Extracto
Los cambios en la expresión de los genes miARN son una característica común en el cáncer de colon. Estos cambios se producen en la transición de normal a adenoma y de adenoma a carcinoma, sin embargo, no han sido bien definido. Además, tampoco se han evaluado adecuadamente los cambios miARN entre los subgrupos de tumores de cáncer de colon. En este estudio, hemos examinado la expresión global de genes miARN en 315 muestras que incluyeron 52 mucosa normal del colon, 41 adenomas tubulovellosos 158 adenocarcinomas con dominio del desajuste de reparación del ADN (GMANS) seleccionada para el escenario y la edad de inicio, y 64 adenocarcinomas con desajuste de reparación del ADN defectuoso (dMMR) seleccionado por esporádica (n = 53) y heredó el cáncer de colon (n = 11). tumores esporádicos dMMR todos tenían
MLH1
inactivación debido a la hipermetilación del promotor. PCA sin supervisión y análisis de conglomerados demostraron que el tejido normal del colon, adenomas, carcinomas y carcinomas GMANS dMMR estaban claramente discernible. La mayoría de los miRNAs que son expresados diferencialmente entre normal y pólipos también se expresaron diferencialmente con una magnitud similar en la comparación de lo normal tanto a la GMANS y grupos tumorales dMMR, lo que sugiere una progresión paso a paso para la transformación de colon normal a carcinoma. Entre los miRNAs que demuestran el mayor plegar hacia arriba o hacia abajo-regulados cambios (≥4), cuatro novela (miR-31, miR-1, miR-9 y miR-99a) y dos informes anteriores (miR-137 y miR-135b miRNAs) se identificaron en la comparación normal /adenoma. Todos menos uno de ellos (miR-99a) demostraron diferencias de expresión similares en las dos comparaciones normales /carcinoma, lo que sugiere que estos cambios de tumores tempranos son importantes tanto en el pMMR- y cánceres derivados de dMMR. La comparación entre los tumores y GMANS dMMR identificó cuatro miRNAs (miR-31, miR-552, miR-592 y miR-224) con la expresión diferencias estadísticamente significativas (cambiar ≥2 veces) guía
Visto:. Oberg AL , francés AJ, Sarver aL, Subramanian S, Morlán BW, Riska SM, et al. (2011) La expresión de los genes miARN en pólipos en el colon proporciona evidencia de un modelo Multigolpe de cáncer de colon. PLoS ONE 6 (6): e20465. doi: 10.1371 /journal.pone.0020465
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 4, 2011; Aceptado: April 26, 2011; Publicado: 9 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Oberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Asociación de Minnesota de Biotecnología y Genómica médica [Medical Foundation 2006-100412]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon (CC) es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 148.000 nuevos casos reportados en los Estados Unidos en 2009 [1]. La progresión a CC se considera un proceso paso a paso con la acumulación de diferentes alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a una transformación de una célula normal a un tumor premaligno y finalmente a un tumor maligno y potencialmente metastásico (normal a adenoma a carcinoma secuencia). Los datos actuales demuestran claramente la presencia de heterogeneidad en esta secuencia de eventos. Estos incluyen: (i) el desarrollo de diferentes tipos de lesiones precancerosas tales como adenoma velloso, adenoma tubular, adenoma túbulo, y pólipo dentada con supuestas diferencias en los defectos moleculares; (Ii) la transición a cáncer invasivo que demuestra muy diferentes alteraciones moleculares (por ejemplo, los tumores con y sin desajuste de reparación del ADN defectuoso); y finalmente, (iii) el desarrollo de esporádica frente a diversas formas de CC hereditaria. Los factores subyacentes responsables de esta heterogeneidad, sin embargo, aún no se conocen.
Una de las distinciones más claras demostrado hasta ahora para CC esporádica se basa en la presencia o ausencia de reparación de genes de ADN funcional (MMR) [2] , [3], [4]. Los tumores con defectos MMR (dMMR) se han identificado en ~ 20% de CC esporádica y se caracterizan por la presencia de un fenotipo tumor particular, denominada inestabilidad de microsatélites (MSI). En CC esporádica, se han descrito tres fenotipos MSI distintas: MSS, MSI-L y MSI-H [5]. El fenotipo de MSI-H se asocia con las características clínico patológicas [2], [3], [4], incluyendo un resultado más favorable [6]. Entre CC esporádica, la mayoría de los casos de MSI-H resultados de la inactivación de
MLH1
debido a la hipermetilación del promotor (~ 95%) [2], [3], [4]. El ~ 80% restante de CC con MMR competentes (GMANS), por el contrario, sigue una inestabilidad cromosómica (CIN) y la vía y se asocian con una alta frecuencia de aneuploidía y alélica desequilibrio [7].
Aunque la mayoría de CC parece ser esporádico con una edad media al diagnóstico a mediados de los 60 s, aproximadamente el 15-20% de los casos surgen dentro de los agregados familiares, con condiciones genéticas conocidas que representan solamente una pequeña fracción de ellos. Mientras CC hereditaria ha sido reconocida durante algún tiempo, la identidad de los genes que participan en el proceso de la enfermedad sólo recientemente se ha identificado para muchas de las enfermedades hereditarias. La forma hereditaria más frecuente de CC es hereditario no asociado a poliposis cáncer de colon sin poliposis (HNPCC), que representan el ~2-3% de todos los casos [8].
En el HNPCC, las mutaciones germinales en los genes MMR ADN son también responsables de esta condición, con
MLH1
y
MSH2
representó la mayoría de los casos (~ 40% cada uno) y
MSH6
y
PMS2 Accounting para un porcentaje más pequeño, ~ 10% y 5%, respectivamente [2], [8]. Los tumores de estos pacientes también se caracterizan por la presencia de MSI-H y por la pérdida de la expresión de proteínas MMR para el gen afectado. Por lo tanto, la etiología molecular de los tumores que implican dMMR es muy heterogéneo, que implica varios genes diferentes y numerosos mecanismos de inactivación de genes, incluyendo epigenéticos, somáticas y de línea germinal alteraciones.
Parece que hay al menos dos vías importantes que conducen a esporádica y CC hereditaria. La primera vía, con la participación dMMR, se cree que se origina en un precursor dentada (adenoma serrado de sésil) y es responsable de todos los esporádicos MSI-H CC (aunque no todos los cánceres que surgen a través de la vía serrada son MSI-H). HNPCC también da lugar a MSI-H CC. La segunda vía se cree que deriva del túbulo /adenomas vellosos y conduce a CC o CC esporádicos relacionados con el FAP se caracteriza por tumores CIN y GMANS. Nuestra comprensión de estas vías a nivel molecular y su implicación en la transición de normal a pólipo a carcinoma, a pesar de la mejora, sigue siendo incompleta.
enfoques (perfiles de expresión de todo el genoma, análisis de SNP en todo el genoma, aCGH, la secuenciación de próxima generación) continúan refinando nuestra comprensión del proceso de la tumorigénesis. El descubrimiento de una clase creciente de pequeños ARN no codificantes, incluyendo miRNAs, ha revelado un nivel aún mayor de la complejidad de la biología del cáncer [9], [10], [11]. microRNAs (miRNAs) son 18-24 nt pequeñas moléculas de ARN no codificantes que predominantemente inhiben la expresión génica a nivel post-transcripcional [9]. Como miRNAs regulan la expresión de un gran número de genes que codifican proteínas, una amplia gama de procesos biológicos se ven afectadas, tales como el metabolismo, la organogénesis, desarrollo, y la determinación del destino de la célula, incluyendo la muerte [10]. La expresión alterada de miRNAs también se ha asociado con una variedad de enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [11]. Aunque un número creciente de estudios han abordado la expresión de los genes miARN en CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], pocos tienen ha publicado en lesiones premalignas en el colon [21], [22], [23], [24], [25]. En particular, el papel de los miRNAs en la transición entre el colon normal y pólipos y entre pólipos y cáncer no se entiende.
En este estudio, (735 miARN objetivos) miARN expresión global se evaluó en 315 muestras (52 normales mucosa del colon y tumores de colon 263) utilizando la plataforma BeadArray ™ (Illumina, Inc.) [26]. Las muestras seleccionadas para el análisis fueron clasificados por una serie de criterios clínicos y moleculares para explorar la heterogeneidad del tumor en más detalle, para descubrir miRNAs biológicamente relevantes y para hacer frente a los cambios de transición de normal a adenoma y adenoma a carcinoma. Los tipos de tumores incluyen los adenomas tubulovellosos adenocarcinomas con dMMR seleccionados para ambos casos esporádicos y hereditarios, y adenocarcinomas con GMANS seleccionados para la etapa (A, B, C, y D) y la edad de inicio (Antiguo- frente a la enfermedad de aparición temprana).
Métodos
Ética Declaración
la Junta de Revisión Institucional de la Clínica Mayo revisado y aprobado para los estudios humanos el protocolo titulado "la identificación y validación de la firma Perfiles de miARN como biomarcadores de la progresión del cáncer de colon" del Dr. Stephen N. Thibodeau. El Comité observó que los estudios humanos aspectos implican el uso de las muestras recogidas en virtud de los protocolos aprobados por el IRB. El Comité determinó que el proceso de consentimiento permite el uso futuro de las muestras como se ejemplifica en el protocolo actual. La mayoría de los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Para aquellos que no lo hicieron, fueron anónimos muestras.
Selección de la muestra
Las muestras de pacientes con CC o pólipos fueron seleccionados a partir de dos registros de tumores separados. La primera colección de muestras se obtuvo de todos los pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica de CC durante un período de tres años comprendido entre 1995 1998 (no seleccionado). La segunda colección, iniciada en 2000, es una colección permanente de muestras biológicas de pacientes de la Clínica Mayo de Rochester con neoplasia colorrectal. Para el registro más tarde, no hay criterios de preselección han sido utilizados por el registro, excepto que sólo los pólipos con un diámetro de ≥ 7 mm se recogen para su uso futuro.
Todas las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido a el momento de la recolección y después se almacena a -80 ° C para su uso posterior. áreas normales del epitelio del colon se obtuvieron de ya sea el margen de la resección o adyacente al tumor. Todas menos una de las muestras de tejidos normales utilizados para este estudio fueron comparados con los tumores. Se excluyeron los cánceres rectales. Se evaluaron los pólipos para el tipo histológico, con adenomas única túbulo-seleccionados para el estudio. estadificación tumoral patológico se clasifica de acuerdo con criterios de Dukes [27]. revisiones de las historias de los pacientes se realizaron para obtener las características clínicas del tumor, incluyendo el sitio del tumor, el estadio y la edad al momento del diagnóstico.
Tratamiento de Tumores y extracción de RNA
hematoxilina El tejido congelado se redujeron en un criostato para generar y eosina (H & amp; e) manchadas diapositivas. Para los pólipos, áreas con al menos el 50% eran adenoma-macro diseccionado. Para los cánceres, las áreas que contienen al menos 70% de células neoplásicas o mayores fueron disecados-macro. Tissue tamaños equivalente a 7 mm
2 y 10-micras de espesor se cortaron y se colocaron en un vial que contiene 400 l de tampón RLT (QIAGEN, Chatsworth, CA), incluyendo 4 l de β-mercaptoetanol. El vial se almacenó a -80 ° C hasta su utilización para la extracción de ARN usando TRIzol® LSTrizol © (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
ADN MMR Status
la mayoría de los tumores con desajuste de reparación de ADN defectuosa seleccionados para este estudio fueron los mismos que los ya se ha informado sobre y han sido ampliamente caracterizado [28]. Tumor MSI se evaluó mediante la comparación de tumor emparejados y el ADN mucosa normal aislado (kit de extracción de ADN Qiagen) a partir de material fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) con el uso de 3-18 marcadores de microsatélites, tal como se describe anteriormente [28]. Los tumores fueron clasificados como MSI-H en caso de ≥30% de los marcadores demostró la inestabilidad, MSI-L si. & Lt; 30% demostró la inestabilidad, y el SMS si ninguno de los marcadores demostró la inestabilidad
inmunohistoquímica (IHC) para el análisis de proteínas la expresión se realizó en muestras de FFPE de MLH1 y MSH2 (todos los casos) y MSH6 y PMS2 (subconjunto), como se describe anteriormente [29]. ADN dMMR se definió por la presencia de MSI (MSI-H) y /o la ausencia de expresión de la proteína para MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2. ADN GMANS se define por la ausencia de altos niveles de inestabilidad de microsatélites (MSS /MSI-L) y por la presencia de expresión de la proteína normal para MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2.
tumores con dMMR que muestra una ausencia de MLH1 se ensayaron adicionalmente para determinar la causa de la inactivación de genes, es decir, epigenética (esporádica) frente a la línea germinal (heredados). Cualquiera de un ensayo basado en PCR específica de metilación o una enzima HpaII digerir ensayo basado se utilizó para la prueba de la hipermetilación del promotor [30]. Además, también se realizó un ensayo basado en PCR para alteraciones dentro de la mutación V600E en BRAF. MLH1 casos demostrando
MLH1
hipermetilación del promotor se clasificaron como esporádica (dMMR1). MLH1 casos con BRAF de tipo salvaje y sin
MLH1
hipermetilación del promotor se clasificaron como de la línea germinal (dMMR2). Los casos que involucran MSH2, MSH6 o PMS2 (por la pérdida de la expresión de proteínas por IHC o por medio de pruebas de la línea germinal) también se clasificaron como de la línea germinal (dMMR2).
miARN perfiles
Global miARN (735 miARN objetivos) expresión se evaluó usando la plataforma BeadArray ™ (Illumina, Inc.) esencialmente como se describe por Sarver et al. [dieciséis]. Para cada muestra analizada, 200 ng de ARN total se utilizó para el análisis.
Análisis estadístico
Diseño del estudio.
esquemas de aleatorización se crearon por separado para determinar el orden de los tejidos cryosectioning, extracción de RNA y la asignación de muestras a la matriz de placas (SAM) de 96 pocillos Sentrix de matriz para asegurar que los grupos de la muestra de las características demográficas de interés y estaban bien equilibradas durante varios efectos experimentales potenciales.
las evaluaciones de calidad.
Un total de 336 muestras de tejido (281 tumores y 55 muestras de tejido normal) de 282 sujetos fueron evaluados inicialmente con la plataforma Illumina. Para 54 de los pacientes, se obtuvieron tanto el tejido normal y tumoral del mismo individuo (tabla 1). Para fines de control de calidad, 8 muestras se ensayaron una vez adicional y 5 muestras se ensayaron tres veces adicionales (prueba de reproducibilidad), lo que resulta en un total de muestras de 23 replicados probados (total de prueba = 359). También se utilizaron veinticinco controles negativo y de corte adicionales para evaluar la calidad general.
Además de las evaluaciones de control de calidad de laboratorio, la calidad y el sesgo mundial se evaluaron a través de varias técnicas de trazado. Todos los análisis se realizaron en el registro
2 escala y los resultados se presentan en la escala de factor de cambio. diagramas de caja y bigotes se utilizaron para evaluar los cambios en la distribución media global miARN o concentración entre las muestras y SAM. menos por pares parcelas promedio (MVA) para dos muestras de frente, que se define como la diferencia per-sonda entre las dos muestras (eje vertical) frente a la media per-sonda (eje horizontal) para las dos muestras [31], se utilizaron para evaluar la concordancia entre repeticiones técnica. parcelas MVA residual para una determinada muestra, que se define como la diferencia entre ese espécimen y el promedio de todas las muestras (eje vertical) frente a la media de todas las muestras (eje horizontal) [32], se utilizaron para evaluar la existencia de y la forma funcional de , por ejemplo, los prejuicios (no) de linealidad como una función de la abundancia. Los gráficos de análisis de componentes principales (PCA) resultados se utilizaron para examinar (des) similitud de las muestras de especímenes de control negativo y la existencia de efectos SAM. Los diagramas de caja y gráficos de puntos se utilizaron para evaluar la naturaleza y la consistencia de los efectos por la sonda-SAM. Las tasas de detección fueron evaluados para cada muestra, con la detección de la sonda se define como los valores de p & lt;.
0,01
Sobre la base de estos los análisis de evaluación de calidad, con un total de 21 de las 359 muestras (incluyendo algunas repeticiones) fueron retirados de más estudiar. Doce fueron encontrados a ser más similares en la distribución de la expresión de las muestras de control negativo en base a diagramas de caja, las tasas de detección y parcelas PCA y un espécimen tenía un extremadamente alto, pero estrecho rango de expresión. Otros siete especímenes adicionales tenían obviamente diferentes efectos mínimos y máximos de las parcelas MVA residuales y agrupan más cerca de las muestras de control negativo en PCA. Una muestra adicional fue eliminado ya que era el único en su clase. Por lo tanto, hubo 338 muestras (318 única y 20 repeticiones) a partir de 268 sujetos restantes para su análisis.
preprocesamiento.
La distribución de la abundancia 735 miRNA y 20 sondas de control abarcó una amplia gama, con 40% -60% de las sondas de detectar en muestras que pasan evaluación de la calidad (utilizando un p-valor umbral 0.01 de detección). Además, no había
a priori
razón para esperar una distribución asimétrica de los cambios [16]. Por lo tanto, los 338 especímenes que pasan a la evaluación de calidad inicial se normalizaron entre sí mediante cuantil normalización [31]. Después de la normalización de las parcelas MVA residuales demostraron que el sesgo no lineal promedio se ha eliminado correctamente. Sin embargo, las parcelas de PCA resultados demostraron que un efecto se mantuvo SAM. estimaciones de contraste y gráficos de puntos revelaron que, si bien no había casi ningún efecto SAM para la mayoría de las sondas, un puñado mostró cambios hasta 2 veces entre las SAM que fueron consistentes entre todas las muestras de cada SAM y no fueron expulsados por los puntos de resultados aislados. Es decir, se observaron interacciones consistentes SAM-por-sonda. Por lo tanto, los residuos de los modelos lineales con SAM en el ajuste del modelo en una base por-sonda para cuantiles datos normalizados se utilizaron como los datos ajustados, SAM-normalizadas finales. Estos modelos lineales dieron resultados dentro de polvo decimal de los métodos empíricos de Bayes ya que el tamaño de la muestra es grande [33].
parcelas MVA residuales, diagramas de caja y gráficos de puntos por sonda mostraron ninguna tendencia en el tiempo para el servicio de una muestra como un control de corte con el tejido cortado siete veces durante los dos meses se requiere para procesar todas las muestras de tejido. parcelas MVA residuales y por pares mostraron buen acuerdo general entre repeticiones técnica colocados en diferentes SAM. El efecto más grande SAM observado fue de 2,33 veces (log diferencia
2 escala de 1.22), y sólo un puñado de sondas tenido efectos SAM de 2 veces. 91,5% (691/755) de las sondas tenían SAM estimaciones del efecto. & Lt; 1,2 veces
Por las tasas de detección con sonda junto con parcelas de per-sonda desviación estándar (SD) a través de todas las muestras normalizadas (n = 338 ) frente a la expresión media de todas las muestras normalizadas demostrado efectos suelo y techo claras en la distribución de la abundancia. Un umbral SD per-sonda de ≤0.4 en estas muestras en el registro
2 escala se utiliza para filtrar sondas "no informativos" de una manera agnóstica al grupo [34]. Esto dio lugar a 123 sondas con tasas de detección de 0%, 37 sondas saturadas, y 376 sondas mediados de abundancia con baja SD siendo filtrados, dejando a 199 sondas informativas con una SD & gt;. 0.4
Expresión diferencial
modelos de efectos mixtos lineales por sonda con declaraciones de contraste se utilizaron para evaluar la expresión diferencial utilizando los datos ajustados, SAM-normalizados por cuantiles. El sujeto fue incluido como un efecto aleatorio con el fin de explicar la correlación entre múltiples observaciones por sujeto (repeticiones técnica y la naturaleza emparejada de todo, pero una muestra normal). Un efecto SAM se incluyó en el modelo para tener en cuenta los grados de libertad se utilizan en la eliminación por sonda del efecto SAM. Las distribuciones de los valores de p y tasas de falso descubrimiento [35], [36] (calculados en base a los resultados del modelo para todas las sondas 735 miARN) se utilizaron para dar un sentido general de si existen verdaderas diferencias. importancia real se evaluó mediante la Bonferroni más conservador corregido los valores de p basado en 0,05 /735 = 6,8 × 10
-5 para cada comparación, junto con los puntos de corte factor de cambio para incorporar importancia biológica. Se compararon los seis grandes grupos: normales, pólipo, pMMR1 (aparición de edad), pMMR2 (inicio juvenil), dMMR1 (esporádica) y dMMR2 (línea germinal). comparaciones adicionales incluyen pMMR1 Etapas B, C y D (etapa A con n = 3 ha quedado fuera de esta comparación debido al tamaño pequeño de la muestra), así como los grupos pMMR1 del SMS y MSI-L.
Ajuste variables se incluyeron en su caso para evitar una posible confusión con la histología. El estadio tumoral se incluyó como una covariable en los modelos de evaluación de las diferencias entre los tipos de tumores para ajustar posibles desequilibrios de gravedad de la enfermedad debido a la etapa. Ubicación en el colon no se incluyó como covariable en los modelos que comparan tumores GMANS y dMMR ya que esto se considera parte de la biología de los tumores. No hay covariables se incluyeron en los modelos que comparan los grupos de pólipos o normales con otros grupos, ya que ni el escenario ni ubicación en el colon son relevantes para estos grupos.
Visualización de Datos.
Visualización de la presencia de efectos globales se logró a través de la agrupación sin supervisión y PCA utilizando muestras de tejidos únicos sólo 318 (de 338 muestras); los técnicos repeticiones fueron excluidos de estos análisis. Para muestras con múltiples repeticiones técnica, la muestra de réplicas etiquetados "1" fue elegido. Se realizaron análisis de PCA en per-sonda significa centrado y datos a escala SD-utilizando Partek [37] y la función R prcomp [38]. Los análisis de agrupamiento no supervisado se realizaron en los datos centrado en la mediana por-sonda en Partek usando matriz de disimilitud de Pearson para el cálculo de distancias entre muestras individuales y el método de vinculación promedio para el cálculo de las distancias entre los dos grupos. Puntos o etiquetas de los especímenes eran de color en las parcelas de la información conocida agrupación clínica.
Resultados
Características de la muestra
Después de la evaluación de la calidad extensa de los resultados de perfiles de miARN (ver Métodos), 338 muestras de tejido de 268 pacientes se utilizaron para el análisis adicional. muestras de tejidos normales y tumorales (sin incluir ninguna de las repeticiones técnica) incluyen 52 mucosa normal del colon, 41 adenomas tubulovellosos 158 adenocarcinomas con GMANS seleccionados para la etapa (3 Etapa A, 72 Etapa B, 43 Etapa C y 30 Etapa D) y la edad de inicio (148≥50 años frente a 10 & lt; 50 años), y 64 adenocarcinomas con dMMR seleccionados por tanto esporádica (53 dMMR1) y heredan CC (11 dMMR2) como se indica en la Tabla 1.
Todos los casos con esporádicos dMMR (dMMR1) tenía
MLH1
inactivación debido a la hipermetilación del promotor. El grupo dMMR heredada (dMMR2) se compone de los casos que tienen: (i) una conocida mutación germinal en cualquiera de
MLH1 gratis (n = 1) o
MSH2 gratis (n = 3); o (ii) la pérdida de expresión de la proteína para MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) o PMS2 (n = 2) por IHC y presume que tienen una mutación de línea germinal en estos genes. Varios casos con dMMR no se clasificaron fácilmente (dMMR3) y debido a la cantidad pequeña, éstas se eliminaron de posterior análisis. De los 268 sujetos, 119 eran mujeres y 149 eran hombres.
Global miARN expresión las diferencias entre el colon normal, adenoma y carcinoma
PCA y análisis de agrupamiento jerárquico, tanto sin supervisión, se utilizan para visualizar miARN los patrones de expresión presentes a nivel mundial en nuestro conjunto de datos de expresión. En general, hubo una clara separación entre los grupos compuestos por, adenoma, pMMR1 y dMMR1 tejidos normales derivados cuando se examina por tanto sin supervisión PCA (Figura 1A) y la agrupación jerárquica (Figura 1B) utilizando el conjunto de 199 sondas "informativo" obtenidos como se describe en métodos. De interés, sin embargo, la agrupación jerárquica también sugiere la presencia de dos subpoblaciones para el grupo dMMR1 de tumores, que parece ser impulsado por un grupo de miRNAs (la mayoría del cromosoma 14) que muestra una baja expresión en un grupo y alta expresión en la otra (indicada por la flecha en la Figura 1B).
(a) Parcelas de componentes principales de PCA análisis. eje horizontal corresponde al componente principal 1 (PC1), eje vertical corresponde a la PC2, eje de profundidad corresponde a la PC3. El porcentaje de variación explicada por un PC particular se indica en la etiqueta del eje. Los puntos son coloreadas por el estado del grupo con el azul que representa el epitelio normal pólipo que representa púrpura, verde pMMR1 que representa, y el rojo que representa dMMR1. Se proporcionan dos orientaciones diferentes. (B) Agrupación jerárquica sin supervisión de los perfiles de miARN utilizando el conjunto de 199 sondas "informativo" obtenidos como se describe en Métodos. Las muestras se indican en el eje horizontal e incluyen el colon normal, adenomas, carcinomas pMMR1 y carcinomas dMMR1 con la pertenencia al grupo indicado por la barra de colores entre el dendograma y el mapa de calor. miRNAs se indican con el eje vertical. La barra de color abajo indica el nivel de expresión.
Los patrones de expresión de los genes miARN globales A continuación, se examinaron visualmente en varios subgrupos de tumores pre-definidos para determinar si pueden ser distinguidos. Las parcelas de PCA para estos análisis se muestran en la Figura 2 (datos no presentados para los análisis de agrupamiento jerárquico). Dentro del grupo de los tumores pMMR1, no hubo diferencias discernibles aparentes basados en el escenario, ya sea a través de las tres etapas o entre cualesquiera dos etapas (Etapa A no incluye debido a números pequeños), o por razones de género. Además, no hay separación de los grupos era visible entre los tumores con una mayor edad de inicio (≥50 y /o, pMMR1) y los que tienen una edad más temprana de inicio (& lt; 50 y /o, pMMR2). Un análisis de los tumores en cada uno de los dos subtipos dMMR, dMMR1 (somática) versus dMMR2 (línea germinal), también mostró diferencias discernibles.
eje horizontal corresponde al componente principal 1 (PC1), eje vertical corresponde a PC2 y eje de profundidad corresponde a PC3. Los puntos son coloreadas por el estado del grupo. El porcentaje de variación explicada por un PC particular se indica en la etiqueta del eje. (A) pMMR1 evaluado por el estadio de Dukes; (B) Evaluación de la edad de inicio (pMMR1 - viejo y pMMR2 - joven). (C) Evaluación de 2 agrupaciones de casos dMMR (dMMR1 - epigenética silenciada MLH1 y dMMR2 - línea germinal); (D) los grupos pMMR1 MSI-L y MSS tumores. Los colores para cada uno de los grupos que se comparan se muestran en el cuadro de la leyenda superior derecha.
Debido a que los tumores a menudo se clasifican por su estado de MSI (SMS, MSI-L y MSI-H), estos tres grupos también se estudiaron las diferencias de expresión juntos, entonces sistemáticamente en pares. Como era de esperar, el grupo MSI-H (definida como dMMR) agrupado por separado de ambos grupos SMS MSI-L y (tanto define como GMANS). Sin embargo, el grupo del SMS MSI-L y mostraron que no había diferencia (Figura 2).
Expresión diferencial entre el colon normal, adenoma y carcinoma
Hemos llevado a cabo comparaciones estadísticas basadas en grupos en un probe- por sonda base usando modelos lineales para varios análisis predefinidas en un esfuerzo por identificar estadísticamente significativas miRNAs expresados diferencialmente. En general, muy se observaron diferencias significativas entre varios de los grupos de miRNAs específicos utilizando un Bonferroni corregido p-valor umbral para la significación (6.8 × 10
-5). La Tabla 2 proporciona un recuento de los miRNAs que demuestran expresión significativa pliegue cambios en diferentes puntos de corte (≥ 2,0 y ≥4.0). La Tabla 3 muestra los nueve estadísticamente significativas miRNAs expresados diferencialmente con mayor factor de cambio (cambio de ≥4), mientras que la Figura S1 muestra los gráficos de puntos para cada uno de estos entre los diferentes subgrupos de tejido.
el cambio en el nivel de expresión que se produce en la normal a adenoma a carcinoma secuencia para cada uno de los nueve miRNAs se puede ver claramente en la Figura S1. Cinco de los nueve muestran cambios consistentes en todos los grupos en comparación a la normalidad, con miR-135b y MIR-31 hasta reguladas y miR-1, miR-137 y miR-9 el regulado en todas las muestras. HS_29 está regulado en todos los carcinomas, pero no en los pólipos, miR-552 y miR592 están regulados en los pólipos y tumores GMANS pero no los tumores dMMR, y, por último, miR99a es el regulado en los pólipos con niveles intermedios tanto en el grupo de tumores GMANS y dMMR.
Usando el umbral de Bonferroni P-valor, junto con un factor de cambio en el nivel de expresión de ≥2, un total de 54 miRNAs fueron identificados entre las diversas comparaciones (Tabla 2, Tabla S1). Treinta y un miARN fueron expresados diferencialmente entre el tejido normal del colon y adenomas. Una comparación de tejido de colon normal a los dos grupos de carcinoma principales (pMMR1 y dMMR1) identificó 31 y 28 miRNAs significativas, respectivamente, la utilización de estos criterios. Por último, se identificaron 6 y 11 miRNAs significativas cuando adenomas se compararon con los dos grupos de carcinoma. El mapa de calor, que se muestra en la Figura 3, ilustra las diferencias de expresión relativos de estos miRNAs entre los grupos en estudio.
Las muestras se indican en el eje horizontal e incluyen colon normal, adenomas, carcinomas GMANS (1 y 2 combinados ) y los carcinomas dMMR (1 y 2) combinado con la pertenencia al grupo indicado por la barra de colores entre el dendograma y el mapa de calor. miRNAs se indican con el eje vertical. La barra de color abajo indica el nivel de expresión.
De interés, la mayoría (23 de los 31) de miRNAs que son expresados diferencialmente entre normal y adenoma con los cambios veces de ≥2 también fueron expresadas diferencialmente en la comparación de lo normal tanto a los grupos de tejidos y GMANS dMMR, por ejemplo miR-135b y MIR-31 (Tabla S1). Además, los niveles y la dirección de los cambios relativos a la normalidad para la mayoría de ellos fueron consistentes entre adenoma y carcinoma. Además de las similitudes observadas para los grupos de adenoma y carcinoma, sin embargo, también se identificaron diferencias en la expresión. De los 43 miRNAs que son expresados diferencialmente de manera significativa con los cambios veces de ≥2 en los dos grupos de tumores, 20 no cumplían estos criterios en el grupo de pólipos (por ejemplo, el miR-375, miR-147, etc.), aunque varios otros miRNAs tenían niveles significativos, pero más pequeñas de expresión diferencia en el grupo de pólipos (por ejemplo, el miR-188-5p, miR-210) (Tabla S1). Cuando los grupos de tumores se compararon directamente al grupo pólipo, se identificaron 20 miRNAs; 9 hasta reguladas (por ejemplo, el miR-483-3p, miR34b) y 11 abajo reguladas (por ejemplo, el miR-552, miR-592).
A pesar de PCA y análisis de clusters es capaz de separar el pMMR1 y dMMR1 subgrupos (Figura 1), había sorprendentemente pocos miRNAs que son expresados diferencialmente significativa entre estos dos grupos (Tabla 2 y Tabla S1). Sólo cuatro miRNAs (miR-31, miR-224, miR-552, miR-592,) fueron encontrados en un cambio de 2 veces o más. Como se ha indicado para las comparaciones adenoma, la mayoría de miRNAs que son expresados diferencialmente entre el tejido de colon normal y el grupo pMMR1 con cambios veces ≥2 también son expresados diferencialmente en la comparación de tejido de colon normal a la grupo tejido dMMR1. Una vez más, los niveles y la dirección de esos cambios en relación a la normalidad para la mayoría de estos miRNAs fueron consistentes entre estas dos comparaciones (Tabla S1).
Una serie de comparaciones pre-planeado adicionales mostró diferencias mínimas entre subgrupos específicos.