Extracto
masivo aumento de la incidencia global del cáncer colorrectal requieren estrategias de tratamiento y prevención eficaces. Aquí, se presenta efectos inesperados de anticancerogenic hidroalcohólico
Iberis amara
extracto (IAE), que se conoce como un producto phytomedical ampliamente utilizado para el tratamiento de trastornos gastrointestinales. IAE inhibió significativamente la proliferación de células de carcinoma HT-29 y de colon T84 con una concentración inhibitoria (IC
50) de 6 y 9 g /ml, efectos inhibidores generados respectivamente, y aún más en PC 3 de la próstata y células de cáncer de mama MCF7 . La inhibición de la proliferación en células HT-29 se asoció con una detención del ciclo celular en fase G2 /M incluyendo la reducción de expresión de varias proteínas marcadoras de regulación. En particular, en células HT-29 IAE induce más apoptosis por la formación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS). De acuerdo con las predicciones derivadas de nuestro
in vitro
experimentos, bidaily sonda oral de 50 mg /kg de IAE más de 4 semanas resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral en un HT-29 modelo de xenoinjerto de tumor de ratón. Tomados en conjunto,
Iberis amara
extractos podrían llegar a ser alternativas útiles para la prevención y el tratamiento de la progresión del cáncer de colon
Visto:. Weidner C, M Rousseau, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel -Aziz H, et al. (2016)
Iberis amara
extracto induce la formación intracelular de especies reactivas del oxígeno e inhibe el cáncer de colon. PLoS ONE 11 (4): e0152398. doi: 10.1371 /journal.pone.0152398
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: Abril 23, 2015; Aceptado: 14 de marzo de 2016; Publicado: 6 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Weidner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio alemán de Educación e Investigación (BMBF, conceder a los números 0315082, 01EA1303). Autor HAA fue apoyada por Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH en forma de salario. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Heba Abdel-Aziz es empleado por Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, una empresa que vende productos phytomedical . Heba Abdel-Aziz y los demás autores han declarado ningún conflicto de intereses potencial. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo y la cuarta causa principal de cáncer muerte -related [1]. cuentas CRC de 1-2 millones de casos nuevos y más de 600.000 muertes por año [1]. La incidencia global de la CRC está aumentando de manera constante y parece estar asociado con un estilo de vida occidental [1].
terapia eficaz de CRC se ve obstaculizada por la disminución del cumplimiento de las recomendaciones para la detección, diagnóstico etapa tardía de nuevos casos de CCR, la terapia severa toxicidad, resistencia a los medicamentos, y la recaída del cáncer [2, 3]. Para superar estas limitaciones se necesitan nuevos enfoques para la prevención y el tratamiento del CCR efectiva, incluyendo la complementación de fuerte citotóxico o tratamientos de medicamentos, por ejemplo, el uso de alternativas seguras fitoterapéuticos [4].
En general, las mezclas de sustancias naturales tales como flavonoides, ácidos fenólicos, polifenoles y terpenoides pueden modular múltiples vías moleculares implicadas en el patobiología de enfermedades complejas. En particular, las mezclas de compuestos a base de vegetales en general provocan efectos secundarios tóxicos bajos [5]. Estudios recientes han demostrado que los extractos de hierbas suaves reducen el crecimiento de células de cáncer, mediante la inducción de apoptosis y la producción de efectos sinérgicos en la CRC. Por ejemplo, los extractos de té verde, las uvas, el jengibre, la cúrcuma, la soja y el ajo [4], la manzanilla [6] o Melissa officinalis [7, 8], se informó que ejercen efectos beneficiosos para la salud.
Iberis amara gratis (también llamado candytuft amargo) pertenece a la familia
Brassicaceae
, y es común en América central y el sur de Europa [9]. A continuación, se analizó un extracto hidroalcohólico bien validado y aprobado de
Iberis amara gratis (IAE), que se aplica de forma rutinaria para uso gastrointestinal.
IAE ejercida sorprendentemente fuerte actividad antiproliferativa y apoptosis, por ejemplo, en células de carcinoma de colon. Estos efectos antitumorales fueron causados por la formación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), mientras que temple de ROS por los antioxidantes protegidas las células cancerosas de la apoptosis. En particular, la aplicación del IAE en un modelo de xenoinjerto en ratones resultó en la inhibición eficaz de crecimiento del tumor
in vivo
, lo que prueba que el IAE se podría aplicar de forma beneficiosa para la prevención y el tratamiento complementario del cáncer de colon.
Materiales Métodos y
Materiales
productos químicos fueron adquiridos de las siguientes fuentes: estaurosporina (STN) e irinotecán (IRI) de LKT Laboratories (Biomol), oxaliplatino (OX) en Cayman Chemical (Biomol, Hamburgo , Alemania). Paclitaxel (PTX), 5-fluorouracilo (5-FU), la menadiona (MD), terc-butil hidroperóxido (TBHP), N-acetil cisteína (NAC), el glutatión (GSH), 3H-1, 2-ditiol-3- tiona (D3T), α-tocoferol (α-TOC) y ácido ascórbico (AA) se adquirieron de Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania). Hidroetanólico
Iberis amara
extraer (IAE) es un, hidroetanólico validado industrial extracto (31% v /v) proporcionado por Steigerwald Arzneimittelwerk (Darmstadt, Alemania). El extracto se produce de acuerdo con un procedimiento estandarizado. La calidad se controla por medio de la huella dactilar HPLC, y se determinó el contenido del extracto exactamente como se describe anteriormente en detalle [10].
Cultivo celular
HT-29 humana (ACC-299 , DSMZ, Braunschweig, Alemania) y células de cáncer colorrectal T84 (CCL-248, ATCC, LGC Promochem, Wesel, Alemania) se cultivaron en Modificado /mezcla Nutriente Medio Eagle de Dulbecco F-12 (DMEM /F-12,#11330-057 , Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemania) suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS, Biochrom, Berlín, Alemania) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Biochrom). Se establecieron células HT-29 desde el tumor primario de una mujer de raza caucásica de 44 años de edad con adenocarcinoma de colon; células T84 fueron aisladas de una metástasis pulmonar de un carcinoma de colon en un varón de 72 años de edad. las células PC-3 de cáncer de próstata (CRL-1435, ATCC) se cultivaron en RPMI 1640 (Biochrom) suplementado con 10% de FBS y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células de cáncer de mama MCF7 (HTB-22, ATCC) se cultivaron en DMEM GlutaMAX (Gibco, Life Technologies) suplementado con 10% FBS, 10 mg /insulina humana ml (Sigma Aldrich) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina . CCD 841 células de colon primarios CON (CRL-1790, ATCC) se cultivaron en DMEM glutamax (Life Technologies) que contiene 10% de SFB. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. Las células fueron tratadas usando hidroalcohólico IAE, se indica compuestos disueltos en DMSO, o correspondientes controles del vehículo.
Los tratamientos de células con el IAE eran especialmente optimizado en términos de tiempos de concentración y tratamiento, que variaba en función de la respuesta biológica y marcadores utilizado para la detección.
ensayo de proliferación
se determinó la proliferación de las células cancerosas usando el kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT NF (Life Technologies). Para este propósito, HT-29, T8, las células CoN CCD 841 normales células cancerosas MCF7 PC-3 y, y, se sembraron en negro placas de 384 pocillos (# 3712, Corning, Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) con una densidad de 750 células /pocillo (HT-29), a 900 células /pocillo (T84), 250 células /pocillo (PC-3), 900 células /pocillo (MCF7) y 900 células /pocillo CCD células del colon primaria 841 en contra, respectivamente, en un volumen final de 50 l /pocillo. Las células se trataron luego con series de concentraciones de los compuestos por adición de 10 l de una concentración madre de 6 veces. Después de 72 h (HT-29, PC-3) y 96 h (T84, MCF7, CCD 841 CoN) de tratamiento, respectivamente, se determinó el número relativo de células mediante la medición del contenido de ADN celular utilizando el tinte CyQUANT fluorescente de acuerdo con el fabricante de instrucciones. Para co-tratamiento con antioxidantes, el tiempo de tratamiento se redujo a 48 h. La intensidad de fluorescencia se midió utilizando el polarstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania) y se transforma en el número relativo de células. Para las series de concentración, los datos se ajustaron utilizando GraphPad Prism 5.0 de acuerdo con la ecuación: Y = Top + (de abajo hacia arriba) /(1 + 10 ^ ((lógica
50-X) * ladera)) con pendiente variable Hill. La eficiencia es el máximo observado inducción de muerte celular (100% -fondo) con relación a las células no tratadas (se establece en 0%).
Análisis del ciclo celular
La modulación del ciclo celular se determinó en el TC -29 Las células tratadas con 30 mg /ml IAE durante 24 h. Después de tripsinización células se fijaron en etanol al 70% y se incubaron en hielo durante 15 min. Las células se marcaron a continuación con yoduro de propidio (PI) /solución de tinción de RNasa (# 4087, Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) y se incubaron adicionalmente durante 15 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se congelaron a -20 ° C antes del análisis. Por último, las células se analizaron utilizando el flujo FACS Aria II citómetro (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). El análisis de datos se realizó mediante FlowJo 7,6 (Árbol de la estrella), y los estados del ciclo celular fueron asignados mediante el modelo de Dean-Jett-Fox implementado. Los histogramas se visualizaron por GraphPad Prism 5.0. Tenga en cuenta que en nuestras manos este análisis fue por desgracia ineficiente utilizando células T84 de colon derivada de alternativas debido a las dificultades para obtener un número significativo de células individuales. Este problema se incluso aumentó durante la fijación, lo que resulta en la acumulación de células T84 (por ejemplo dobletes), lo que hizo el análisis de datos de diferente del ciclo celular indica imposible en la práctica.
Immunoblotting
Las células fueron lisadas en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 10 mM, SDS al 1% con inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics) y los inhibidores de la fosfatasa (Sigma Aldrich), y se sonicaron (usando un dispositivo de Bandelin electrónica, Berlín, Alemania). Después de centrifugación a 10.000 g durante 10 min, los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Las muestras se desnaturalizaron y se separaron mediante el uso de NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris geles de proteínas (Life Technologies) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond ECL (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en polvo en 0,1% temperatura ambiente Triton X-100 /TBS (TBS-T, pH 7,6) por un 1 h y posteriormente se lavaron en TBS-T (0,1%). Los anticuerpos primarios contra la ciclina A2 (# 4656), ciclina D3 (# 2936), CDK 2 (# 2546), CDK 4 (# 2906), CDK 6 (# 3136), caspasa 3 (# 9665), se escindió de la caspasa 3 (# 9664), caspasa 9 (# 9502), se escindió de la caspasa 9 (# 9501), PARP (# 9542), escindido de PARP (# 5625), p18 (# 2596), p21 (# 2947, todos de Cell Signaling Technology), y GAPDH (# sc-48167, Santa Cruz) se diluyeron en TBS-T (0,1%) con leche en polvo y BSA, respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las membranas se agitaron a 4 ° C durante la noche, posteriormente se lavó con TBS-T (0,1%) y se incubaron con anti-IgG de conejo-HRP (# sc-2004), anti-IgG de ratón-HRP (# sc-2005) y anti- IgG de cabra-HRP (# sc-2020, todos de Santa Cruz), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas se detectaron utilizando la solución de Western ECL relámpago (Perkin Elmer, Rodgau, Alemania). Las membranas fueron despojados con Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) durante 7 minutos a temperatura ambiente. Los análisis densitométricos se realizaron utilizando el sistema de fusión de 4,2-SL Avance MP (Peqlab, Erlangen, Alemania).
caspasa activación
La activación de las caspasas 2, 3/7, 6, 8 y 9 se investigado utilizando los luminométricos caspasa-Glo ensayos (Promega, Mannheim, Alemania). En resumen, un día antes de las células de tratamiento HT-29 se sembraron en placas de 384 pocillos negros (# 3712, Corning) con una densidad de 2.000 células /pocillo en un volumen final de 20 l /pocillo. Las células fueron tratadas durante 24 h con 60 mg /ml IAE, estaurosporina 10 M o vehículo solamente. La luminiscencia se mide de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el polarstar Omega (BMG Labtech).
ADN ensayo de fragmentación de
BrdU marcado fragmentos de ADN en el citoplasma de las células HT-29 tratadas se cuantificaron utilizando el celular kit DNA La fragmentación ELISA (Roche Diagnostics). Brevemente, las células HT-29 se sembraron en placas de 96 pocillos (TPP) con una densidad de 13.000 células /pocillo en presencia de 10 mM 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) y se incubaron durante 2 días a 37 ° C. Se eliminó el sobrenadante y se trataron las células durante 6 h con IAE, STS o vehículo tal como se indica en la figura resultados correspondiente. Las fracciones citosólicas se recogieron y analizaron en un área media de 96 pocillos de microplacas clara de alta unión (# 3690, Corning). muestras libres de células se utilizaron como control de fondo para la resta, y los datos se normalizaron a las células tratadas con vehículo.
fosfatidilserina externalización (anexina V)
ensayo se analizó
La externalización de fosfatidilserina mediante el annexin- kit de tinción de V-FLUOS (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, HT-29 y T84 células se trataron como se indica en la figura resultados correspondientes y posteriormente marcado con anexina-V-FLUOS y yoduro de propidio. citometría de flujo se llevó a cabo usando el Accuri C6 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Los datos fueron analizados utilizando FlowJo 7,6 (Árbol de la estrella). Para la presentación gráfica de barras, la apoptosis temprana compuesto (anexina positivo, negativo PI) y la fase avanzada de eventos apoptóticos (anexina positivo, PI positivo).
La detección de especies reactivas de oxígeno (ROS)
Formación de ROS se detectó utilizando la sonda de ROS-sensible CellROX Orange (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Este colorante de células permeante es no fluorescente en un estado reducido y presenta fluorescencia naranja brillante tras la oxidación. CellROX naranja fue elegido para medir extracelular, así como intracelular de ROS porque este tinte es compatible con condiciones de medio completo y no requiere la activación celular. Para la detección de ROS extracelular, CellROX naranja se diluyó a una concentración final de 10 mM en medio de cultivo celular completo, y se añadieron compuestos IAE y de prueba como se indica en la figura resultados correspondiente. La medición se realizó en placas de 96 pocillos negros (# 655090, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) en un volumen final de 150 l /pocillo. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, el tinte estaba protegido contra el oxígeno del aire mediante la adición de una capa de sellado de 100 l de aceite mineral (Luxcel Biosciences, Cork, Irlanda) a cada pocillo. La intensidad de fluorescencia (529/590 nm) se registró durante 24 horas a 37 ° C utilizando el polarstar Omega (BMG Labtech). Los valores de fluorescencia a tiempo cero se restaron de los análisis de datos utilizando GraphPad Prism 5.0. Para la detección de ROS intracelular, las células HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos (TPP, Biochrom) con una densidad de 250.000 células /pocillo un día antes del tratamiento. Después del tratamiento con IAE, MD o vehículo, las células se trataron con tripsina y después se lavaron con PBS. Las células sedimentadas se resuspendieron en 1 ml de 5 M CellROX naranja en PBS y se incubaron durante 20 min a 37 ° C. Para eliminar tinte no incorporado se lavaron las células y se resuspendieron de nuevo en PBS antes de la citometría de flujo de detección (utilizando un dispositivo de Accuri C6). Los datos fueron analizados utilizando FlowJo 7,6 (Árbol Star) y GraphPad Prism 5.0.
Detección de la peroxidación lipídica
La formación de peróxidos lípidos celulares se investigó utilizando el ensayo de peroxidación lipídica Click-It (Life Technologies ). Este ensayo hace uso de alquino linoleamida (LAA, ácido linoleico alquino-modificado) que se ensamblan con las membranas celulares. LAA puede oxidarse dando lugar a proteínas-alquino modificado que puede ser etiquetados utilizando un Alexa Fluor 488 tinte azida modificado a través de la química clic catalizada por cobre. Por lo tanto, el aumento de la intensidad de fluorescencia se detectan debido a la peroxidación de lípidos mejorada tras el tratamiento. Un día antes de celdas de tratamiento HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos con una densidad de 250.000 células /pocillo. Las células se trataron después durante 24 h con el IAE o menadiona en presencia de 50 mM LAA. Después de tripsinización, las células se lavaron con PBS y se fijaron en 3,7% de formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron en PBS de nuevo, permeabilizadas utilizando 0.5% de Triton X-100 en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y posteriormente bloqueados por la adición de 1% de BSA durante 30 min a temperatura ambiente. Restante BSA se eliminó lavando rigurosamente las células con PBS. Las células sedimentadas se incubaron con 500 l de click-iT cóctel de reacción durante 30 min a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción Click se detuvo añadiendo 1% de BSA /PBS. Las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron con PBS. La citometría de flujo se realizó usando el dispositivo Accuri C6. Los datos fueron analizados utilizando FlowJo 7,6 (Árbol Star) y GraphPad Prism 5.0.
La microscopia de fluorescencia
Para la visualización de la peroxidación lipídica utilizando las células de Click-iT peroxidación lipídica método HT-29 se sembraron el 13 mm cubreobjetos colocados en placas de 24 pocillos con una densidad de 125.000 células /pocillo un día antes del tratamiento. Las células fueron tratadas durante 24 h con el IAE o menadiona en presencia de 50 mM linoleamida alquino (LAA). Después, las células adherentes se lavaron con PBS y se fijaron en 3,7% de formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron en PBS, permeabilizaron mediante el uso de 0,5% de Triton X-100 en PBS (PBS-T) durante 10 min a temperatura ambiente y se bloquearon mediante la adición de 1% de BSA durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, se añadió 250 l de click-iT cocktail de reacción de acuerdo con el protocolo del fabricante y se incubaron las células durante 30 min a temperatura ambiente. Las reacciones se detuvieron mediante lavado con 1% de BSA en PBS, y las células se lavaron de nuevo con BSA-PBS libre. cubreobjetos fueron finalmente counterstained con una solución a prolongar Oro Antifade MOUNTANT (DAPI) y se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Microscopía de fluorescencia se llevó a cabo utilizando un instrumento LSM700 (Zeiss, Jena, Alemania) |.
Para la detección de PARP escindida, HT-29 células se sembraron en tiras de 13 mm de cobertura (Sarstedt, Nürnbrecht, Alemania) y colocado en placas de 24 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con una densidad de 125.000 células /pocillos un día antes del tratamiento. Las células se trataron durante 24 h con el IAE o compuestos de ensayo, se lavaron con PBS, y finalmente se fijaron en formaldehído al 4% /PBS durante 15 min. Las células se permeabilizaron en 0,3% de Triton X-100 /PBS (PBS-T) durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente y posteriormente bloqueado en el 5% de suero de cabra (Sigma Aldrich) en PBS-T (0,3%) durante 60 min a temperatura ambiente . Después, las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo primario contra la PARP escindida (# 5625, Cell Signaling Technology), que se diluyó (1: 200) en 1% BSA /PBS-T (0,3%). Las células se lavaron con PBS-T (0,3%) y se marcaron por IgG anti-conejo (H + L), F (ab ') 2 fragmento de Alexa Fluor 488 conjugado (# 4409, Cell Signaling Technology) diluido (1: 1000) en 1% BSA /PBS-T (0,3%) durante 1 h a temperatura ambiente.
F-actina se tiñó con Texas Red-X faloidina (Life Technologies) durante 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, cubreobjetos se contratiñeron usando solución de prolongar oro Antifade MOUNTANT (que contiene DAPI) y se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente. La microscopía de fluorescencia se llevó a cabo utilizando un dispositivo LSM700 (Zeiss, Jena, Alemania).
Ensayo de citotoxicidad
Para examinar el efecto del IAE sobre la viabilidad celular en el cáncer de colon y células primarias, aplicamos el ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo (Promega, Mannheim, Alemania), como se describe recientemente [11]. Por lo tanto, HT-29, y CCD 841 CoN células se sembraron en placas de 384 pocillos negras (# 3712, Corning, Wiesbaden, Alemania) con una densidad de 5000 células /pocillo en un volumen final de 25 l /pocillo. Las células fueron tratadas durante 24 h con la serie de concentración de IAE por adición de 10 l de una concentración madre de 3,5 veces. Después de luminiscencia tratamiento se midió usando el dispositivo polarstar Omega (BMG Labtech). La viabilidad se calcula por sustracción de la luminiscencia de células muertas de los valores totales de luminiscencia. Los datos se ajustaron utilizando GraphPad Prism 5.0 de acuerdo con la ecuación:. Y = Inferior + (Superior-Inferior) /(1 + 10 ^ ((X-LogIC50))
xenoinjertos de tumores estudio
Para estudiar el
in vivo
eficacia del IAE para el tratamiento de CRC humana, un estudio de la inhibición del crecimiento del tumor se realizó mediante el modelo de ratón con xenoinjerto HT-29 de tumor. el estudio fue aprobado el 13 de agosto
º 2014 por el Charles río Servicios de investigación de descubrimiento NC Cuidado de Animales y el empleo Comisión y realizado por Charles River Discovery Research Services (Morrisville, Carolina del Norte, EE.UU.). el bienestar animal de Charles River Discovery Services Research fue aprobado por la Oficina de Laboratorio bienestar Animal el 14 de diciembre
º 2011 para el período de tiempo entre el 14 de 2011 diciembre al 31 de octubre
st 2015 (número de identificación A4358-01). el estudio se realizó de acuerdo con Charles River Discovery Investigación Servicios Servicio de Salud Pública de Estados Unidos las políticas y directrices de Carolina del Norte y (estudio animal número de protocolo:.#980702) brevemente, 36 atímicos desnudos (NCr nu /nu) ratones hembra se implantaron con 5 millones de HT-29 células por vía subcutánea en el flanco. En el día de la inoculación, los ratones se dividieron al azar en dos grupos (n = 18), y por vía oral gavaged bidaily durante 4 semanas con 50 mg /kg IAE en agua desionizada o sólo con vehículo. Los volúmenes del tumor y el peso corporal se controlaron durante todo el experimento de Charles River Discovery Servicios de investigación y documentación de los datos fue enviado a los autores de este artículo para el análisis de datos. Al final del tratamiento, se recogieron los tumores, se pesaron y se almacenaron a -80 ° C antes de los análisis más. Se recogió sangre por punción cardiaca terminal bajo anestesia con isoflurano, y el suero se analizó por medio de pruebas de química clínica en Charles River.
análisis estadísticos
Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) si no se indique otra cosa. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando GraphPad Prism 5.0. Para la comparación de dos grupos de significación estadística se examinó mediante la prueba t no apareado de Student de dos colas si no denotado de otra manera. Para comparaciones múltiples datos fueron analizados por ANOVA de una vía con la prueba post posterior de Dunnett. Un
p ≤ 0,05
valor se definió como estadísticamente significativo.
Resultados
IAE inhibió la proliferación de las células cancerosas e inducida G2 /M del ciclo celular detención
para investigar los efectos de IAE sobre la proliferación de cáncer colorrectal, células HT-29 y T84 fueron tratados con la serie de concentración de IAE durante 72 y 96 h (en función de la variable en el tiempo requerido para la proliferación celular de las células T84 HT-29 y), respectivamente. La proliferación celular se determina mediante la medición del contenido de ADN celular. IAE inhibe la proliferación de células de carcinoma HT-29 y de colon T84 de una manera dependiente de la concentración con IC
50 valores (media ± DE) de 6 ± 1 g /ml (Figura 1A) y 9 ± 1 mg /ml ( Fig 1B), respectivamente.
inhibición de la proliferación de 29 HT-células de cáncer de colon (a), células de cáncer de colon T84 (B), células PC-3 de cáncer de próstata (c), las células de cáncer de mama MCF7 (D células) y normal CCD 841 coN (colon) (e) después del tratamiento con IAE y un pequeño panel de medicamentos contra el cáncer (es decir, irinotecan, 5-FU y oxiliplatin). Las células fueron tratadas con la serie de concentración de IAE y compuestos durante 3 días (A y C) y 4 días (B y D, E), respectivamente. El número relativo de células se determinó por medición del contenido de ADN celular mediante la unión de colorante fluorescente. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 4).
En la fase inicial del estudio, que, además, probado dos modelos celulares de cáncer no relacionados, es decir, PC-3 (próstata) y MCF7 (mama ), para excluir más o menos celulares efectos específicos del IAE. Al igual que en los dos modelos de cáncer de colon, la inhibición IAE inducida de la proliferación (IC
50 valores de 44 ± 4 mg /ml (Figura 1C) en PC-3 y 11 ± 1 g /ml (Figura 1D) en las células cancerosas MCF7 , respectivamente). Estos resultados sugieren que los efectos del IAE no se limitaron a las células de carcinoma de colon.
A medida que los fármacos citotóxicos contra el cáncer irinotecan, 5-fluorouracilo (5-FU) y oxaliplatino, IAE mostraron eficacias de tratamiento entre el 70 y el 80%, lo que indica una fracción de 20-30% de las células cancerosas todavía en proliferación después del tratamiento (Fig 1, Tabla 1). En general, el IC
50 valor de IAE fue de aproximadamente un orden de magnitud mayor en comparación con los compuestos aplicados. Cabe destacar que, en el CCD 841 células Côn normales (células de colon primario que derivan de un bebé), la proliferación se inhibió por el IAE-y también por 5-FU y oxaliplatino en IC
50 valores que eran aproximadamente un orden de magnitud inferior a para las líneas celulares de cáncer (Fig 1E y en la Tabla 1). Por otra parte, en comparación con las células de cáncer en las células del colon primarios eficiencias de inhibición fueron claramente inferior, lo que indica un mayor número de todavía la proliferación de células de colon normal en comparación con las células de cáncer de colon ensayados.
La proliferación celular es generalmente vinculada a la progresión del ciclo celular [12]. por tanto, nos preguntamos si los efectos antiproliferativos de IAE observados son el resultado de los cambios en la regulación del ciclo celular. Se han tratado las células HT-29 de carcinoma de colon con 30 mg /ml IAE durante 24 horas y se analizaron las células después de la tinción con yoduro de propidio por citometría de flujo. tratamiento IAE resultó en una acumulación significativa en la fase G2 /M (40 vs. 24%) con una reducción concomitante en la fase G0 /G1 (35 vs. 58%) y la fase S (9 vs. 14%, figura 2A). IAE aumentó aún más el número de células en la fase de subG1 (17 vs 3%), lo que indica la inducción de apoptosis en estas células.
A, del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo de células teñidas con yoduro de propidio. Histogramas (arriba) muestran un experimento representativo para cada condición de tratamiento. diagramas de barra (abajo) muestran el porcentaje de la población de células en apoptosis subG1, G0 /G1, S y G2 /M fases del ciclo celular y se expresan como media ± SEM (n = 3). * P = 0.05, *** p≤0.001 frente al control. B, se analizaron lisados de células enteras para la expresión de la ciclina A2, ciclina D3, CDK2, CDK4, CDK6 y proteínas GAPDH por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos.
Además, se analizó la expresión del ciclo celular regulador proteínas por inmunotransferencia. De acuerdo con la citometría de flujo de datos, el tratamiento IAE redujo la expresión de las ciclinas A2 y D3, y de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) 2, 4, 6 (Fig 2B). En general, los cambios observados en la expresión de las proteínas reguladoras del ciclo celular, así como la detención G2 /M observado posiblemente representan el crecimiento de células efectos inhibidores de IAE en células de cáncer colorrectal.
caspasas tratamiento IAE activados, la fragmentación del ADN inducida y dio lugar a la externalización de fosfatidilserina en células de carcinoma de colon
la activación de la red de señalización de caspasa es un sello distintivo de la apoptosis, la conexión extrínseca y estímulos intrínsecos con eventos apoptóticos aguas abajo. Con el fin de arrojar más luz sobre los efectos del IAE en la red de señalización celular caspasa, que mide la activación enzimática de un panel de caspasas usando ensayos luminométricos. El tratamiento de células HT-29 con 60 mg /ml IAE durante 24 h no mostró efectos sobre las caspasas 2 y 6. Sin embargo, en células HT-29 tratamiento IAE resultaron en un aumento de 3 veces significativo de la actividad de las caspasas efectoras 3 /7, similar a la aplicación de 10 M estaurosporina (STN, aumento de 4 veces). se pudieron observar efectos similares usando una alternativa (metastásico) modelo de cáncer de colon (células T84), corroborando los resultados derivados del modelo de células HT-29 (Fig 3A).
A, células HT-29 y T84 fueron tratado por 24 h. la activación enzimática de las caspasas 2, 3/7, 6, 8 y 9 se determinó mediante el uso de ensayos basados en la luminiscencia. Se normalizaron los datos para controlar el tratamiento y se expresan como media ± SEM (n = 4). B, se analizaron los lisados de células enteras a partir de células HT-29 tratadas durante 24 h para la expresión de proteínas totales y escindidos de caspasa 3, caspasa 9 y PARP mediante inmunotransferencia. Los números indican relaciones de densitométricos de la escinde para proteínas totales se normalizaron para controlar tratamientos. C, Microscopía de fluorescencia de las células HT-29 tratadas por 24 h. Exfoliados caspasa 3 se marcó verde, F-actina rojo y el azul núcleo. Las barras de escala, 25 m. D, HT-29 células se trataron durante 6 h. Se detectó fragmentación de ADN a través de la acumulación de ADN marcadas con BrdU citoplasmática por ELISA. Se normalizaron los datos para controlar el tratamiento y se expresan como media ± SEM (n = 5). N. S. no es significativa, p = 0.05 *, ** p≤0.01, *** p≤0.001 frente al control.
Es de destacar que el tratamiento IAE aumentó la actividad de ambos, la caspasa 8 y caspasa 9, alrededor de 4 veces (figura 3A), lo que indica la inducción de la extrínseca (receptor de muerte mediada), así como la vía intrínseca (mitocondrial mediada) de la apoptosis en las células HT-29. Como detectado por inmunotransferencia, que, además, se observó la escisión inducida por la caspasa efectora 3, corroborando así la activación por encima de la detecta. tratamiento IAE resultó aún más en aproximadamente 9 veces mayor de la escisión de la poli asociada a la cromatina (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (Fig 3B). PARP división también se validó mediante microscopía de fluorescencia (Figura 3C). Dado que se conoce la PARP que se activa cuando se produce daño en el ADN, que investigarse más a los efectos del IAE sobre la integridad del ADN. En línea con la escisión de PARP, los experimentos de BrdU de etiquetado mostraron niveles elevados de ADN citosólico en las células HT-29 tratadas con 60 mg /ml IAE por 6 h, lo que indica la fragmentación del ADN de apoptosis tras el tratamiento IAE (Fig 3D).
en las células sanas fosfatidilserina (PS) se restringe generalmente a la cara interna de la membrana celular, y la exposición de fosfatidilserina en el exterior prospecto se considera como una característica de la apoptosis [13]. Así trataron células de carcinoma de colon con 60 mg /ml IAE durante 48 h y se determinó PS externalización por citometría de flujo de células de yoduro marcado con anexina V-FLUOS /propidio. IAE aumentó significativamente el número de células apoptóticas del 6% al 22% en HT-29 (Fig 4A) y del 43% al 53% en las células T84 (Fig 4B). Se hicieron observaciones similares con dosis bajas de paclitaxel el medicamento contra el cáncer (5-50 nM) (Fig 4). En general, estos datos revelan que IAE indujo eficazmente la apoptosis en células de cáncer de colon humano.
anexina V ensayos de células de carcinoma de colon T84 (B) HT-29 (A) y después del tratamiento con IAE para 48 h. La apoptosis se determinó por citometría de flujo de Anexina V-FLUOS y yoduro de propidio células teñidas. Los gráficos de dispersión muestran un experimento representativo para cada condición de tratamiento. parcelas de barras indican el porcentaje de células apoptóticas, que comprende temprano (anexina positivo, PI negativo) y la etapa tardía (anexina positivo, PI positivas) eventos. Barras representan la media ± SEM (n = 3). * P = 0.05, p≤0.01 **, *** p≤0.001 frente al control.
Sorprendentemente, las células cancerosas tienen un desequilibrio de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Dado que las concentraciones elevadas de ROS pueden inducir la apoptosis, el aumento de estrés oxidativo a las células de cáncer podría ser una estrategia prometedora para la terapia [14].