un período de ~26 días (Figura 1A). El peso corporal no cambió (Figura 1B) y 20% de los ratones en el grupo de placebo murió. La ingesta oral de 3 MPK-D PDMP y 10 MPK-D PDMP para el período experimental redujo el volumen del tumor a ~ 50% mayor que la de placebo tumores renales de ratón. Esta disminución independiente de la dosis D-PDMP en el volumen tumoral podría, en parte, se explica por nuestra observación de que el nivel de D-PDMP (mide usando LC-MS /MS) en el tejido renal fue similar (Figura 1C) como fuere se han excretado rápidamente. tándem detallada LC-MS /MS reveló que C24, C16 y C22 eran las principales especies moleculares de ácidos grasos en la ceramida, mono y di hexosylceramide y esfingomielina en control, placebo, y el tejido de riñón de ratones alimentados-D-PDMP. Y C20, C18 y C26 eran los ácidos grasos que contienen esfingolípidos menores (figura S2). El nivel de ceramida total aumentó aproximadamente 2,5 veces en el riñón de ratón con placebo frente al control. Curiosamente, la alimentación 3 MPK D-PDMP no cambió el nivel de ceramida en el riñón en comparación con placebo (Figura 2A). Sin embargo, en 10 ratones MPK D-PDMP alimentados, el nivel de ceramida disminuyó para controlar el nivel. Por lo tanto, a pesar de D-PDMP se afirma que es un inhibidor específico de UGCG y contribuyendo así a un aumento en los niveles de ceramida, en este estudio no planteó los niveles tisulares de ceramida en riñón de ratón. Y esta observación está de acuerdo con un informe anterior que mostró que la D-PDMP (100 MPK) disminuyó ceramida riñón level~9% 5 horas más tarde [13]. La inyección de 40 MPK D-PDMP dos veces al día durante 4 días también dio lugar a una disminución de 23% en ceramida en el riñón [13]. En otro estudio utilizando el iminoazúcar N- (5-adamantinane-1'-il-metoxi) pentil-1-deoxynoijirimycin (AMP-DNM), un inhibidor de la UGCG tampoco elevar los niveles de ceramida en el hígado y mantiene el nivel plasmático de ceramida a nivel basal en la hiperlipidemia inducida por la dieta en apoE - /- ratones [14]. Las razones de la disminución mediada D-PDMP en el nivel de ceramida en el riñón del ratón no está claro a partir de este estudio. Dado que la ceramida es un precursor directo de la síntesis de la esfingomielina, que prevé un mayor nivel de esfingomielina en los ratones tratados D-PDMP. Sin embargo, el nivel de esfingomielina en nuestro estudio y en un estudio anterior [13] no cambió significativamente (Figura 2H). Esto podría ser porque mientras una piscina superior de la ceramida podría inducir un aumento en la síntesis de esfingomielina; sin embargo, puesto D-PDMP también aumenta la actividad de la esfingomielinasa, puede ayudar a mantener la homeostasis esfingomielina [13]. Ceramide también podría ser hidrolizado para generar la esfingosina y sus derivados (Figura 2C-E). Por ejemplo, nuestros estudios adicionales revelan que el nivel de ceramida-1-fosfato (Figura 2B), esfingosina (Figura 2C), esfingosina-1-fosfato (Figura 2D) y esfinganina (Figura 2E) varió en el riñón de ratón placebo comparación con el control y tras el tratamiento con D-PDMP. En particular aumento, 20 veces en el nivel de la esfingosina-1-fosfato en el ratón placebo versus control se señaló. El tratamiento con 3 MPK D-PDMP no disminuyó el nivel de esfingosina-1-fosfato en comparación con el riñón de ratón placebo. Sin embargo, tras la alimentación de 10 MPK D-PDMP, se observó una disminución del 50% en el nivel de este lípido. El nivel de monohexosylceramides se elevó de 5 veces en ratón placebo en comparación con la de los riñones de control de ratón, pero no cambió en la alimentación de 3 MPK D-PDMP (Figura 2F). Sorprendentemente, el nivel de este lípido aumentó algo sobre la alimentación de 10 MPK de D-PDMP. Esta observación podría ser interpretado para indicar una disminución compensatoria en el nivel de LacCer en los ratones tratados con 10 MPK de D-PDMP que disminuyeron la actividad de LacCer sintasa. Por lo tanto, un resultado inesperado de este estudio es que a largo plazo (26 días) de alimentación de D-PDMP no disminuyó el nivel de monoglycosylceramides en riñón de ratón a pesar de que D-PDMP se ha demostrado previamente para servir como un inhibidor de la síntesis de glucosilceramida. El mayor incremento en el nivel de dihexosylceramide, ~32 veces, se produjo en el riñón en comparación con placebo control. Sin embargo, el nivel de lactosylceramide disminución dependiente de la dosis en los ratones alimentados con 3 MPK y 10 MPK de D-PDMP (Figura 2G). Esto fue acompañado por una disminución dependiente de la dosis D-PDMP en la actividad de LacCer sintasa (Figura 3C), pero no GlcCer sintasa (Figura 3A). En contraste, se observó que la actividad de hidrolasa de glucosilceramida disminuye, con un aumento en la dosis de D-PDMP de 3 a 10 MPK MPK (Figura 3B). Reducción de la actividad de la glucosilceramida glucosidasa en los ratones tratados con 10 MPK-D PDMP (Figura 3B) puede haber contribuido a un mayor nivel de glucosilceramida (Figura 2F). Curiosamente, el nivel de la esfingomielina no cambió en control, placebo, y el riñón de ratón alimentado-D-PDMP (Figura 2H). En resumen, el aumento del volumen de tumor renal en ratones con RENCA y su disminución tras el tratamiento con D-PDMP correlacionan mejor con los niveles de masa LacCer, en comparación con cualquier otra esfingolípidos investigado en este estudio.
Los ratones (BALB /C) fueron pre-anestesiados y la suspensión de células tumorales RENCA (10
6 células) se inyectó en el espacio subcapsular del riñón izquierdo. El tratamiento experimental comenzó dos días después de la implantación del tumor subcapsular. Los ratones alimentados por vía oral por sonda D-PDMP (3 y 10 mg /kg de peso corporal, MPK) al día. D-PDMP se solubilizó en 5% de Tween-80 en solución salina. placebo ratones recibieron el vehículo (5% de Tween-80 en solución salina solamente 100 l). Después de 26 días, se sacrificaron los ratones. El riñón derecho sirvió como control, y el riñón izquierdo sirvió como placebo o drogas tratados con 3 y 10 de MPK-D PDMP. A: un marcado aumento en el volumen del tumor de riñón de ratón se redujo drásticamente por la alimentación de D-PDMP. B. D-PDMP (3 y 10 MPK) no redujo el peso corporal total en ratones. C: El nivel de D-PDMP en el riñón de ratones tratados con 3 y 10 de MPK-D PDMP fueron similares
El nivel de varios esfingolípidos se midieron mediante tándem LC-MS /MS.. A: D-PDMP disminuyó el nivel de la ceramida, B: ceramida-1-fosfato, y D: la esfingosina-1-fosfato. D-PDMP modestamente aumentó el nivel de esfingosina; C, E: esfinganina y F: monohexosylceramide. G: D-PDMP disminuyó dosis-dependiente el nivel de dihexosylceramide en el cáncer renal ratones. H: D-PDMP no cambió el nivel de esfingomielina en el cáncer renal de ratón. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 N = 4).
Medición de la actividad lactosylceramide sintasa en riñón de ratón se llevó a cabo usando UDP [14C] galactosa como donante de galactosa y GlcCer como el aceptor, como se detalla [11]. Hemos observado que la alimentación de D-PDMP dependiente de la dosis disminuyó la actividad de esta enzima A: actividad de la sintasa de glucosilceramida se disminuyó en la misma medida con independencia de si 3 MPK o 10 MPK de D-PDMP se alimentó a los ratones con cáncer renal B: glucosylceramidehydrolase la actividad se redujo mediante el tratamiento D-PDMP y C:. actividad sintasa lactosylceramide se disminuyó dependiente de la dosis en los ratones alimentados con D-PDMP con cáncer renal (N = 4, * p & lt; 0,05)
Siguiente , utilizando un anticuerpo monoclonal disponible en el mercado contra LacCer, determinamos si LacCer era un lípido importante acumulación en el cáncer renal. Nuestros estudios inmunohistoquímicos revelaron la acumulación de grandes cantidades de lactosylceramide dentro de las vesículas citoplasmáticas (flechas blancas) exclusivamente en las células cancerosas (comparar Figura S3 A; tinción DAPI vs Figura S3 B; anticuerpo CD17 células teñidas). Anteriormente, hemos demostrado que, en las células tubulares proximales renales tumor humano, se incrementa la actividad de LCS, y esto va acompañado con un aumento en el nivel de LacCer en comparación con riñón humano normal [15]. Aumento del nivel de LacCer También se ha informado en el cáncer renal humano [16]. Estos hallazgos sugieren que en el modelo de ratón de cáncer renal, el aumento de la masa lactosylceramide está mejor correlacionado con el aumento en el volumen del tumor y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la orientación síntesis de glicolípidos, en particular LCS y LacCer puede ser un enfoque terapéutico de buena fe para mitigar el cáncer renal.
Para entender las rutas moleculares que contribuyen a una reducción en el volumen del tumor debido a la D-PDMP alimentación en ratones, se llevados a cabo ensayos de inmunotransferencia occidental de distintos marcadores, que se muestran por otros y nosotros [5], [17], [18], [19] que contribuyen a la proliferación celular, la angiogénesis y apoptosis. Nuestros estudios mecanísticos revelaron que D-PDMP afectó a una marcada reducción en el volumen del tumor por la disminución de la expresión de diversas moléculas de señalización implicadas en las vías que contribuyen a la proliferación celular y la angiogénesis. Por ejemplo, hubo un marcado aumento en la masa de LCS en el riñón de ratón placebo en comparación con la de control y esta observación puede explicar un marcado incremento en el nivel de LacCer en el riñón placebo vs control. D-PDMP disminución dependiente de la dosis la masa del LCS (Figura 4A). En contraste, el nivel de UGCG se incrementó en los ratones alimentados con D-PDMP (Figura 4A). Biomarcadores para la proliferación celular y la angiogénesis, por ejemplo, p44MAPK y p-AKT-1 eran todos disminuido en los riñones de los ratones alimentados con D-PDMP comparación con la de los riñones placebo (Figura 4B). Estas observaciones sugieren que D-PDMP afecta a la proliferación celular y la angiogénesis mediante la inhibición de la actividad de LCS y la producción de LacCer. En paralelo
in vitro
estudios, hemos observado que la D-PDMP pero no L-PDMP disminuyó dependiente de la dosis la proliferación de células RENCA, posiblemente debido a la detención de las células en la fase G2-M de la célula ciclo, tras el tratamiento con D-PDMP [20] (Figura S1).
inmunotransferencias representativas de extractos de tejido procedentes de ratones BALB /c alimentados vehículo (placebo más RENCA células /tumor) y 3 y 10 MPK de D- PDMP durante 26 días y el riñón de control y las exploraciones densitométricas correspondientes se muestran. A: D-PDMP la dosis disminuyó de forma dependiente de la expresión de la proteína de LacCer sintasa (β-1,4-GalT-V) (N = 3-6), en el cáncer renal de ratón, pero un poco aumentó la expresión de la proteína de UGCG (N = 2) en el cáncer renal de ratón. B: inmunotransferencias Western de marcadores para la proliferación celular (p44MAPK, N = 3), la angiogénesis (pAKT-1, N = 3; mTOR, N = 3 para el placebo y 10 MPK) y mantenimiento de la casa GAPDH proteína. tratamiento D-PDMP reduce los marcadores de proliferación celular y la angiogénesis. Los datos fueron evaluados por un modelo lineal.
La evaluación histológica de los riñones revelaron un amplio crecimiento de RENCA agresiva, con necrosis marcada. Necrosis, como un porcentaje del volumen del tumor se cuantificó utilizando herramientas de análisis digitales [21] y se encontró que 38,8%, 28,4% y 33,2%, respectivamente, para placebo, 10 MPK, y 25 MPK ratones tratados (Figura S4A-H). Hemos demostrado anteriormente que la D-PDMP puede inhibir de forma eficaz la angiogénesis inducida por VEGF
in vitro
en las células endoteliales de la vena umbilical humana y las células endoteliales arteriales humanos [4], [5]. También en un estudio previo, la angiogénesis inducida por VEGF + β-FGF fue mitigado por D-PDMP en ratones [4]. Esto se midió por una marcada disminución en la expresión de CD31 y la angiogénesis. Para determinar si una disminución en el volumen del tumor renal también se debió a una disminución en el suministro de sangre a través de la disminución de la angiogénesis, se realizó la inmunotinción para CD31 (Figura S4I, J). Se observó una marcada disminución de la superficie vascular CD31 positiva en áreas viables de tumor (0,3% frente a 0,05% para el placebo vs. 25 MPK ratones tratados) como se determina utilizando herramientas de análisis digitales [21]. Anteriormente, mTOR se ha establecido como un marcador de la angiogénesis y ha sido un objetivo validado para mitigar varios tipos de cáncer. Hemos observado que la D-PDMP disminuyó notablemente la expresión de proteína mTOR (Figura 4B), lo que sugiere que mediante la inhibición de la angiogénesis, D-PDMP privó al tumor del suministro de sangre y por lo tanto contribuyó a una reducción en el volumen del tumor. Un resultado inesperado fue que D-PDMP disminuyó significativamente el número de células apoptóticas medidas por la caspasa-3 inmunotinción. El porcentaje de células positivas de caspasa fueron 0,09%, 0,04% y 0,03% para el placebo, 10 MPK, y 25 MPK ratones tratados respectivamente, determinado por análisis digital (Figura S4K-N) [21]. Por lo tanto nuestro
in vivo
estudios sugieren que la D-PDMP no reduce el volumen del tumor mediante la inducción de la apoptosis en ratones riñón.
Discusión
Las siguientes observaciones se pueden extraer de nuestro presente estudio que implican el papel de glicoesfingolípidos en la biología del tumor renal. En primer lugar, existe una correlación fuerte y estadísticamente significativa entre el aumento de volumen del tumor renal del ratón y un aumento paralelo en la masa de LacCer. En segundo lugar, la inhibición de la actividad de glicosiltransferasa glicoesfingolípidos, y en particular la disminución de la actividad y la masa de LacCer sintasa se correlaciona con una disminución en el volumen del tumor. En tercer lugar, a pesar de D-PDMP es conocido por ser un inhibidor de la UGCG, que no levantó los niveles de ceramida renales. Desde ceramida está implicado en la apoptosis, nuestros estudios sugieren que D-PDMP no reduce el volumen del tumor mediante la inducción de apoptosis a través de la vía de la ceramida en ratones riñón. Más bien, D-PDMP inhibe una vía de señalización inducida por LacCer contribuyendo así a una inhibición de la proliferación celular y la angiogénesis tumoral. En conjunto, estos estudios sugieren que la inhibición de la glicosiltransferasa glicolípido puede inhibir la proliferación /la angiogénesis en los tejidos a través de mecanismos independientes de la apoptosis.
En el presente estudio, un incremento de ~ 30 veces en el volumen del tumor en placebo riñón de ratón (en comparación a la de control) fue acompañado de un aumento equivalente veces en masa LacCer. La alimentación de D-PDMP volumen notablemente reducido tumor por medio de la disminución de la actividad enzimática de LCS, la masa LCS, y por consiguiente la masa LacCer, y las proteínas angiogénicas, tales como p-AKT-1 y mTOR. En nuestros estudios previos, se observó que el uso de siRNA para LCS
in vitro en células endoteliales humanas
[5] y
in vivo en ratón de glioblastoma
[22] y el uso de D- PDMP en este estudio puede reducir el volumen del tumor mediante la mitigación de la angiogénesis. Por lo tanto, la orientación síntesis de glicolípidos en sintasa general y LacCer en particular, [5], [22] es un nuevo enfoque para mitigar el cáncer renal en ratones. También hemos informado anteriormente de que L-PDMP, que activa LacCer sintasa en las células endoteliales también puede inducir angiogenensis de una manera dependiente de la dosis [7], y también la proliferación de células RENCA en el presente estudio (véase el Apéndice). Por lo tanto la activación /inactivación de LacCer sintasa por agonistas /antagonistas también puede regular la angiogénesis
e in vitro
in vivo
.
Nuestros estudios y los de otros [13] han demostrado que D-PDMP no es tóxico cuando se administra en dosis diez veces la de la concentración utilizada en el presente estudio. El peso corporal en este estudio no fue diferente en los ratones tratados con placebo versus-D-PDMP. El peso del tumor se redujo en aproximadamente 50% en 3 MPK y 10 ratones MPK alimentado en comparación con placebo. Sin embargo, cuando los ratones fueron alimentados con cantidades más altas de D-PDMP; 25 y 50 MPK, no reducir aún más el volumen del tumor (datos no mostrados). En un estudio anterior, se demostró que el t
medio de D-PDMP en ratones sangre es ~ 50 min [13]. Por consiguiente, es factible que más allá de un umbral de 10 MPK, la mayor parte de este compuesto se elimina rápidamente por excreción y por lo tanto no se observó una mayor reducción en el volumen del tumor. Anteriormente, D-PDMP se ha utilizado ampliamente para examinar el papel de glicoesfingolípidos y glycosytransferases en arterial proliferación de las células del músculo liso [1], [23] relacionados, [24], la cicatrización de heridas [1], [23], [24],