Extracto
El cáncer de próstata es una de las principales causas de muerte por cáncer entre los hombres en todo el mundo. En este estudio, el uso de adenocarcinoma transgénico de próstata de ratón (ratones TRAMP), el efecto de la dieta enriquecida con 1% w /w se investigó el ácido ursólico (UA) para evaluar la actividad específica quimiopreventivo etapa contra el cáncer de próstata. Se encontró que los ratones alimentados con la dieta TRAMP UA durante 8 semanas (semanas 4 a 12) la formación retardada de la neoplasia intraepitelial de próstata (PIN). De manera similar, los ratones alimentados con la dieta UA durante 6 semanas (semanas 12 a 18) inhibió la progresión de PIN para adenocarcinoma como se determina por tinción de hematoxilina y eosina. Por último, los ratones alimentados con una dieta TRAMP UA durante 12 semanas (semanas 24 a 36) demostrado un descenso notable el crecimiento del tumor, sin efectos significativos sobre el peso corporal total y la supervivencia global prolongada. Con respecto al mecanismo molecular, se encontró que UA activación de diversos mediadores pro-inflamatorios, incluyendo, NF-kB, STAT3, AKT y IKK fosforilación /β en la próstata dorsolateral (DLP) tejidos que se correlaciona con la reducción en el suero reducido regulado los niveles de TNF-α e IL-6. Además, UA significativamente reducido regulado los niveles de expresión de ciclina D1 y la COX-2, pero hasta regulados los niveles de caspasa-3 según lo revelado por el análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido tumoral. Finalmente, UA se detectó en muestras de suero obtenidas a partir de diversos grupos de ratones alimentados con una dieta enriquecida en cantidad de nanogramos que indica que se absorbe bien en el tracto GI. En general, nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la AU puede ser un excelente agente para la prevención y el tratamiento del cáncer de próstata
Visto:. Shanmugam MK, Ong TH, Kumar AP, Lun CK, Ho PC, Wong PTH, et al. (2012) El ácido ursólico inhibe la iniciación, progresión del cáncer de próstata y prolonga la supervivencia de los ratones TRAMP mediante la modulación de Caminos proinflamatorias. PLoS ONE 7 (3): e32476. doi: 10.1371 /journal.pone.0032476
Editor: Ganesh Chandra Jagetia, Universidad Mizoram, la India
Recibido: 8 de Julio, 2011; Aceptado 28 de enero de 2012; Publicado: 12 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Shanmugam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Nacional Consejo de Investigación médica de Singapur [R-184-000-168-275 y R-184-000-201-275] para GS. APK fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur [Grant R-713-000-119-275] y el Instituto de Ciencias del Cáncer de Singapur, Terapéutica Experimental del Programa I [de Grant R-713-001-011-271]. KMH fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur, Biomedical Research Council de Singapur, y la Fundación Milenio Singapur. Los proveedores de fondos no tiene ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres en los países occidentales después del cáncer de pulmón [1]. La inflamación crónica es cada vez más reconocido como un mediador para muchos tipos de cáncer [2], [3], [4] y la evidencia considerable sugiere que juega un papel importante tanto en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata [5]. En primer lugar, los pacientes con prostatitis sintomática son más susceptibles a desarrollar cáncer de próstata. En segundo lugar, el cáncer de próstata se ha asociado con infecciones de transmisión sexual. En tercer lugar, la disminución del riesgo de cáncer de próstata está relacionado con el aumento de la ingesta de frutas y verduras, antioxidantes, y los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) [6], [7]. En cuarto lugar, la próstata normal sufre atrofia proliferativa inflamatoria (PIA) antes de formar intraepitelial de próstata neoplasia (PIN), el precursor del cáncer de próstata [8]. En quinto lugar, PIA puede sobreexpresar enzima inflamatoria COX-2 [9]. En sexto lugar, los factores de transcripción NF-KB y STAT3, tanto importante mediador de la inflamación, son constitutivamente activa en tejidos de cáncer de próstata [10]. Y séptimo, NF-KB-regulada citoquinas inflamatorias tales como la interleuquina (IL) -6 es un factor de crecimiento autocrino conocido por ser secretadas por los tejidos de cáncer de próstata [11], [12]. Por lo tanto, es razonable sugerir que los agentes que pueden suprimir los mediadores inflamatorios tienen un potencial tanto para la prevención y el tratamiento de cáncer de próstata.
UA (ácido 3β-hidroxi-urs-12-en-28-oico) , un triterpenoides pentacıclico derivado de las bayas, hojas, flores y frutos de las plantas medicinales, como
Rosemarinus officinalis
,
Eriobotrya japonica
,
Calluna vulgaris
,
Ocimum sanctum
, y
Eugenia jumbolana
es uno de esos agentes que se ha estudiado ampliamente por sus actividades antiinflamatorias y anticancerígenas en la última década [13]. UA se ha informado que suprimen la proliferación de una variedad de células tumorales, para inducir la apoptosis, y para inhibir la promoción tumoral, la metástasis y la angiogénesis [14], [15], [16], [17]. Nuestro grupo está actualmente investigando el potencial inexplorado de la UA para la prevención y tratamiento del cáncer de próstata y se ha informado recientemente en dos estudios separados que la AU de hecho puede suprimir el crecimiento de xenoinjerto de próstata en ratones desnudos y también inhibir la metástasis sitio distante mediante la modulación de la CXCR4 /CXCL12 cascada de señalización [18], [19].
El adenocarcinoma transgénico de próstata de ratón (TRAMP) modelo de cáncer de próstata se basa en un transgén que consiste en probasina (PB) antígeno SV40 T promotor impulsado (Tag) expresión. Este ratón transgénico es preferible a los modelos de implantación ya que en este modelo de cáncer de próstata espontáneamente desarrolla a través de una serie de etapas bien definidas. Muestran notables similitudes con la progresión del cáncer de próstata humano desde la fase PIN para adenocarcinoma invasivo que hace metástasis a hígado, pulmón y tracto gastrointestinal a través de la activación de un transgén que está regulada por hormonas por los andrógenos [20], [21]. Por otra parte, todos los ratones TRAMP desarrollar un carcinoma bien diferenciado (WDC) entre 8-12 semanas de edad y metástasis a sitios distantes entre 18 y 24 semanas de edad [22]. En el presente estudio, hemos investigado los efectos potenciales de la AU enriquecen la dieta en la prevención del desarrollo, la progresión, así como la supervivencia global de los tumores en ratones TRAMP. Nuestros datos indican claramente por primera vez que la alimentación de los ratones con una dieta rica en UA puede inhibir significativamente la progresión de PIN para el adenocarcinoma y el crecimiento del tumor. También puede prolongar la supervivencia de ratones a través de la modulación de múltiples cascadas de señalización.
Resultados
El presente estudio fue diseñado para investigar el efecto (s) potencial de la AU en el desarrollo tumoral precoz, de tumor la progresión y la supervivencia global de los ratones TRAMP (Fig 1A).
a, Male TRAMP-ratones de 4 semanas de edad se alimentaron con dieta enriquecida UA durante 8 semanas (Grupo 1).; edad, los ratones 12 semanas durante 6 semanas (Grupo 2); y 24 semanas de edad ratones de 12 semanas (grupo 3). Los ratones se sacrificaron al final de los periodos de tratamiento. Control TRAMP ratones emparejados por edad recibió dieta normal durante los mismos períodos de tiempo. Para los estudios de supervivencia, los grupos 1 a 3 fueron tratados de manera similar mientras que el grupo 4 se alimentó con la dieta enriquecida UA durante 36 semanas a partir de las 4 semanas de edad. B, H & amp; E manchadas secciones del DLP de próstata no TRAMP (i), Grupo 1 Control (ii), y UA-tratada (iii) la próstata TRAMP. C, Diagrama de barras que muestra la incidencia de LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC y PDC en DLP de control y del grupo 1 ratones. Se ha observado un ligero aumento en LG-PIN y una disminución en el HG-PIN (n = 5) después del tratamiento UA. No MDC y PDC se observaron en el grupo 1 y los controles correspondientes. La flecha indica LG-PIN; muescas flecha hacia la derecha indica HG-PIN.
UA suprime la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de la formación
Se ha informado anteriormente que los ratones TRAMP presentan una mayor estratificación del epitelio de la próstata dorsolateral, epiteliales células con núcleos alargados de forma variable con cromatina condensada con patrones planos de bajo grado (LG) PIN (LG-PIN) de 4-8 semanas de edad y micropapilar de mechón insertado y un patrón cribiforme de HG-PIN de 6-10 semanas de edad [ ,,,0],22] .Para investigar si UA suprime la formación de PIN, los ratones 4 semanas de edad, se alimentaron con UA (1%, w /w) que contiene dieta de 8 semanas y se sacrificaron a las 12 semanas de edad (Grupo 1). El peso húmedo de la próstata con las vesículas seminales no cambió apreciablemente en el control y en ratones alimentados UA TRAMP (datos no mostrados). El examen visual de la cavidad abdominal también no reveló la ampliación inusual de las vesículas seminales, lóbulos prostáticos o ganglios linfáticos de la pelvis. El consumo de la dieta enriquecida UA fue bien tolerado, sin evidencia de toxicidad en términos de apariencia animal, comportamiento y el peso corporal.
Mientras que los ratones no TRAMP no mostraron ninguna formación PIN (fig. 1B, i), ratones TRAMP animales mostraron LG- y HG-PIN y carcinoma bien diferenciado (WDC) (Fig. 1B, II y III). Los efectos de la UA-tratamiento en la formación de PIN se muestran en la Fig. 1C. LG-PIN se observó en el 60% de los ratones tratados con el acceso universal en comparación con 40% en los controles, mientras que HG-PIN se observó en el 20% de los ratones tratados con el acceso universal frente al 80% en los controles. Esto demostró que el tratamiento UA había reducido la formación de PIN, así como retraso en la progresión de LG-HG-PIN. Además, sólo un animal mostró moderadamente (MDC) o carcinoma pobremente diferenciado (PDC) en esta etapa. Estos datos sugieren fuertemente que la AU tiene el potencial para ser utilizado como un agente quimiopreventivo.
UA impide la progresión de PIN para el cáncer de próstata
Para determinar si o no la AU puede prevenir la progresión de PIN para cáncer de próstata, 12-semanas de edad TRAMP-ratones fueron alimentados con el control o UA (1%, w /w) enriquecido dieta durante 6 semanas y luego se sacrificaron a las 18 semanas (Fig. 1A, Grupo 2). A las 18 semanas de edad, el DLP de los ratones TRAMP exhibió mayor incidencia de LG-PIN, HG-PIN, WDC y MDC (figura 2A, i & amp; ii.) En comparación con los observados a edades más tempranas (Figura 1B & amp.; DO). No se observaron cambios significativos en la apariencia, el peso corporal y consumo de alimentos entre el Grupo 2 ratones y sus controles. Sin embargo, había una disminución apreciable, pero estadísticamente insignificante en el peso húmedo de la glándula de la próstata con las vesículas seminales en los ratones alimentados con UA (datos no mostrados). UA-tratamiento redujo la incidencia de LG-PIN en un 60%, HG-PIN en un 40% y un 40% WDC (Fig. 2A, iii) .overall, hubo un cambio evidente hacia las incidencias más altas de DLP no canceroso en los ratones tratados UA-
A, H & amp;. e sección teñida de DLP del Grupo 2 de control (i) y tratados con el acceso universal (ii) la próstata TRAMP. La flecha indica LG-PIN, muescas flecha hacia la derecha indica HG-PIN y bloquear flecha hacia la derecha indica WDC. (Iii) Diagrama de barras que muestra la incidencia de LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC y PDC en DLP de control y Grupo 2 ratones. Se observaron reducciones en el PIN, WDC y MDC después del tratamiento UA. B, H & amp; E sección teñida de DLP de Grupo 3 control (i) y se trató-UA (ii) de próstata TRAMP. Como se describe en A; punta de la flecha indica MDC y Chevron indica PDC. C, Western blot de pSTAT3, pAKT, pIKKα /β, y las proteínas p65 en DLP en los Grupos 1, 2 y 3 ratones. lisados DLP se preparó y la inmunotransferencia se realizó como se describe en Materiales y Métodos. La igualdad de carga de proteínas para pAKT y pIKKα /β se determinó por extracción y el sondeo de AKT total y IKK, p65 y STAT3 blots fueron despojados y reprobed para β-actina para determinar la carga igual de proteínas. La densidad de la banda se cuantificó usando el software Image J. NT = no-TRAMP ratones; T = controles irregulares; tratado con UA UA = T + VAGABUNDO-ratones.
UA suprime el crecimiento de cáncer de próstata establecido
in vivo
Para determinar si la AU puede suprimir el crecimiento del cáncer de próstata establecido, 24 semanas de edad TRAMP-ratones fueron alimentados con un control o UA (1%, w /w) enriquecido dieta durante 12 semanas y después se sacrificó a las 36 semanas (Fig. 1A, Grupo 3). A esta edad, el examen visual de la cavidad abdominal reveló claramente vesículas seminales agrandados, DLP y otros lóbulos de la próstata en el control vagabundo ratones. El DLP mostró mayor incidencia de WDC, MDC y PDC en comparación con las observadas en edades más jóvenes, lo que sugiere que una mayoría de los animales tenían lesiones cancerosas en el DLP (Fig 2B, i & amp;. Ii). En contraste, los ratones TRAMP tratados con UA mostraron incidencia reducida de HG-PIN por 40%, WDC por 60%, MDC en un 40%, y PDC por 20% (Fig. 2B iii). En general, los resultados indicaron que los ratones tratados con UA mostraron lesiones no cancerosas que van desde LG-PIN y HG-PIN de estroma normal, comparado con 100% de incidencia de cáncer de próstata en ratones TRAMP de control.
UA inhibe la activación de AKT, IKK /β, NF-kB y STAT3 en ratones TRAMP DLP de
recientemente hemos informado de que la AU puede inhibir AKT, IKK /β, NF-kB y la activación de STAT3 en el cáncer de próstata dependiente e independiente de andrógenos líneas de células [18]. En este estudio, hemos examinado aún más los efectos de la UA enriquecen la dieta sobre la activación de mediadores proinflamatorios en el DLP de los ratones TRAMP (fig. 1A). Como se muestra en la Fig. 2C, aumento progresivo de la fosfo (p) -AKT, -pIKKα /β, pSTAT3, y p65 expresión se observó en el Grupo 1 a ratones TRAMP Grupo 3 como el cáncer progresó gradualmente de formación LG-PIN en el grupo 1 en 4-12 semana de edad, HG-PIN y carcinoma de WD en DLP en el grupo 2 en 12-18 semanas de edad, y WDC, MDC y el PDC en 24-36 semanas de edad. no TRAMP C57BL /6 ratones emparejados por edad, usadas como controles negativos, no mostraron ningún cambio en los niveles de estas proteínas proinflamatorias. Curiosamente, se observó que el tratamiento UA como resultado la inhibición de aproximadamente 40 a 50% en la expresión de estas proteínas fosforiladas en la DLP de grupo 2 y el grupo 3, en comparación con los ratones TRAMP no tratados, mientras que sólo se observó una ligera disminución en el grupo 1 (Fig . 2C). Los niveles de la AKT fosforilada y no IKK fueron mínimamente afectados por UA-tratamiento (Fig. 2C). Tomados en conjunto, nuestros datos indican claramente que la supresión de AKT proinflamatorio, NF-kappa B y la activación de STAT3 desempeña un papel en la inhibición de la progresión del cáncer de próstata en ratones TRAMP por UA.
UA inhibe TNF en suero -α e IL-6 en los ratones TRAMP
TNF-α e IL-6 son las citoquinas pro-inflamatorias, y son considerados como los principales biomarcadores de inflamación. Los grupos 1, 2 y 3 ratones junto con sus controles fueron sacrificados al final de cada protocolo de tratamiento; se recogió sangre por punción cardiaca. El suero obtenido se evaluó para los niveles de TNF-α e IL-6 usando un kit ELISA. Ambos, TNF-α y los niveles de IL-6 aumentó de Grupo 1 al Grupo 3 correspondiente al aumento de la edad y las etapas de la progresión del cáncer (Fig. 3A). UA-tratamiento disminuyó significativamente en suero de TNF-α en el Grupo 2 (por ~ 90%) Grupo 3 (~ 30%) (Fig. 3A, i), así como IL-6 en suero en los tres grupos por ~40-90% ( Fig. 3A, ii).
A. Supresión de TNF-α en suero (i) e IL-6 (ii) por UA-tratamiento. Grupos 1-3 ratones fueron tratados como se describe en Materiales y Métodos. Sandwich ensayo ELISA se realizó según las instrucciones de los fabricantes (R & amp; D Systems, EE.UU.) para determinar los niveles de TNF-α e IL-6. * La significación estadística (P & lt; 0,05). B, análisis inmunohistoquímico de la ciclina D1, la caspasa 3 y COX-2 en los tejidos tumorales en ratones TRAMP Grupo 3. tejidos tumorales DLP, incrustados en bloques de parafina, se cortaron en 5 secciones de tejido micras y probaron para la ciclina D1, la caspasa 3 y COX-2 inmunorreactividades como se describe en los Materiales y Métodos. UA-tratamiento (1% w /w) disminuyó la expresión de la ciclina D1 y la COX-2, pero aumentó la caspasa-3 de expresión en comparación con los controles. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio Olympus BX51 (magnificación, 20 ×). Las células positivas (marrón) se cuantificaron utilizando el Paquete de imágenes-Pro Plus software v6.3 (Media Cybernetics, Inc.).
UA suprime la expresión de ciclina D1, COX-2 y la caspasa-3 en DLP de TRAMP ratones
a continuación se investigó diversos productos génicos implicados en la progresión del cáncer (COX-2), la proliferación (ciclina D1) y la apoptosis (caspasa-3) por inmunohistoquímica en el DLP de los ratones TRAMP Grupo 3. Como se muestra en la Fig. 3B, UA-tratamiento redujo el número de células teñidas positivo para la ciclina D1 de 31% a 3% y COX-2 a partir de 89% a 27%. Como se esperaba, la expresión de la caspasa-3 aumentó de 6% a 95%. Estos resultados indican claramente que la inhibición de múltiples productos de genes implicados en la progresión tumoral y la inducción de apoptosis contribuyen a las actividades antitumorales potentes de la UA como se observa en los tejidos tumorales TRAMP.
UA suprime el crecimiento tumoral y aumenta la supervivencia de los ratones TRAMP
para determinar si UA puede suprimir el crecimiento del cáncer de próstata establecido, 24 semanas de edad TRAMP-ratones fueron alimentados con un control o UA (1%, w /w) enriquecido dieta durante 12 semanas y luego se sacrificaron a las 36 semanas (Fig. 1A, Grupo 3). El peso húmedo de la próstata con las vesículas seminales mostró diferencias significativas en el peso de toda la glándula prostática. se observó diferencia en el volumen tumoral en los ratones tratados con UA; una disminución significativa (P & lt 0,05) (Fig. 4A). También se encontró que la alimentación a largo plazo de la UA enriquece la dieta es segura sin ningún tipo de órgano o tejido toxicidad con un efecto mínimo sobre el peso corporal (Fig. 4B). Durante todo el período de 36 semanas, la edad igualada no transgénico se utilizó ratones C57BL /6 como controles negativos, que mostraron ninguna de las características asociadas con el cáncer de próstata en ratones TRAMP observado. Todos los datos presentados en los efectos de UA-tratamiento en ratones TRAMP (Grupos 1 a 3) son consistentes con los datos de supervivencia que indica que dicho tratamiento puede prolongar significativamente la vida de los ratones (Fig. 4C). Además de los grupos 1, 2 y 3, un cuarto grupo de TRAMP-ratones fueron alimentados con la dieta enriquecida UA durante 36 semanas a partir de 4 semanas de edad (Grupo 4); Los grupos control recibieron la dieta normal (Fig. 1A). Los ratones se obtuvieron en el momento de la muerte basado en la carga tumoral. Se generaron de Kaplan-Meier gráficos de supervivencia para determinar la supervivencia global. Log-rank (Mantel-Cox) parcelas mostraron aumentos en la supervivencia global de los ratones en todos los grupos tratados con el acceso universal. La mediana de supervivencia de los ratones en el grupo control fue de 55 semanas, en comparación con 75 semanas para el Grupo 1 y el Grupo 2, y 72 semanas para el Grupo 4 (P & lt; 0,05). En el grupo 3, la mediana de supervivencia fue de 68 semanas, pero no alcanzó significación estadística (Fig. 4C). Por lo tanto, se puede concluir que la AU-tratamiento es más eficaz cuando se comenzó temprano, cuando el vagabundo-ratones no mostró cáncer o sólo primeras etapas de desarrollo PIN.
A, los ratones fueron sacrificados a las 36 semanas y el el volumen del tumor se midió como se describe en materiales y Métodos. Las barras de error representan SEM. * La significación estadística (P & lt; 0,05). B, El peso corporal de los ratones TRAMP Grupos 1-3 y sus controles. C, el efecto de la UA-tratamiento sobre la supervivencia a largo plazo de los ratones TRAMP. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se llevó a cabo para el control y ratones TRAMP tratados con UA. tiempo medio de supervivencia fue de 55 semanas para el control (n = 5). tiempo medio de supervivencia para el grupo 1, grupo 2, grupo 3 y el grupo 4 fue de 75, 75, 68, y 72 semanas, respectivamente. importancia global se determinó mediante la prueba de log-rank (Mantel-Cox). UA dieta enriquecida significativamente la supervivencia prolongada.
Detección de la UA en el suero
UA se detectó en el suero de los 3 grupos de TRAMP-ratones alimentados con la dieta enriquecida UA. Las concentraciones detectadas varía de aproximadamente 600 a 1300 ng /ml sin significación estadística entre los grupos (Fig. 5B). Como se espera que los niveles séricos de UA de haber alcanzado la concentración de estado estacionario en los tres grupos, las diferencias en la concentración de por lo tanto reflejan las variaciones individuales. No se detectaron picos adicionales en el suero, lo que indica que la AU no genera metabolitos (Fig. 5A III y IV). Nuestro estudio presenta la primera evidencia experimental de que la UA se absorbe bien después de la alimentación oral y las concentraciones séricas alcanzadas son suficientes para provocar efectos biológicos como es evidente por la inhibición del crecimiento del tumor de próstata en ratones TRAMP.
A, (i) cromatogramas de iones de los extractos de suero de los ratones que no habían recibido UA (en blanco). (Ii) espectro de exploración llena que muestra el pico de m /z con una masa molecular de 469 corresponde a patrón interno (IS) ácido glicirretínico. (Iii) Análisis completo espectro mostrando el pico m /z con una masa molecular de norma UA a 455 y se encuentra en 469 y (iv) Análisis completo espectro de la muestra, tiempo de retención fue de 1,7 y 1,96 minutos, respectivamente, para ambos es y de la muestra. Los cromatogramas son representativos de 3 experimentos independientes. B, las concentraciones séricas de UA se calculó usando software Analyst 1.4.2 de la ecuación de regresión lineal de la relación de área de pico frente a la concentración de la curva de calibración. Las barras de error representan el SEM.
Discusión
El modelo TRAMP ratón es un modelo de cáncer de próstata desarrollar espontáneamente bien establecido que imita la progresión del tumor de próstata natural, desde el PIN para el cáncer de próstata metastásico altamente invasivo [ ,,,0],20] en los seres humanos. En ratones TRAMP, tumor se origina a partir tanto DLP y ventral de próstata (VP), como resultado de la expresión de Tag que está restringido principalmente a los lóbulos prostáticos [22], mientras que el cáncer de próstata humano se origina en la zona periférica que es similar a la DLP en ratones [23]. Los efectos contra el cáncer de diversos agentes quimiopreventivos, incluyendo análogos de ácido oleanólico, sulforafano, polifenoles obtenidos a partir de té verde, constituyentes de ajo, la curcumina, 3, 3'-diindolylmethane y genisteína han sido evaluadas anteriormente en el desarrollo de forma espontánea la tumorigénesis de próstata en ratones TRAMP [24], [25], [26]. Además, el licopeno, γ-tocoferol, silbinin y tomate dieta enriquecida todos se han encontrado para aumentar la supervivencia y retrasar la progresión de PIN para el adenocarcinoma y disminuir la incidencia de carcinoma pobremente diferenciado [23], [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Sin embargo, el estudio de quimioprevención con AI en un modelo de cáncer de próstata no se ha llevado a cabo con anterioridad, y sólo recientemente nuestro grupo ha descrito por primera vez que la AU dieta enriquecida de hecho puede inhibir la metástasis del tumor de próstata mediante la modulación del eje CXCR4 /CXCL12 en ratones TRAMP [19 ]; aunque no se evaluó el efecto de la UA en el desarrollo y progresión del tumor. En el presente estudio, se estudió el efecto del tratamiento UA en tres diferentes etapas de desarrollo del cáncer en ratones TRAMP. Se encontró que el UA puede inhibir significativamente el desarrollo y progresión del cáncer en las tres fases. En el grupo 1 de ratones, se observó efectos supresores mensurables de UA en el desarrollo PIN, mientras que en los ratones del grupo 2, el desarrollo de PIN de alto grado se inhibió como se evidencia por la reducción de PIN bien diferenciado. Por otra parte, UA, inhibió la progresión de PIN preneoplásicas en DLP y el volumen del tumor, sin efectos adversos observables en el grupo de 3 ratones. El desarrollo de una gran cantidad de lesiones no cancerosas en este grupo en comparación con el predominio de las lesiones cancerosas en ratones TRAMP de control es evidente. Los resultados de la clasificación histológica sugirieron además que UA puede inhibir predominantemente el desarrollo de las lesiones precancerosas en la mayoría de los ratones, y por lo tanto prevenir el desarrollo de lesiones malignas muy invasivas. UA también aumentó significativamente la supervivencia global por hasta 20 semanas retrasa la progresión de PIN para el adenocarcinoma, y la disminución de la incidencia de la PDC.
Por otra parte, se observó que los efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos de la UA son asociado con la supresión de la ciclina D1 y la COX-2 y la inhibición de NF-kappa B, STAT3, AKT y la activación /β IKK en las próstatas de ratones TRAMP. Tal inhibición se correlacionó con la longitud del período de alimentación, como es evidente por la inhibición sustancialmente mayor en el grupo 3 ratones, que recibieron UA continuamente for12 semanas consecutivas. La reducción de TNF-α y los niveles de IL-6 también se correlacionó con la longitud del período de tratamiento. La supresión de la ciclina D1 y la COX-2 así puede ser una consecuencia de la reducción de la activación de NF-KB y STAT3 como estos factores de transcripción pro-inflamatorios regulan la expresión de la ciclina D1 y la COX-2 [2], [3], [ ,,,0],31]. El aumento de expresión de la caspasa-3 es indicativo de apoptosis. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren claramente que la inhibición de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis juega un papel fundamental en la inhibición mediada por UA de la progresión del tumor de próstata en ratones TRAMP. El hecho de que la AU se detectó en todas las muestras de suero en concentraciones significativas indican además que la AU se absorbe bien y la alimentación oral puede ser considerado como una ruta de administración preferida para un quimiopreventivo potencial y agente terapéutico para el cáncer de próstata. Por lo tanto, se puede concluir que la AU-tratamiento inhibe la progresión de PIN para adenocarcinoma, redujo el crecimiento del tumor y también prolongó la supervivencia de los ratones. En conjunto, estos resultados indican que la AU puede tener un tremendo potencial para su uso como un agente quimiopreventivo, así como un agente prometedor para el tratamiento del cáncer de próstata.
En resumen, nuestros datos demuestran claramente que la alimentación UA retrasa la progresión de la próstata cáncer en ratones a través de la modulación de varias moléculas pro-inflamatorias. Debido TRAMP es un modelo espontáneo de cáncer de próstata que imita estrechamente las formas progresivas de la enfermedad humana, los resultados de este estudio proporcionan una base sólida para la búsqueda de nuevos estudios sobre el uso de la UA ya sea solo o en combinación con otra terapia para la prevención y /o tratamiento del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Reactivos
UA (98% puro) se adquirió de Guangxi Changzhou Productos Naturales Development Company Ltd (china). UA se mezcló con dieta normal de ratón al 1% w /w y se almacena a 4 ° C. Tris, glicina, NaCl, SDS, ácido glicirretínico y el anticuerpo β-actina se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y anticuerpo secundario conjugado con HRP se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra fosfo-STAT3 (Tyr 705), fosfo-AKT (Ser 473), STAT3 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos frente a AKT, p65, fosfo-específico IKK /β (Ser 180 /Ser 181), y IKK se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). TNF-α y la IL-6 kits ELISA se adquirieron de Research Instruments (MA, EE.UU.). reactivo de Bradford se adquirió de Bio-Rad (Hercules, CA). kit de tinción inmunohistoquímica fue adquirido de Dako (Dinamarca).
TRAMP ratones de cría y genotipado
Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices de Singapur NACLAR (Ley partir de noviembre de 2004) para el uso de animales de laboratorio y la atención y el cuidado aprobado por NUS Animales institucional y el empleo Comisión número de protocolo 052/09. En pocas palabras, 4 semanas de edad TRAMP ratones hembra adquiridos de The Jackson Laboratory se aparearon con ratones C57BL /6 macho en el NUS CARE (Singapur). Las crías fueron genotipados para el transgén (Tag) a las 3 semanas de edad; Se extrajo ADN de la cola SNIPS usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, EE.UU.) y se cuantificó usando NanoDrop (Thermo Scientific, EE.UU.). Uno g del ADN fue tomada para el análisis de PCR. reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mezcla de reacción contenía 10 l de 5 x tampón QIAGEN PCR, 1 g de ADN, 0,6 mM de cada uno de cebadores directo e inverso, 2 l de mezcla de dNTP y 1 l de enzima polimerasa Taq en un volumen final de 50 l. Los cebadores usados para el genotipado, cebador directo: 5'-CCG CGG GTC GAC AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3 ', el cebador inverso: 5'-AGG CAT TCC ACC ACT GCT CCC ATT CAT C-3'. Las condiciones de PCR fueron 94 ° C durante 3 min, 94 ° C durante 30 segundos, 62ºC durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, repita los pasos 2-4 para 35 ciclos, 72 ° C durante 2 min y se mantuvo a 4 DO. Los productos de PCR se corrieron en gel de agarosa al 1% que contenía 1 × GelRed mancha de gel de ácido nucleico a partir de Biotium (Hayward, CA). bandas teñidas se visualizaron bajo luz UV y se fotografiaron utilizando BioRad Gel Doc sistema EZ (Bio-Rad, EE.UU.). cachorros positivos transgenes se utilizaron para los experimentos posteriores.
clasificación patológica de los tejidos tumorales
La clasificación patológica de cáncer de próstata TRAMP se realizó según el sistema de clasificación descrito anteriormente [22]. lesiones de próstata en el DLP se clasificaron histológicamente como (conducto forrado con una sola capa de células epiteliales secretoras rodeadas por dos o tres capas de células de estroma fibrousmuscular) normales, neoplasia de bajo grado intraepitelial prostática (PIN) [las células epiteliales con núcleos de forma variable alargadas con condensada cromatina], PIN de alto grado (la estratificación del epitelio y la formación de nudos, la presencia de estructuras micropapilares y cribiforme), carcinoma bien diferenciado (WDC) (células epiteliales invadir el estroma fibromuscular), y moderadamente diferenciado (MDC) a pobremente diferenciado (PDC) adenocarcinoma de la próstata (láminas de células neoplásicas con poco o nada de estructuras glandulares). 15 campos seleccionados al azar microscópicos en hematoxilina y eosina (H & amp; E) secciones del DLP teñidas se busca la presencia y patológico grado del cáncer de próstata en ratones control y UA alimentado TRAMP
in vivo.
estudio antitumoral
Los ratones TRAMP machos endogámicos, 4 semanas de edad, se mantuvieron en habitaciones con temperatura controlada con un ciclo de 12 h de luz /oscuridad. Todos los ratones se pesaron antes del inicio del experimento. Los ratones fueron asignados al azar en los siguientes grupos alimentados UA y de control (n = 5). Grupo 1: 4 semanas los ratones TRAMP de edad fueron alimentadas con UA (1% w /w) dieta enriquecida durante 8 semanas; Grupo 2: 12 semanas de edad ratones TRAMP fueron alimentados con la dieta enriquecida UA durante 6 semanas; Grupo 3: ratones TRAMP de 24 semanas de edad se alimentaron con dieta enriquecida UA durante 12 semanas. Los ratones de control recibieron TRAMP dieta normal. El peso corporal y el tamaño del tumor se registraron dos veces por semana y el tamaño del tumor se determinó por Nonio y se calculan utilizando la fórmula [longitud x (anchura)
2] /2. Los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación seguido por dislocación cervical. Las muestras de sangre, recogidas por punción cardiaca, se mantuvieron a 4 ° C durante la noche y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 20 min para obtener el suero, que se almacenó en alícuotas a -80 ° C. El volumen del tumor se midió y se pesa. glándula de la próstata se microdisected de las vesículas seminales en un estereomicroscopio, fijado en el 10% de fosfato de formalina tamponada para H & amp; E y el análisis inmunohistoquímico
ensayo de ELISA para TNF-α e IL-6
almacenados. muestras de suero se analizaron para el TNF-alfa e IL-6 niveles usando el kit ELISA (R & amp; D Systems, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. protocolos de ELISA Sandwich fueron utilizados y de calibración se realizó con TNF-α estándar y IL-6 proporcionada en el kit.
Western Blot
dorsolaterales tejidos de tumor de próstata se lisaron en tampón de lisis que contiene (20 mM Tris (pH 7,4), NaCl 250 mM, EDTA 2 mM (pH 8,0), 0,1% de Triton X-100, 0,01 mg /ml de aprotinina, 0,005 mg /ml de leupeptina, PMSF 1 mM, y NaVO4 4 mM). Los lisados se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min para eliminar el material insoluble y 50 g de proteína se resolvieron en un gel de SDS 10%.