Extracto
El reloj circadiano central dentro del núcleo supraquiasmático (SCN) juega un papel importante en la organización y coordinación de muchos de los procesos que regulan la proliferación de células de cáncer y el crecimiento tumoral en sincronía con el diario de luz /oscuridad ciclo temporal que puede contribuir a la prevención del cáncer endógeno. bioenergéticos sustratos y productos intermedios moleculares necesarios para la construcción de la biomasa del tumor cada día se derivan tanto de la glucólisis aeróbica (efecto Warburg) y el metabolismo de los lípidos. El uso de xenoinjertos de cáncer de mama humano aislado de tejidos cultivados en ratas desnudas, se determinó que circula factores sistémicos en el huésped y el efecto Warburg, las actividades de captación de ácido /metabolismo y señalización de crecimiento linoleico en el tumor se regulan de forma dinámica, coordinada e integrada dentro de la estructura de tiempo circadiano más de un 24 horas de luz /oscuridad ciclo impulsado por SCN producción pineal nocturna de la hormona melatonina contra el cáncer. Una luz tenue por la noche (LAN) inducida por la supresión de la melatonina altera este equilibrio huésped /cáncer circadiano-regulada entre varios mecanismos de señalización de prevención de cáncer importante, lo que lleva a la hiperglucemia y la hiperinsulinemia en el huésped y la glucólisis aeróbica fuera de control, señalización de los lípidos y la actividad proliferativa en el tumor.
Visto: Blask DE, Dauchy RT, Dauchy EM, Mao L, colina SM, Greene MW, et al. (2014) Exposición a la luz en la noche Interrumpe Host /Cáncer circadianos reguladoras Dinámica: impacto sobre el efecto Warburg, señalización de lípidos y Prevención de crecimiento del tumor. PLoS ONE 9 (8): e102776. doi: 10.1371 /journal.pone.0102776
Editor: Shin Yamazaki, Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Septiembre, 2013; Aceptado: June 23, 2014; Publicado: 6 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Blask et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue generosamente apoyada por la Asociación Americana de las Subvenciones del Laboratorio de Ciencia Animal (www.aalas.org) para Animales de Laboratorio de Ciencias (GLAS) Premio a la IDT, Institutos nacionales de Salud (www.nih.gov) conceder R21CA129875 a DEB, Escuela de la Universidad de Tulane Medicina (www.tulane.edu) y Louisiana Consorcio de Investigación del cáncer (www.louisianacancercenter.org) Puesta en marcha de Grant 631.455 a DEB y los Institutos nacionales de Salud de subvención R01CA054152 de SMH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el interés renovado en el metabolismo del crecimiento del cáncer [1] - [3], ha llevado recientemente a una intensa re-evaluación del papel desempeñado por la glucólisis aeróbica (por ejemplo, el efecto Warburg) en la progresión del tumor maligno [4 ]. Con el fin de satisfacer sus necesidades bioenergéticos para apoyar la biosíntesis de los componentes moleculares y celulares necesarios para aumentar rápidamente la biomasa del tumor, las células cancerosas se basan principalmente en el efecto Warburg en lugar de la fosforilación oxidativa [1] - [4]. De hecho, el efecto Warburg se caracteriza por la robusta captación celular de glucosa y su metabolismo en lactato a través de la glucólisis a pesar de un abundante suministro de oxígeno [1] - [4]. Los estudios se han centrado en la transducción de señales y las redes de la transcripción, incluyendo AKT [5], inducible por hipoxia del factor 1 alfa (HIF-1α) y c-MYC [6] que impulsan el efecto Warburg para redirigir la bioenergética celulares de cáncer a la generación de molecular intermedios para apoyar la división celular del cáncer implacable [1] - [3]. la proliferación de células del cáncer y el crecimiento tumoral también se basan en la captación celular de ácido linoleico (LA), un ácido esencial omega-6 grasos (FA) que es la más frecuente FA en la dieta occidental [7] - [9]. En muchos tumores, células de cáncer de asimilación de LA a través de un mecanismo de transporte dependiente de AMPc y metabolizan al ácido mitógeno 13-hydroxyoctadecadienoic (13-HODE) por la enzima 15-lipoxigenasa-1 [9] - [12], la actividad de los cuales está regulado por la activación del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento 1 (IGF-1), los receptores [13], [14] a la insulina. En muchos tumores, incluidos los xenoinjertos de cáncer humano [9], [11], [12], 13-HODE ejerce un efecto de retroalimentación positiva sobre el EGF y el crecimiento del receptor de IGF-1 de señalización de vías para incrementar la fosforilación aguas abajo de ERK1 /2 y AKT que lleva a proliferación amplificado celular y respuestas de supervivencia [15]. Hay que señalar, sin embargo, que en algunos otros sistemas de modelos experimentales de cáncer y contextos 13-HODE pueden desempeñar un papel antiproliferativo [16].
procesos homeostáticos que regulan la fisiología de los mamíferos y el metabolismo en las células, tejidos y órganos de exposiciones los ritmos circadianos que están sincronizados por el ciclo luz /oscuridad que abarca cada día de 24 horas. Esto se logra a través de la actividad oscilatoria cronometraje endógeno del SCN en el hipotálamo, que recibe información sobre el ciclo luz /oscuridad de los ojos, sobre todo a través de las células ganglionares de la retina melanopsina positivo intrínsecamente fotosensibles con la aportación adicional de conos y bastones. información Photic luego es procesada por el SCN y transduce en una serie de salidas hormonales y neuronales a los tejidos diana periféricos [17]. En los seres humanos, la alteración de la regulación circadiana de los procesos metabólicos, incluyendo la glucosa y el metabolismo de los lípidos inducida a través de la sincronización anormal de la luz puede conducir a un mayor riesgo de diabetes tipo 2, la obesidad [18], [19] y diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama que tiene han informado que los trabajadores del turno de noche [20], [21]. La señal de salida de la SCN que refleja con mayor fiabilidad la actividad circadiana es la producción glándula pineal durante la noche de la melatonina que se suprimió por LAN. La señal circadiano de melatonina se ha relacionado con la organización temporal y la sincronización de muchas actividades fisiológicas y metabólicas, incluida la glucosa y el metabolismo lipídico [19], [22], [23].
Las salidas del SCN se cree que la coordenada el tiempo biológica de, y en el caso de la melatonina, modulan los procesos que regulan la iniciación del tumor, promoción y progresión incluyendo la proliferación celular, la síntesis de ADN, la supervivencia celular /apoptosis, Traverse ciclo celular, daño de ADN /mecanismos de reparación, las actividades de supresores de tumores y de células tumorales invasión /metástasis [24] - [27]. Hemos demostrado anteriormente que la melatonina, en las concentraciones en sangre nocturnos fisiológicas, inhibe directamente la síntesis de ADN y crecimiento de tumores mediante la supresión de la captación tumoral dependiente de AMPc de LA y su metabolismo a la molécula mitogénica 13-HODE [10], [12] a través de un receptor de melatonina mecanismo mediado. Sin embargo, la posible participación de la regulación circadiana y las consecuencias de su alteración en el metabolismo del cáncer, en particular el efecto Warburg, nunca se han abordado ya que las investigaciones en esta área se han basado, casi exclusivamente, en
in vitro estudios en
que la influencia de anfitrión cáncer de la regulación circadiana central es ausente. Postulamos que la bioenergética diaria, la señalización metabólica, y las actividades de proliferación necesarios para la construcción de la infraestructura de exhibición del tumor ritmos circadianos dinámicos, tanto en el huésped y el tumor que contribuyen a la prevención del crecimiento tumoral. Estos ritmos, que dependen de la producción nocturna de melatonina, una señal para impedir el crecimiento del tumor circadiano, se ven afectados por la exposición de la sede de LAN que resulta en un aumento del metabolismo y el crecimiento del tumor.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Tulane Institucional Cuidado de Animales y el empleo (NIH Aseguramiento#A4499-01). Todos los animales se mantuvieron en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care, Internacional. Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con ketamina /xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Reactivos
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) -Grado cloroformo, éter etílico, metanol, glacial de ácido acético, heptano, hexano, y Sep-Pak C18 cartuchos para la extracción de muestras de HPLC se adquirieron de Fisher química (Pittsburgh, PA). ácido graso libre, éster de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos, las normas de éster metílico de aceite de colza, así como trifluoruro de boro-metanol, cloruro de potasio, cloruro de sodio, ácidos perclórico y tricloroacético se adquirieron de Sigma Scientific (St. Louis, MO). Los estándares de HPLC, (+/-) 5-HETE y 13 (S) -HODE), así como agua ultrapura se compraron a Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan).
Animales, condiciones de iluminación , la implantación del tumor, y el crecimiento
ratas hembra desnudos en destete (HSD: RH-
Foxn1 [UNR]
) entre 35 y 50 g se alojaron en jaulas de policarbonato transparente (2 ratas /jaula) en las cámaras de exposición laboratorio de luz de instalación en un 12 horas de luz /12 horas de oscuridad (LD, 12:12) ciclo (0600-1800 luces en horas o tiempo Zeitgeber Zt0-ZT12 a 23 ° C y 45-50% de humedad y se deja para aclimatarse a estas condiciones durante dos semanas. se proporcionaron ratas agua y comida (Purina Prolab RMH 1000) ad libitum a lo largo de la duración de los estudios. Después del período de aclimatación, los animales fueron separados al azar en un grupo control de 36 ratas que se mantuvo en el LD, 12:12 régimen de iluminación (oscuridad completa durante la fase oscura) y otro grupo de 36 ratas mantenidas en LD, 12:12 con la exposición a atenuar LAN durante la fase oscura. la intensidad de la luz durante la fase de luz de 12 horas en tanto grupos fue proporcionada por un sistema de lastre /lámpara (GE vatios Miser, F34CW-RS-WM, bombilla de 34 W) en cada cámara que proporciona un estímulo de luz brillante estable en el nivel de los ojos de los animales de 141 mW /cm
2 ( 345 lux). En la cámara de proporcionar LAN tenue, había un segundo sistema de lastre /lámpara (GE Starcoat, F32T8-SP-11, la bombilla de 32 W) que emite constante estímulo de luz tenue en el nivel de los ojos de los animales de 0,08 mW /cm
2 ( 0,2 lux) durante la fase de oscuridad de 12 horas [12]. Seis semanas más tarde, los animales fueron implantados con negativa de esteroides receptor (SR-) MCF-7 xenoinjertos de cáncer de mama humano de una manera aislada de tejido, como se describe anteriormente [12]. Estos tumores se habían desarrollado durante varios pasajes de un subconjunto de SR + xenoinjertos que había perdido la expresión de receptores de estrógeno y progesterona y se convirtió en el estrógeno no responde. Estos xenoinjertos se caracterizaron histológicamente como pobremente diferenciado, grado 3, adenocarcinoma infiltrante ductal como se describe anteriormente [12]. En el transcurso del estudio de crecimiento circadiano /tumor, cuando los tumores alcanzaron un tamaño suficiente para la medición ratas fueron sometidas a la luz de CO
2 narcosis, y dimensiones del tumor se midieron a través de la piel con el pie de rey cada dos días; dimensiones del tumor se convirtieron a pesos de los tumores se estima utilizando una fórmula de regresión lineal y las tasas de crecimiento calculadas como se describe anteriormente [9], [12]. El peso final del tumor en el estudio de crecimiento del tumor se determinó pesando al final del experimento. Al final de cada uno de los períodos de crecimiento del tumor, cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 5-6 g tanto para el control y los grupos expuestos-LAN, subconjuntos de 6 animales se sacrificaron al azar y sus correspondientes tumores se recogieron cada 4 horas durante un solo 24 horas periodo a los 6 puntos de tiempo circadiano diferentes (por ejemplo, 0800 horas = ZT2, 1200 horas = ZT6, 1600 horas = ZT10, 2000 horas = ZT14, 2400 horas = ZT18 y 0400 horas = ZT22) como se describe anteriormente [28]. Debido a las tasas de crecimiento de tumores muy acelerado en el grupo de LAN, xenoinjertos (n = 36) alcanza el tamaño de la cosecha específica de 5-6 g aproximadamente dos semanas antes de la de los xenoinjertos (n = 36) en el control de LD 12:12 grupo.
Extracción de sangre arterial de ratas anfitrión tumorales
Después de dos semanas de los regímenes de iluminación descritos anteriormente, los animales fueron sometidos a una serie de seis sangre bajo volumen dibuja a través de cardiocentesis para recoger ventricular izquierda sangre arterial, como se describe anteriormente [9], [10], [12], [28] en un período de 30 días antes de la implantación del tumor (ver arriba). En pocas palabras, las extracciones de sangre se realizaron a intervalos de 4 horas designadas durante un período de 24 horas que comienza a ZT2 (08.00 horas) con cada animal que está siendo sometido a cardiocentesis sólo una vez cada 5 días durante el período de 30 días antes de la implantación del tumor. Esto se hizo para que los animales para restaurar su pérdida pequeño volumen de sangre y para reducir al mínimo el estrés y disminuyen los efectos potenciales del procedimiento en materia de alimentación y la morbilidad /mortalidad. Los animales se anestesiaron ligeramente por CO
2 inhalación (70% de CO
2/30% de aire); 1 ml muestras se tomaron desde el ventrículo izquierdo por punción cardiaca (menos de 5% del volumen total de sangre) mediante una jeringa de tuberculina (calibre 25, 3/8 en; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) humedecido con heparina sódica (1.000 U /ml; Elkin-Sinn, Cherry Hill, NJ), como se describe anteriormente. muestras de sangre durante la fase oscura (es decir, 2000, 2400, 0400 horas) se llevó a cabo bajo una lámpara roja luz de seguridad (Kodak 1A, el modelo B, nº de catálogo 152 1517; 120 V, 15 W, Rochester, NY) con el fin de preservar el aumento de melatonina nocturna [9], [10], [12], [28]. la exposición de la lámpara roja de los animales a nivel del ojo durante el breve procedimiento cardiocentesis 45 seg no fue superior a 0,48 ± 0,01 lux (1,16 ± 0,04 mW /cm
2). No hubo complicaciones debido a la anestesia o cardiocentesis durante el período de muestreo de sangre; la supervivencia fue del 100% y los animales se activa inmediatamente después del procedimiento. Las muestras de plasma se almacenaron a -20 ° C hasta que se ensayaron para la melatonina, la insulina, la glucosa, lactato y ácidos grasos totales.
Colección de sangre arterial de ratas donantes Tumor de perfusión
Antes de la iniciación de la perfusiones tumorales, 3-4 adultos desnudos ratas hembras mantenidas en 12:12 fueron anestesiados usando una solución de ketamina-xilazina (89,1 mg /kg y 9,9 mg /kg, IP). Los animales fueron heparinizados mediante inyección yugular de heparina sódica (25 mg /kg; Sargent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL). Cuarenta a 50 mls se recogió sangre arterial entre 0600 y 0900 horas (niveles bajos de melatonina) de la arteria carótida derecha de ratas donantes a través de catéter para los experimentos de perfusión tumoral (3 a 4 perfusiones por grupo), se reunieron, se filtraron a través de un "× 2 2 "almohadilla de gasa (Kendall Curity gasa de esponja; Tyco Healthcare, Mansfield, MA), almacenado en un depósito bajo aceite mineral (Cat#M1180-500 ML;. Sigma Scientific, St. Louis, MO) y enfriado a 4 ° C en un depósito de hielo y se mezcló suavemente mediante agitación mecánica (Modelo#6975-171; Corning, Nueva York) [9], [10], [12], [28]
tejido tumoral-perfusión aislada
In Situ
Cuando (SR-) MCF-7 xenoinjertos de cáncer de mama humano alcanzados 5-6 el peso del tumor estimado gm, los animales fueron preparados para mediciones de diferencias arteriales-venosa de los ácidos grasos totales (AGT), Los Ángeles, 13-HODE, glucosa, lactato, PO
2, CO
2 y pH entre 0600 y 1000 horas cuando los niveles de melatonina endógena eran bajos. xenoinjertos de tejidos aislados fueron perfundidos
In situ
con donantes rata sangre entera a la que ya sea la melatonina sintética (Sigma, St. Louis, MO) y /o 13 (S) -HODE (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), o MT
1 /MT
2 melatonina antagonista del receptor S20928 (se añadió una generosa donación del Instituto de Investigaciones Internacionales Servier, Courbevoie Cedex, Francia) como se ha descrito anteriormente [9], [10], [12 ], [28]. Conjuntos (3 ó 4 tumores /perfusión) de xenoinjertos de cáncer de mama humano aislado de tejidos fueron perfundidos
In situ
durante 1 hora como se describe anteriormente [9], [10], [12], [28] con todo -sangre recogido de ratas donantes. La incorporación de [
3H] timidina en el ADN del tumor se inició 20 minutos antes del final de cada perfusión mediante la inyección de 20 l de solución salina fisiológica que contenía 2 Ci [metil-
3H] timidina /gm (New England Nuclear, Perkin Elmer, Boston, MA) calculó el peso del tumor en el catéter arterial. A la finalización de cada uno de perfusión, los tumores eran de congelación fijada en nitrógeno líquido, se pesa y se almacena a -85 ° C hasta su análisis.
arterial glucosa, lactato y Medidas /gas ácido
Durante el curso de este arteriales estudio de muestras de sangre entera se tomaron para mediciones de pH, pO
2, pCO
2, los niveles de glucosa y lactato, y el hematocrito usando un analizador iSTAT1 y CG4 + y CG8 + cartuchos (Abbott Laboratories, East Windsor, NUEVA JERSEY). Los valores de la glucosa y el lactato son reportados como mg /dL y mmol /L, y por pedido
2 y pCO
2 como mmHg. los niveles mínimos de detección de pH, pO
2 y pCO
2, los valores de glucosa y lactato fueron, respectivamente, 0,01, 0,1 mm Hg, 0,1 mm Hg, 0,2 mg /dl y 0,01 mmol /L.
la melatonina y la insulina se midieron los análisis
los niveles de melatonina en plasma arterial mediante radioinmunoensayo utilizando la rata melatonina
125I - kit de radioinmunoensayo (Trabajo Diagnostika Nord, Nordham, Alemania) y se analizaron usando un Packard Cobra 5005 Automatizado Contador Gamma (Palo Alto, CA), como se describe anteriormente [10], [12]. los niveles de insulina en plasma arterial se midieron usando un kit ELISA (Diagnostic Systems Labs., Webster, TX).
grasos extracción de ácidos y ácidos análisis
plasma arterial grasos libres (FFA), triglicéridos (TGA ), fosfolípidos (PL), y ésteres de colesterol (CE) fueron extraídos de muestras de 0,1 ml, como se describe anteriormente [9] - [10], [12], [28]. para la extracción de ácido Antes heptadecanoico (100 g), que había sido disuelto en cloroformo (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), se utilizó como estándar interno. ésteres metílicos de ácidos grasos (FAS) fueron analizados utilizando una impresora Hewlett Packard (Palo Alto, CA) modelo 5890A Cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama (modelo#7673 A) auto-inyector (modelo#7673 S), y el integrador (modelo#3396A). Todas las separaciones se llevaron a cabo usando un 0,25-mm × columna capilar de 30 m (modelo#2380; Supelco, Inc., Bellefonte, PA) a 190 ° C, con helio como gas portador (velocidad lineal de 20 cm /s; dividida 100:1). El orificio de inyección y el detector se ajustaron a 220 ° C. Todos los ésteres metílicos se identificaron sobre la base de su tiempo de retención, en comparación con la de los estándares conocidos. límite detectable mínimo para el ensayo fue de 0,05 g /ml.
extracción Tumor lisado, la extracción de proteínas y análisis de transferencia Western
tumores congelados se pulverizaron y se homogeneizaron manualmente en HEPES 50 mM, pH 7,5, 150 NaCl mM, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,1% desoxicolato de sodio, mM Na3VO4 1, 100 nM ácido ocadaico, y 1 × proteasa Set cóctel inhibidor I (Calbiochem /EMD Biosciences, Billerica, MA). lisados tumorales se centrifugaron a 15.300 × g durante 20 minutos. Los sobrenadantes se dividen en partes alícuotas y se almacenaron a -80 ° C. Las concentraciones de proteína de los sobrenadantes se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). La proteína total (80 g por muestra) se separó electroforéticamente en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% y a electrotransferencia sobre una membrana de Hybond. Después de la incubación con leche no grasa al 5% en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween, las inmunotransferencias se sondaron con anticuerpos frente a fosfo-AKT (Ser
473), c-MYC (Cell Signaling Tech., Inc., Danvers , MA) o HIF-1α (BD Biosciences, San Jose, CA). Las mismas transferencias fueron despojados y volvieron a sondar con anticuerpos para AKT (Cell Signaling Technology, Inc.), tubulina o GAPDH (gliceraldehído deshidrogenasa-3-fosfato) (Millipore Corp., Billerica, MA).
Estadística análisis
la presencia de ritmos tumorales significativas durante el período de 24 horas y el grado de su robustez, ya sea en el control circadiano reguladas o grupos expuestos-LAN -disrupted se determinaron mediante análisis utilizando el software cosinor Periodograma (VBScript) . los datos individuales del tumor primas recogidas durante un período de 24 horas se analizaron mediante este método con un periodo de 24 horas fijo. Las diferencias estadísticas entre los valores medios en el grupo expuesto-LAN en comparación con el grupo control en cada punto de tiempo circadiano se evaluaron utilizando la prueba t de Student para datos independientes una. Las diferencias estadísticas entre medias de grupos en los estudios de perfusión tumorales se determinaron mediante un ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni para realizar las siguientes comparaciones múltiples entre todos los grupos: control frente melatonina; control versus la melatonina + 13-HODE; control versus 13-HODE; la melatonina en comparación con melatonina + 13-HODE; melatonina + 13-HODE frente al 13-HODE; y la melatonina frente al 13-HODE. Las diferencias en las pendientes de las rectas de regresión (es decir, tasas de crecimiento del tumor) entre grupos se determinaron mediante análisis de regresión y pruebas de paralelismo (prueba t de Student). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p & lt; 0.05. La prueba de la t de Student, ANOVA de un factor seguido por el test post hoc de Bonferroni y análisis de regresión lineal fueron llevadas a cabo utilizando el software GraphPad Prism 5.
Resultados
regulación circadiana y la alteración de los factores del huésped que circula
examinamos primero potenciales dinámica circadianos y su interrupción por LAN en un número de factores del huésped, incluyendo los niveles plasmáticos de melatonina, el total de Fas (TFA), lA, glucosa, lactato y de insulina en ratas portadoras de aislado de tejido, esteroides negativa del receptor (SR-) MCF-7 humanos xenoinjertos de cáncer de mama en una luz /oscuridad (LD) 12:12 ciclo [12]. los niveles de melatonina en plasma se baja a lo largo de la fase de luz y marcado aumento de la amplitud de pico en el medio de la fase oscura (Fig. 1A). La exposición de los animales a los dim LAN induce una supresión de 88% en la amplitud de melatonina nocturna sin afectar a su fase circadiana (Fig. 1A). Plasma TFA (Fig. 1B) y LA (Fig. 1C) ritmos en los controles de LD, que dependen de la actividad de alimentación nocturna impulsado por SCN circadiano, se conservaron en ratas expuestas-LAN que indican que la interrupción circadiano se limitaba a la supresión de la melatonina nocturna señal. de control circadiano de los niveles tanto de glucosa en sangre y de insulina independientes de los efectos de la ingesta de alimentos se ha reportado en ratas [29]. los niveles de glucosa en plasma aumentaron después de las luces a su pico en la mitad de la fase de luz seguido de un descenso hasta luces apagadas (Fig. 1D). Siguiendo luces apagadas, las concentraciones de glucosa aumentaron inicialmente y luego disminuyó hasta un nadir en la fase semi-oscuros seguido de un segundo aumento durante el final del período de oscuridad. Las concentraciones de lactato en plasma en los animales mantenidos en 12:12 fueron en general bajas a lo largo de la fase de luz seguido de un aumento durante el período oscuro hasta alcanzar un máximo de dos horas antes de luces encendidas (Fig. 1E). En condiciones de poca luz LAN, las ratas se convirtieron en hiperglucémicos con niveles de glucosa en la sangre restante arrítmicos marcadamente elevada en el 50% por encima de los niveles de control (Fig. 1D) mientras que los niveles de lactato en sangre arrítmicos se mantuvieron consistentemente más bajos que los controles a lo largo del periodo de 24 horas (Fig. 1E). Los niveles circulantes de insulina mostraron una oscilación diaria bajo LD 12:12 (Fig. 1F) que, en general refleja el patrón de IGF-1 circulante concentraciones se informó anteriormente [28]. LAN-expuestos ratas se hicieron notablemente hiperinsulinemia con los niveles de insulina de retención de un patrón oscilatorio similar a la observada en los controles LD 12:12 (Fig 1F.); circulantes de IGF-1 en los niveles eran también circadiano-interrumpidos y elevados en condiciones LAN [28].
(A-F) Los niveles plasmáticos de melatonina (A), los ácidos grasos trans (B), LA (C), glucosa ( D), lactato (e) e insulina (F) se midieron en ratas huésped femenino desnudos portadores de aislado de tejido-SR- MCF-7 xenoinjertos de cáncer de mama humanos en virtud de LD, 12:12 (sólidos círculos negros) o LD, 12:12 + LAN (0,2 lux) (círculos rojos sólidos). muestras de sangre arterial se obtuvieron mediante punción cardíaca a los seis puntos de tiempo circadiano diferentes durante un único período de 24 horas. El mismo patrón único de 24 horas para cada analito en plasma se visualiza dos veces para ilustrar la continuidad del ritmo. Zeitgeber tiempo (ZT) representa horas después de luces en Zt0 (o 0600 horas); las luces apagadas a ZT12 (1800 horas). Las barras negras en la parte inferior de las cifras indican la fase oscura y barras rojas indican LAN. círculos negros o rojos sólidos son la media ± SD; n = 6 en cada punto de tiempo. patrones rítmicos significativos bajo LD, 12:12 condiciones en A - F, p & lt; 0,001; significativo, pero interrumpido patrones rítmicos bajo condiciones dim LAN A - C y F solamente, p & lt; 0,001 (ANOVA de una vía). * P & lt; 0,01; ** P & lt;. 0,05 vs LAN LD, 12:12 (
t de Student
) guía empresas
regulación circadiana y la alteración de la glucosa y el metabolismo tumoral ácido linoleico
Estamos próximos a prueba si el tumor xenoinjertos mismos exhiben ritmos circadianos en los niveles de cAMP tumorales, la captación de lA, la formación de 13 HODE y el efecto Warburg que podría ser interrumpido por la supresión de melatonina inducida por LAN. En el presente estudio, el efecto Warburg se identifica como la captación tumoral de la glucosa en sangre arterial, junto con la liberación de lactato en la sangre venosa del tumor [1] - [4]. En virtud de LD, 12:12 condiciones, los niveles de cAMP tumoral (Fig. 2A), la captación de TFA (Fig. 2B), LA (Fig. 2C) la captación y formación de 13-HODE (Fig. 2D), el aumento de la luz durante la fase de alcanzar un máximo de dos horas antes de luces seguido por una disminución durante la fase de oscuridad para llegar a un nadir dos horas antes de luces. glucosa tumor absorción (Fig. 2E) y la producción de lactato (Fig. 2F) siguieron un patrón rítmico similar diario aumentando durante la fase de luz hasta alcanzar un máximo de dos horas antes de luces. Durante el período de oscuridad que había una disminución progresiva de estos parámetros con la captación de glucosa alcanzando su punto más bajo al final de la fase oscura y la disminución de la producción de lactato a un comedero en el período de mediados de los oscuros seguido por un aumento hasta dos horas antes luces apagadas. En condiciones de LAN, sin embargo, no sólo eran estos ritmos completamente ausente, pero los niveles de cada uno de estos parámetros se mantuvo elevado significativamente durante el período de 24 horas.
(A-H) Tumor niveles de cAMP (A) , la absorción de TFA (B), la captación de LA (C), la formación de 13-HODE (D), la captación de glucosa (e), la formación de lactato (F), [
3H] timidina en el ADN (G), y el ADN contenido se midieron bajo LD, 12:12 o LD, 12:12 + LAN; véase la leyenda de la Figura 1 para más condiciones experimentales. (I) El crecimiento del tumor en ambos grupos se midió durante el curso del experimento. círculos negros o rojos sólidos son la media ± SD estimado el peso del tumor; n = 6 para el peso estimado del tumor. El análisis reveló cosinor patrones rítmicos robustos y altamente significativos bajo LD 12:12, en condiciones analitos tumorales; no se detectaron patrones rítmicos diarias significativas en LAN dim (véase el resumen Tabla 3). * P & lt; 0,01; ** P & lt; 0,05 vs LEN LD, 12:12 (
t de Student
). curvas de crecimiento tumoral en I, p & lt;. 0.01 pendiente de crecimiento del tumor en el grupo LAN vs LD, 12:12 grupo (regresión lineal)
regulación circadiana y la interrupción de la expresión tumoral de señalización y factores de transcripción
también se consideró si AKT, c-myc y /o HIF-1α, reguladores de la transcripción clave del efecto Warburg, muestran ritmicidad circadiana que está interrumpido por LAN tenue. Como una señal de estimulación fundamental para la supervivencia de las células tumorales /proliferación, y la glucosa y el metabolismo de LA, la activación de AKT [por ejemplo, la fosforilación en la serina 473 (S473)] fue mayor durante la fase de luz y disminuyó a partir de entonces a su punto más bajo durante la fase semi-oscuros. los niveles de expresión de HIF-1α fueron bajas durante la fase de luz seguido de un aumento hasta el pico de expresión durante la fase oscura (figura 3 E & amp;. F). Sin embargo, bajo la exposición LAN tenue, la expresión rítmica de ambos fosfo-AKT (pAKT
S473) y HIF-1α fue interrumpido por completo (Figura 3 A & amp;. B y E & amp; F). Tumoral c-myc expresión fue elevado en gran medida durante toda la fase de luz seguido por una marcada disminución de su punto más bajo durante la segunda mitad de la fase de oscuridad (Figura 3 C & amp;. D). En respuesta a la supresión de la melatonina inducida por LAN, sin embargo, una expresión rítmica significativa, pero menos robusto de c-MYC persistió durante el periodo de 24 horas (figuras 3 C E & amp;. F).
(A-F ) Tumor niveles de fosfo-AKT
Ser473 (A & amp; B), cMyc (C & amp; D), y HIF-1α (e & amp; M) se midieron bajo LD, 12:12 o LD, 12:12 + LAN; véase la leyenda de la Figura 1 para más condiciones experimentales. círculos negros o rojos sólidos representan la media ± SD de expresión relativa (derivado de la cuantificación densitométrica de las inmunotransferencias) de cualquiera de pAKT
Ser473, c-myc y HIF-1α en cada punto de tiempo circadiano; n = 3 muestras de tumores representativos en cada punto de tiempo. expresión relativa de pAKT
Ser473 representa la relación de pAKT
proteína de Ser473 total (t) de proteína AKT; expresión relativa de c-MYC y HIF-1α representa la relación de estas proteínas a la tubulina y GAPDH, respectivamente. El análisis reveló cosinor patrones rítmicos robustos y altamente significativos bajo LD 12:12, en condiciones analitos tumorales; a excepción de c-myc, no se detectaron patrones rítmicos diarias significativas en LAN dim (véase el resumen Tabla 4). Las comparaciones estadísticas fueron incapaces de hacerse entre los puntos de tiempo correspondientes entre la DL, 12:12 y grupos de LAN desde inmunotransferencias se realizaron para los dos grupos en carreras por separado. Sólo un único ciclo de 24 horas de inmunotransferencias se ejecuta y se muestra, mientras que la representación densitométrico de esos mismos inmunotransferencias se visualiza dos veces para ilustrar la continuidad del ritmo como se indica en la leyenda de la figura. 1.
regulación circadiana y la interrupción de la actividad proliferativa del tumor
A la luz de todo lo anterior, que postula la ocurrencia de cambios circadianos en la actividad proliferativa del tumor y el contenido de ADN correspondiente. Se encontró que el tumor [
3H] timidina incorporación en el ADN (Fig. 2G), así como el contenido de ADN (Fig. 2H) aumentó durante la fase de luz poco después de luces encendidas hasta alcanzar un máximo de dos horas antes de la luces apagadas. Durante la fase de oscuridad, sin embargo, tanto [
3H] timidina contenido de DNA y disminuyó a un nadir dos horas antes de luces encendidas (figuras 2 G & amp;. H). Las oscilaciones circadianas en [
3H] timidina y contenido de ADN sugieren que el número de células tumorales se incrementó durante la fase de luz debido al aumento de la actividad proliferativa mientras que en el número de células en fase oscura disminuyó lo que sugiere que la pérdida de células apoptóticas se estaba produciendo en paralelo con la disminución de células proliferación. Nuestros resultados son consistentes con estudios anteriores en el cáncer de mama de ratón trasplantables que muestran que los tamaños de tumor macroscópico y tasas de crecimiento en realidad fluctúan de manera circadiano lo largo de cada día del período de crecimiento tumoral neto [30]. En respuesta a la LAN, la oscilación diaria en el contenido de ADN y la actividad proliferativa fue anulado ya que estos parámetros se mantuvieron persistentemente elevados durante todo el periodo de 24 horas (Figura 2 G & amp;. H). En condiciones circadianos regulados, el crecimiento del tumor aumentó de forma constante durante un período de dos semanas mientras que en condiciones circadiano alterado la tasa de crecimiento se incrementó en dos veces en los controles (Fig. 2I).
regulación de la melatonina Potencial