Extracto
Los niveles elevados de citoquinas inmunorreguladoras el TGF-β1 en el cáncer y la infección por VIH se han relacionado con la supresión de las respuestas inmunes protectoras. La regulación transcripcional de TGF-β1 es complejo y todavía no se entiende completamente. Presentamos aquí por primera vez que la GLI2 factor de transcripción regula la expresión de TGF-β1 en las células CD4 humana + células T
.
in silico de cribado
reveló cinco nuevos sitios de unión putativos de GLI en el ser humano
TGF-β1
promotor. Al menos dos de estos sitios dentro de la humana
TGF-β1
promotor están regulados por el activador GLI2 como desmontables de
Hoteles en GLI2 reguladora de CD4
+ CD25
hi células T, altos productores de TGF-β1, disminuyeron significativamente
TGF-β1
transcripción. Además, ingenuo CD4
+ células T, los bajos productores de TGF-β1, el aumento de su nivel basal de
TGF-β1
ARNm después de la infección lentiviral con GLI2. La regulación transcripcional de
TGF-β1 fotos: por GLI2 es una nueva extensión de Sonic Hedgehog (SHH) y
TGF-β1
cruz de regulación y puede dar una idea de la elevación en detrimento del TGF-β1 que conduce a la patogénesis del cáncer y la infección por VIH
Visto:. Enrollador RL, Uittenbogaart CH (2012) GLI2 Regula el TGF-β1 en las células CD4 humano
+ células T: Implicaciones en el cáncer y el VIH patogénesis. PLoS ONE 7 (7): e40874. doi: 10.1371 /journal.pone.0040874
Editor: Derya Unutmaz, Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2011; Aceptado: 18 Junio 2012; Publicado: 31 de Julio, 2012
Copyright: © Enrollador, Uittenbogaart. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud AI-081636 y AI-028697 (Universidad de California en los Ángeles, Centro para la Investigación del SIDA), un Fondo Semilla Jonsson Comprehensive Cancer Center de, y un Premio Stein Oppenheimer Dotación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) es una citoquina pleiotrópica que regula la respuesta inmune en muchas enfermedades incluyendo el cáncer y la infección por VIH y juega un papel importante en la prevención de la patogénesis [1] - [5]. Es producido por varios tipos de células incluyendo CD4
+ CD25
hi células T reguladoras, los macrófagos, así como por los fibroblastos. TGF-β1 disminuye la proliferación de linfocitos T y B, funciones efectoras de muchas células del sistema inmune e induce las células T reguladoras periféricos [6]. Aunque TGF-β1 es crítica en todo el desarrollo de los mamíferos y para evitar la activación aberrante de sistema inmune del huésped, la expresión elevada de TGF-β1 puede amortiguar la respuesta inmunitaria protectora a tumores e infecciones.
alta producción aberrante de TGF-β1 por células malignas ha demostrado aumentar la metástasis, así como para prevenir una respuesta inmune del huésped de protección a los tumores [7]. En la infección crónica por el VIH, el TGF-β1 es elevada en varios compartimentos, incluyendo los tejidos linfoides, la sangre y el líquido cefalorraquídeo [8] - [10]. Aumento de los niveles de TGF-β1 pueden inducir el desarrollo de inducido (i) Treg observa en la infección por VIH crónica [11], [12], y pueden contribuir a la disfunción del sistema inmune durante la enfermedad en etapa tardía. La proteína del VIH-1 Tat induce TGF-β1 en los leucocitos humanos [13] - [15], los condrocitos [16], y también en murino CD2
+ células T de un modelo de ratón transgénico Tat [17]. Los mecanismos de inducción inducida por tumor y Tat mediada por TGF-β1 son desconocidos. Cáncer y el SIDA son sólo dos de las muchas enfermedades en las que el TGF-β1 juega un papel en la patogénesis.
Expresión de TGF-β1 activo está estrechamente regulada en la transcripción, traducción, y los niveles después de la traducción. Aunque la expresión de TGF-β1 ha sido un foco de intensa investigación, todavía estamos lejos de comprender la regulación compleja de esta citocina.
in silico
análisis de la región promotora del TGF-β1 indica varios supuestos sitios de unión de factores de transcripción conocidos. Algunos de estos factores de transcripción, como Sp-1 y Zf9, previamente se han encontrado para mediar en
TGF-β1
la transcripción, pero estos factores por sí solos no son suficientes para inducir la expresión de ARNm [18], [19]. Por ello, investigó el que otros factores de transcripción inducen TGF-β1 mRNA.
Se encontraron seis supuestos sitios de unión (cinco declarada previamente) para los factores de transcripción GLI humana por
in silico
análisis de la humana
TGF-β1
promotor. El factor de transcripción GLI2 es uno de los principales efectores corriente abajo de la vía de Sonic Hedgehog (SHH), que fue demostrado que desempeñan un papel en la función del sistema inmune adaptativo [20], [21]. La vía SHH modula la activación [22], la proliferación [23], [24], y la regulación de citoquinas [25] en las células CD4 + células T
. Puesto que existen varias interacciones entre el TGF-β1 y las vías de SHH (Tabla 1), que se centró en la regulación del TGF-β1 por los miembros de la familia de la vía SHH, es decir, las proteínas GLI, en el sistema inmunológico.
proporcionar evidencia de que al menos dos de los seis sitios de unión de GLI-putativos son necesarios para la regulación transcripcional mediada por GLI2 de la humana
TGF-β1
promotor. Al menos uno de estos dos sitios deben ser funcionales para observar la regulación de TGF-β1 por GLI2. Por otra parte, derribando
Hoteles en GLI2 humana CD4
+ CD25
hi Treg, se muestra que GLI2 es necesaria para la expresión de TGF-β1. La regulación transcripcional de
TGF-β1 fotos: por GLI2 aún no ha sido descrito y aumenta nuestra comprensión de las complejidades de
TGF-β1
regulación.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el uso de células mononucleares de sangre periférica anónimos para obtener células T y la línea celular epitelial 293T fue revisado por el Comité de Revisión Institucional de la UCLA (IRB), que llegó a la conclusión de que esta actividad no implicaba sujetos humanos, y por lo tanto no requieren una revisión o certificación del IRB.
in silico de cribado
la detección de sitios de unión putativos de GLI en el ser humano
TGF-β1
promotores hecho por la
in silico
análisis utilizando el programa de software MatInspector (http://www.genomatix.de). Una serie de veinte kilobases que rodean el primer ser humano
TGF-β1
promotor se utiliza para detectar sitios de unión del factor de transcripción putativo. Todos los seis sitios de unión de GLI putativos dentro de la primera kilobase de
TGF-β1
promotor#1 (cinco sitios potenciales) o el promotor#2 (un sitio potencial) tenían una puntuación de similitud matriz igual o mayor que 0,8. sitios de unión que se encuentran dentro de la primera región promotora proximal son nuevos y son el foco de este estudio
& amp luciferasa.; Promotor Estudios
El humano
TGF-beta 1
reportero construcciones de promotor-luciferasa, phTG5 y phTG1, fueron amablemente proporcionados por S. J. Kim [18]. El constructo phTG5 de tipo salvaje se mutó en el putatitve sitios de unión GLI (sitio A, B, o A y B) usando mutagénesis dirigida al sitio (SITE A: 5'-CAGCCCCCCCATGCC-3 'a 5' CAGCaaCaaaATGC-3 ', SITIO B: 5'-GAGCCCGCCCACGCGA-3 'a 5' GAGCaaGaaaACGCGA-3 ', bases mutadas en minúsculas). El constructo phTG1 de tipo salvaje se mutó en putativo sitio E GLI unión usando mutagénesis dirigida al sitio (sitio E: bases 5'-CCCACCACCCACGAA-3 'a 5'CCaAaaAaaaACGAA-3', mutada en minúsculas). El promotor de tipo salvaje, los promotores mutados, o un control de vacío-vector pGL3 fueron individualmente co-transfectadas con el activador constitutivo pGLI2ΔN vector (amablemente proporcionados por E. Roessler [26]) o el pcDNA3 de control con Lipofectamine 2000 utilizando procedimientos estándar en células 293T, una línea celular epitelial humana que contiene Adeno y SV-40 secuencias de ADN virales, obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC). El plásmido contiene un gen pGLI2ΔN GLI2 constitutivamente activa debido a un truncamiento amino-terminal. El dominio amino terminal del gen GLI2 humano tiene una función represiva, y es la eliminación se ha demostrado que aumenta la transcripción de los genes diana tales como GLI1 [26]. La línea celular 293T fue elegido debido a su eficacia de transfección y los bajos niveles de expresión GLI1, que es nuestra lectura para la activación GLI2. La expresión de luciferasa se midió a las 48 horas después de la transfección
aislamiento celular, cultivo, & amp.; Estimulación
Naïve CD4
+ células T, expresan CD4, CD31, CD45RA, y CD62L, se purificaron y se aisló a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) utilizando la selección negativa. CD4
+ CD25
células T reguladoras hi fueron enriquecidos a partir de sangre humana utilizando kits RosetteSep y Robosep de Tecnologías de células madre. Las células primarias se cultivaron en medio libre de suero que consiste en de Iscove medio de Dulbecco modificado suplementado con BSA sin lípidos (Sigma-Aldrich) en 1.100 g /ml, transferrina humana (Sigma-Aldrich) a 85,5 mg /ml, glutamina 2 mM, y penicilina /estreptomicina a 25 U /25 mg /ml. Todas las condiciones de estimulación de células T primarias se realizaron con αCD3 /αCD28 recubierto M-450 perlas de Invitrogen. superficie celular y inmunofenotipos intracelulares fueron validados por citometría de flujo como se describe anteriormente [27]. Para la detección de FoxP3 intracelular, las células se tiñeron primero para los marcadores de superficie celular, fijas y permeabilizadas con eBioscience recomienda tampones, siguiendo las instrucciones del fabricante, después se incubaron con 450 anticuerpos monoclonales conjugados con FITC o eFluor contra FoxP3 (eBioscience, clon PCH101).
siRNA desmontables
Desmontables de
GLI2
en las células T reguladoras humanas primarias se realizó utilizando ACCELL siRNA diseñado y validado por ThermoFisher /Dharmacon. Un siRNA no director se utilizó como control negativo. Un siRNA control positivo para GAPDH se utilizó para verificar caída. Desmontables de GLI2 se realizó utilizando un siRNA disponible y validado comercialmente de Dharmacon (A-006468-14 - Target secuencia - 5 'GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3'). Un control negativo, separado e independiente utilizando un revuelto
GLI2
siRNA secuencia (5'-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ') se utilizó para hacer frente a los efectos fuera de la meta.
GLI2
caída se verificó mediante la evaluación de
GLI1
la expresión de ARNm después de la estimulación. GLI1 ha sido previamente demostrado ser regulada por transciptionally GLI2 y es el control positivo de
GLI2
caída.
+ células T
purificada CD4
+ CD25
hiFoxP3 reguladoras se incubaron con el siRNA y medio ACCELL libre de suero (Dharmacon) durante 72 horas antes de la estimulación con perlas recubiertas αCD3 /αCD28. Veinticuatro horas después de la estimulación, se recogieron las células para medir
TGF-beta 1
los niveles de ARNm por RT-PCR. los niveles de TGF-beta 1 se normalizaron a
18S rRNA Opiniones y comparación con las células no estimuladas.
RT-PCR
Taqman Gene Expresión de cebador /sonda conjuntos de
TGF-β1 , GLI1
, 18S rRNA, y
GAPDH en venta Applied Biosystems Inc. se utilizaron para medir los niveles de transcripciones en diferentes condiciones. La expresión de
TGF-β1, GLI1
, y
GAPDH
se normalizaron a los niveles de ARNr 18S y expresión relativa entre las condiciones se calculó para evaluar la regulación positiva /regulación a la baja de la transcripción.
Infecciones lentiviral
el
GLI2ΔN
transgén se colocó en una tercera generación de VIH-1 vector en el vector UCLA Core. La mayoría de la secuencia de codificación viral de VIH fue removido y reemplazado por el transgén. Las LTRs se modificaron para ser "auto-inactivación", y la transcripción del genoma del vector en las células de empaquetamiento fue impulsado por un no-VIH promotor. Virus fue hecho usando células 293T que fueron co-transfectadas con el plásmido vector y otros tres plásmidos que codifican a) las enzimas virales y proteínas estructurales, excepto Env, B) Rev, que está implicado en el transporte del ARN del VIH, y C) glicoproteína VSV, que es un sobre de pan-trópico que permite la entrada del virus en casi cualquier tipo de célula. Naïve CD4
+ células T se infectaron con 100 p24 ng por millón de células en medio libre de suero durante 96 horas. se aisló el ARN para la determinación de los cambios en la expresión génica mediante RT-PCR. a lentivirus que contiene GFP-fue utilizado como un negativo control y también para medir la eficacia de la infección.
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP) chip análisis
se hizo para determinar si GLI2 se une a la
TGF-β1
promotor. Reguladora CD4
+ CD25
hi células T se aislaron negativamente como se describe anteriormente. Las células se estimularon con perlas recubiertas con αCD28 αCD3 /durante la noche. El kit GLI2 ExactaChIP (R & amp; D Systems) se usó para la inmunoprecipitación de la cromatina. Las células se fijaron, se lisaron, y se sonicaron antes de la incubación con cualquiera de αGLI2 recubiertos o perlas de agarosa αIgG recubierto de control. PCR se realizó siguiendo chip para evaluar la unión al promotor de
TGF-β1
GLI. Putativo GLI2 sitio de unión 'E' (Figura 1) se detectó usando cebadores diseñados (5'-CTGGGGTCAGCTCTGACAGT-3 'y 5'-CAGTTGGCGAGAACAGTTGG-3'; 290 fragmentos de pares de bases). La
Bcl2
región promotora se detectó como un control positivo de unión GLI-utilizando cebadores del kit ExactaChIP. Una región 238 pb de la
IL-10
promotor que no contenía el sitio de unión putativo GLI2 se midió como un control negativo (5'-TGATTTCCTGGGGAGAACAG-3 'y 5'-CCCACCCCCTCATTTTTACT-3').
Hay dos informaron los promotores en el ser humano
TGF-β1
gen.
in silico
análisis de la humana
TGF-β1
regiones promotoras proximales utilizando el programa de software Genomatix reveló cinco no identificados previamente putativos de unión GLI-sitios (A a E) en una región altamente conservada de la Genoma humano. Sitio F en el segundo promotor ha sido previamente identificado y estudiado [28]. Países A y B (que se solapa con C), todas están dentro del phTG5 constructo informador de luciferasa utilizada en los estudios de mutagénesis promotor. Site E está presente en el constructo phTG1. Aproximadas posiciones de pares de bases de posibles sitios de unión GLI se muestran en relación con los dos sitios de inicio de la transcripción reportados para el ser humano
TGF-β1
gen.
Co-inmunoprecipitación
Co-immunopreciptation se realizó para evaluar la unión de GLI2 humano al VIH-1 Tat. transfecciones duales se realizaron en células 293T usando tres conjuntos diferentes de plásmidos: (GLI2-6xMYC + VIH-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 control), (VIH-1 Tat-FLAG + de control pcDNA3). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron y se recogieron las proteínas liberadas por co-IP (Kit Pierce Co-IP de Thermo Scientific). La resina de agarosa se revistió con uno de los tres anticuerpos: anticuerpo Sigma F1804 anti-FLAG M2 (de obligar Tat a talón), CST 71D10 anticuerpo anti-MYC (para unirse GLI2 a talón), o un anticuerpo de control de isotipo. Después de co-IP, las eluciones se corrieron en un gel de SDS-PAGE seguida de Western Blot.
Estadísticas
Todos los análisis se llevaron a cabo por el Instituto del SIDA de UCLA Bioestadística Core o con GraphPad Prism Software 5 . Las variables se expresan como medias con el error estándar de la media. ANOVA y Rangos de Wilcoxon suma de prueba de dos colas, se combina en su caso, se utilizaron para analizar las diferencias entre poblaciones. Un valor de p menor o igual a 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Seis putativos GLI sitios de unión se encuentran dentro de la humana
TGF-β1
Promotores
a través de
in silico
análisis utilizando MatInspector (http://www.genomatix.de) Se encontraron seis supuestos sitios de unión dentro de GLI los dos reportado humana
TGF-β1
promotores, incluyendo una se informó anteriormente sitio dentro del segundo promotor [28], además de cinco sitios que eran previamente no identificado. Ambos programas de software Genomatix y UCSC genoma (www.genome.ucsc.edu) indican un alto grado de conservación de la secuencia que rodea el
TGF-β1
región promotora en los mamíferos que sugiere la relevancia funcional de lo humano
TGF -β1
promotores. La secuencia de unión de consenso para los factores de transcripción GLI ha sido identificado como 5'-TGGGTGGTC-3 '[29], [30]. Los seis sitios de unión de GLI putativo reportados en este estudio tienen un alto grado de similitud matriz
43 y se enumeran en la Figura 1. La abundancia de posibles sitios de unión de GLI dentro de los primeros mil pares de bases del sitio de inicio de la transcripción de la
TGF-β1
promotor sugiere que esta región promotora proximal puede ser regulado por los factores de transcripción GLI.
GLI2 activa el primer humano
TGF-β1
promotor a través de al menos dos de los supuestos sitios de unión a GLI-
el sitio de unión GLI putativo en el segundo promotor TGF-1 ha sido informado de que no responde a la estimulación por SHH Eichenmuller
et al.
[28]. Sin embargo, hasta ahora no se ha informado de los cinco sitios putativos en el primer promotor ser regulada por proteínas GLI. Se utilizó un constructo indicador que contiene los primeros 500 pares de bases del promotor de TGF-β1 humano que fue colocado aguas arriba del gen de luciferasa de luciérnaga por Kim
et al.
(PhTG5) [18]. Este vector de expresión se co-transfectó en células 293T junto con un activador de GLI constitutiva construir pGLI2ΔN [26] o un plásmido de control pcDNA3 para evaluar la regulación GLI2 mediada del promotor del gen de TGF-β1 humano.
La humano
TGF-β1
región del promotor se colocó en un vector de luciferasa pGL3-basic. (A) Los tres sitios de unión de GLI dentro de esta región (países A, B, y C) fueron mutados por separado o conjuntamente (WT = tipo salvaje
TGF-β1
promotor phTG5, MUT-A = sitio de una mutación , MUT-B = sitios B /C mutación, MUT-A /B = sitios A /B /C mutación, pGL3 = vector de control). Estos
TGF-β1
promotor: constructos de luciferasa fueron co-transfectadas en células 293T con el activador constitutivo GLI (GLI2dN) y se normalizaron con el control negativo (pcDNA3). El activador GLI indujo un aumento de cuatro veces de la actividad luciferasa en phTG5 sobre el control. La mutación de ambos sitios de unión GLI (phTG5AB) abrogadas esta inducción (n = 10, p = 0,0011 *, ** p = 0,0033). (B) El putativo sitio de unión de GLI E fue mutado en el plásmido indicador phTG1 (WT = tipo salvaje TGF-1 promotor phTG1, MUT-E = E sitio de mutación, pGL3 = vector control). El activador GLI indujo un aumento de seis veces de la actividad luciferasa en phTG1 sobre el control. La mutación del sitio de unión E GLI disminuyó esta inducción de casi el doble (n = 12, p = 0,0025 ***).
Después de co-transfección de GLI2ΔN y phTG5 en células 293T, se observó una aumento de aproximadamente 4 veces de la expresión de luciferasa en los controles (Figura 2). Como la región promotora del phTG5 contiene tres de los seis sitios de unión putativos de GLI (A, B, & amp; C), se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para mutar los sitios de unión de forma individual o en combinación estos putativo GLI (denotado phTG5A, phTG5B, y phTG5AB respectivamente ). Aunque la mutación de un solo sitio sólo redujo modestamente la expresión de luciferasa, la mutación de ambos sitios reduce la expresión del gen reportero a los niveles de control. Estos hallazgos indican que GLI2 puede activar la transcripción en el humano
TGF-β1
promotor y que la unión a por lo menos uno de estos sitios se requiere para que esto ocurra. La mutación en el sitio E, que se encuentra más arriba del sitio de inicio de la transcripción, se realizó para evaluar su papel en la expresión de TGF-β1 GLI2 inducida. Se utilizó un constructo phTG1 reportero de luciferasa que contiene -1362 a 11 bases cerca del sitio de inicio de la transcripción del promotor de TGF-β1 humano [18]. Después de la mutación de la posible sitio de unión a GLI, la expresión de la luciferasa disminuyó aproximadamente dos veces después de la cotransfección con el activador GLI2 constitutiva. será necesario realizar más análisis para examinar si putativo GLI sitios distintos de los sitios de unión A, B y E también son funcionales.
Naïve humana CD4
+ células T se aislaron por selección negativa y se infectó con un lentivirus que contiene una construcción activador GLI2ΔN o un control GFP. 72 horas después de la infección, se recogió el ARN celular para medir
TGF-beta 1
transcripciones. (A) relativa
TGF-β1
mRNA se midió mediante RT-PCR y normalizado a 18S rRNA.
TGF-β1
mRNA fue significativamente mayor (n = 6, * p = 0,0313) en células infectadas con GLI2ΔN en comparación con las células infectadas con el control GFP. (B) La eficacia de infección se midió a 69% usando un expresan GFP lentivirus control. (C & amp; D) El fenotipo de la indiferenciadas CD4
+ células T fue mayor que el 95% de las células en el día 0 fueron CD4
+ CD45RA
+ CD45RO
- células T ingenuas. La expresión de GLI2ΔN fue confirmada por Western Blot (inserto).
GLI2 activado puede favorecer
TGF-β1
transcripción en células indiferenciadas CD4
+ T
con el fin de investigar el efecto de los factores de transcripción GLI en células primarias, se infectaron células T naïve primario CD4
con vectores lentivirales que contienen el GLI2ΔN activador constitutivo o un control GFP. Expresión de GLI2ΔN se confirmó por Western blot (véase la inserción en la Figura 3). Indiferenciadas CD4 + células T
no constitutivamente expresan altos niveles de TGF-β1. Se midió el nivel de
TGF-β1
ARNm por RT-PCR antes y después de la infección con las construcciones de GLI. Como se muestra en la Figura 3A, la sobreexpresión de la GLI2ΔN constitutivamente activado en naïve CD4
+ células T aumentaron significativamente
TGF-β1
la expresión de ARNm (n = 6, p = 0,0313) después de la estimulación con αCD3 /αCD28- perlas recubiertas. Upregulation de
GLI1
mRNA, un gen GLI2 mediada conocido, indica que la proteína GLI2ΔN está activando la transcripción en estas células lentivirally infectados (datos no mostrados). La eficacia de infección se midió mediante la infección de
+ ingenuo células CD4 T con un lentivirus de control que expresa GFP (eficiencia de infección 69%, Figura 3B). El fenotipo de las células de los animales era CD4
+ CD45RA
+ CD45RO
- (Figuras 3C & amp; 3D).
CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ Treg se enriquecieron a partir de PBMC y después se incubó durante 72 horas con no director (NT) o
GLI2
siRNA. a continuación, se estimularon las células (1 αCD3 /αCD28 del grano: 1 célula) durante 24 horas adicionales. RT-PCR se utilizó para medir
TGF-beta 1
niveles de mRNA. Relativa
TGF-β1
o
GLI1
mRNA se normalizaron a 18S rRNA. (A)
GLI2
caída en Treg disminuyó significativamente
TGF-β1
transcripción (n = 7, * p = 0,0189). (B)
GLI1
ARNm se midió también como un gen regulado GLI2 de control; mostrando que desmontables de
GLI2 Hoteles en Treg también disminuyó
GLI1
ARNm (n = 5, ** p = 0,0278). (C) La secuencia de la
GLI2
siRNA se revueltos (SCRAM) como un adicional de
GLI2
control negativo siRNA y no fue significativamente diferente del control no director.
Regula gli2
TGF-β1
Transcripción en la primaria CD4 humano
+ CD25
hi Treg
a pesar de que la sobreexpresión de las proteínas transgénicas GLI puede modular
TGF-β1
transcripción en indiferenciadas CD4 + células T
, hemos querido evaluar el papel fisiológico de la activación GLI2 en células primarias que expresan altos niveles de TGF-β1. Estudios previos han utilizado siRNA desmontables genes específicos en Treg primaria [31], [32]. Desmontables de
GLI2
se realizó utilizando comercialmente disponible Dharmacon ACCELL siRNA para evaluar su función en la transcripción de TGF-β1 en primaria humana Treg.
GLI2
siRNA desmontables en primaria humanos CD4
+ CD25
hi Treg estimulado con αCD3 /αCD28 perlas recubiertas disminuyó la expresión de
TGF-β1 mRNA
por aproximadamente 5 veces ( la figura 4A, p = 0,0189). Para evaluar la caída de la actividad GLI2,
GLI1
expresión mRNA se midió mediante RT-PCR.
GLI1
la transcripción de genes es un objetivo abajo conocida del factor de transcripción activado GLI2. La disminución de expresión de
GLI1
ARNm es compatible con los desmontables de siRNA mediada por
GLI2 gratis (Figura 4B, p = 0,0278). Un control negativo independiente separada utilizando un revueltos
GLI2
secuencia de siRNA (5'-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ') se utilizó para hacer frente a fuera de objetivo efectos (Figura 4C). Estos resultados indican que GLI2 es importante en la regulación
TGF-β1
transcripción en primaria humana Treg. El Treg ordenados eran CD3
+ CD8
-CD4
+ CD25
hiFoxP3
+ células T. La pureza de la Treg era más de 85% (Figura 4D).
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) se realizó para evaluar la unión de GLI2 a la humana
TGF-β1
promotor. Primaria humana CD4 reguladora
+ CD25
hi células T fueron aislados negativamente y se estimularon con αCD3 perlas recubiertas con αCD28 /noche a la mañana. PCR se realizó para evaluar la unión GLI2. DNA entero se utilizó como control positivo para la PCR. GLI2 unido al
TGF-β1
promotor en 'Sitio E' en el ser humano
TGF-β1
promotor. GLI2 no se unió a una región no director en el ser humano
IL-10
promotor (carril 8).
GLI2 se une a la humana
TGF-β1
promotor
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP) se llevó a cabo para evaluar la unión de GLI2 a la
TGF-β1
promotor humanos. Primaria humana CD4 reguladora
+ CD25
hi células T fueron aislados negativamente y se estimularon con αCD3 perlas recubiertas con αCD28 /noche a la mañana. El Treg estimulada se incubaron con perlas de agarosa recubiertas con anticuerpos de control o αGLI2 αIgG. Como se muestra en la Figura 5, GLI2 ligado a la
TGF-β1
promotor. GLI2 unión ha demostrado ser en 'Sitio E' (Figura 5) en el ser humano
TGF-β1
promotor. Sin embargo GLI2 no se unió a una región no director en el ser humano
IL-10
promotor (carril 8).
Co-inmunoprecipitación se utilizó para probar la unión de VIH-1 Tat a GLI2 humano. transfecciones duales se realizaron en células 293T (combinaciones de plásmidos mostrados a la derecha) para expresar la Tat-FLAG y proteínas GLI2-6xMYC (pcDNA3 vacío = vector de control). Beads (A) se recubrieron con anticuerpo anti-FLAG y se incubaron con lisados de células de transfecciones#1-3 se muestra en el lado derecho. Después de lavado y elución pasos, la proteína unida se llevó a cabo en un gel de SDS-PAGE seguido de transferencia Western para evaluar la unión GLI2. El anticuerpo anti-myc se utilizó para confirmar la unión de GLI2 a Tat cuando Tat se une a la perla. (B) Las perlas se recubrieron con anticuerpo anti-myc y se incubaron con lisados de células de transfecciones#1-3 se muestra en el lado derecho. Después de lavado y elución pasos, la proteína unida se ejecuta en un gel de SDS-PAGE y Western Blot se hace para buscar la unión del VIH-1 Tat. Bandas desarrollaron en aproximadamente 27 kDa. anticuerpo anti-bandera fue utilizada para confirmar la unión de Tat a GLI2 cuando GLI2 fue atado a la perla.
VIH-1 Tat se une a GLI2
El aumento de plasma y líquido cefalorraquídeo ( CSF) niveles de citoquinas inmunosupresoras como TGF-β1 se encuentran durante el VIH-1 progresión de la enfermedad [8] - [10] conduce a un aumento en iTreg [11], [12]. El transactivador VIH-1 y la proteína viral Tat ha sido implicado como el inductor de TGF-β1 en ambos
in vitro
así como
in vivo
modelos [13] - [17]. A pesar de que Tat se ha demostrado que aumenta el TGF-β1, el mecanismo que subyace a la transcripción aún no se ha definido claramente.
Como hemos constatado que regula GLI2 TGF-β1 en el nivel transcripcional, hemos probado si se une el VIH-1 Tat a GLI2 humano y por lo tanto puede aumentar o estabilizar la transcripción TGF-β1 utilizando co-immunopreciptation (co-IP) para evaluar la unión de GLI2 humano al VIH-1 Tat. transfecciones duales se realizaron en células 293T con tres conjuntos diferentes de plásmidos: (GLI2-6xMYC + VIH-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 de control), (VIH-1 Tat-FLAG + de control pcDNA3). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron y se recogieron las proteínas liberadas por co-IP (Kit Pierce Co-IP de Thermo Scientific). La resina de agarosa se revistió con uno de los tres anticuerpos: anticuerpo Sigma F1804 anti-FLAG M2 (de obligar Tat a talón), CST 71D10 anticuerpo anti-MYC (para unirse GLI2 a talón), o un anticuerpo de control de isotipo. Después de co-IP, las eluciones se realizaron en un gel de SDS-PAGE seguido de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 6, el VIH-1 Tat une específicamente a GLI2 que se une a una perla. La reacción inversa también mostró la especificidad, lo que indica que estas dos proteínas pueden interactuar de hecho. La unión de VIH-1 Tat a GLI2 sugiere un mecanismo potencial para la inducción de TGF-β1 en la infección por VIH-1. necesitarán ser hecho para poner a prueba la sinergia funcional del VIH-1 Tat y GLI2 a afectar a la transcripción en el promotor TGF-β1 Otros experimentos.
Discusión
Nuestros resultados muestran que el factor de transcripción GLI2 juega un papel previamente desconocida, pero importante en la regulación transcripcional complejo de
TGF-β1.
a través de
in silico
análisis de screening que reveló seis sitios potenciales de unión GLI-en el promotor del TGF-β1 humano , cinco de los cuales eran desconocidos. Utilizando el análisis mutacional del ser humano
TGF-β1
promotor, encontramos que mejora gli2
TGF-β1
transcripción en al menos tres de los cinco sitios de unión de GLI-putativos (países A, B, & amp; E). Además, nuestros resultados muestran que la infección primaria de ingenuo CD4
+ células T (baja TGF-β1 células que expresan) con un constitutivamente activas realza GLI2 lentivirus
TGF-β1
de transcripción. Por otra parte, siRNA desmontables de
GLI2 Hoteles en primaria humanos CD4
+ CD25
hiFoxP3
+ Treg (TGF-β1 alta que expresan las células) disminuyó significativamente
TGF-β1
la transcripción . También mostramos por chip que GLI2 se une directamente a "Site E" en el promotor de
TGF-β1
. Esta regulación de TGF-β1 GLI2 mediada por mecanismo recientemente identificado puede tener implicaciones en enfermedades como el cáncer y el SIDA, donde los altos niveles de TGF-β1 contribuyen a la patogénesis
.
Aunque el papel de la regulación mediada por GLI de
TGF-β1
transcripción previamente no se ha demostrado, no hay evidencia indirecta de este mecanismo. Eichenmuller
et al.
Descubierto que
Ptch1
ratones knock-out, que tienen la activación constitutiva de la vía SHH, tienen más de 400 veces mayores niveles de
TGF-β1 mRNA
transcripciones [28]. Aunque los investigadores encontraron que el sitio de unión de GLI putativa en el segundo promotor no era sensible a GLI1, no investigaron el papel de GLI2 en la regulación de los cinco sitios de unión putativos de GLI que hemos descubierto en el primer promotor de TGF-β1.
Además, varios informes hacen hincapié en la estrecha relación entre el TGF-β1 y familias SHH /GLI [33], [34]. Liu
et al.
Informó la interacción entre la molécula de la ruta SHH GLI3 y las proteínas Smad (factores vía de TGF-β1 de transcripción) [35]. Además Dennler
et al.
Informó que GLI2 y GLI1 podrían ser inducidas a través de un mecanismo de SMAD mediada [36]. Los genes de la superfamilia de TGF-β
BMP-2, 4
, & amp;
7 in todos los elementos tienen GLI-que responda a sus promotores [37] - [39]. Lin
et al. Hola, ha encontrado un elemento SHH-sensible en la región promotora 5 'aguas arriba de
TGF-β2
[40].