Extracto
p53 supresor de tumor, que se activa por varios estrés y activación de oncogenes, es un objetivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer . En este estudio, por selección de paneles de inhibidores de la quinasa de proteínas y inhibidores de la fosfatasa de proteínas, se identificaron 5-iodotubercidin como un fuerte activador de p53. 5-iodotubercidin es derivado de purina y se utiliza como un inhibidor para diversas quinasas incluyendo adenosina quinasa. Se encontró que el 5-iodotubercidin podría causar daños en el ADN, verificados por la inducción de roturas en el ADN nuclear y focos positivos para γH2AX y TopBP1, la activación de ATM y Chk2, y la fosforilación S15 y sobre regulación de p53. Como tal, 5-iodotubercidin induce la detención del ciclo celular G2 de una manera dependiente de p53. La UIT también induce la muerte celular en las costumbres y dependiente de p53-independiente. rupturas de ADN fueron probablemente generado por la incorporación de 5-iodotubercidin metabolito en el ADN. Por otra parte, 5-iodotubercidin mostró que la actividad anti-tumor, ya que podría reducir el tamaño del tumor en modelos de xenoinjerto de carcinoma de ratón de maneras dependiente de p53 y -independiente. Estos resultados ponen de manifiesto 5-iodotubercidin como una droga genotóxico novela que tiene un potencial quimioterapéutico
Visto:. Zhang X, Jia D, Liu H, N Zhu, Zhang W, Feng J, et al. (2013) Identificación de 5-iodotubercidin como una droga genotóxico con potencial anticanceroso. PLoS ONE 8 (5): e62527. doi: 10.1371 /journal.pone.0062527
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de diciembre de 2012; Aceptado: March 22, 2013; Publicado: May 7, 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81130039, 31071229 y 81121001), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (el Programa Científico National Key (2012CB966901, a BL)), Programa de Pujiang Shanghai (10PJ1405000), Cheung Kong Programa de Becarios del Ministerio de Educación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo. De acuerdo con los datos recientemente publicados, había 12,7 millones de nuevos casos de cáncer y 7,6 millones de pacientes con cáncer murieron en 2008, con el cáncer de mama es más común en las mujeres y el cáncer de pulmón más común en los hombres [1]. El tratamiento del cáncer incluye los procedimientos quirúrgicos para eliminar el tejido maligno y el uso de la radioterapia y la quimioterapia para destruir las células malignas y /o reducir el crecimiento del tumor. Los medicamentos quimioterapéuticos se clasifican en agentes alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides y terpenoides de plantas, antibióticos antitumorales, y otros [2]. Hasta ahora, hay una falta de tratamiento a prueba de fallos para la mayoría de tipos de cáncer [3].
Anti-metabolitos son derivados de nucleósidos, incluyendo análogos de pirimidina. por ejemplo, gemcitabina y purina análogos, por ejemplo, fludarabina [4]. Se pueden incorporar en el ADN, dando lugar a la terminación de la extensión de cadena de ADN naciente. Algunos análogos de nucleósidos también pueden inhibir las enzimas implicadas en la síntesis de ADN o enzimas que mantienen la homeostasis desoxinucleótidos, interfiriendo con la síntesis de ADN adicional. Como tal, muchos de estos análogos de nucleósidos causan daño de ADN que incluye ADN de doble y de cadena sencilla se rompe para activar los mecanismos de defensa internos para matar a las células en división rápida o las células sometidas a reparación de ADN activo, o causar la detención del ciclo celular en la fase S [4]. Este es un importante mecanismo por el cual la mayoría de los anti-metabolitos ejecutan su actividad anti-cáncer.
En las células, el daño del ADN o el medicamento genotóxico activa una familia de quinasas (PI3K como PIKKs) que incluyen ATM, ATR y DNA PKcs en las roturas en el ADN o las horquillas de replicación atascadas, donde se fosforilan varias proteínas incluyendo γH2AX, TopBP1, Chk1 /2 y p53. La activación integrada de estas proteínas efectoras induce la detención del ciclo celular, la senescencia celular o apoptosis [5], [6]. Como resultado, las células con genoma inestable se eliminan, lo que impide la formación de tumores [7] - [11]. La vía Atm-p53 es una vía principal supresor de tumores p53 y está mutado en más de 50% de los tumores primarios humanos [12] - [14].
activación de p53 promueve la detención del ciclo celular, la senescencia y apoptosis. La activación o regulación de p53 en los tumores se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor, el establecimiento de p53 como un objetivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer [13], [15]. Varios compuestos de moléculas pequeñas se han desarrollado que se dirigen específicamente la interacción Mdm2-p53, estabilizar p53, e inhibir el crecimiento del tumor. Además, p53 puede ser entregado a los tumores con virus y esto se ha demostrado tener significativos efectos terapéuticos [16]. Para la búsqueda de nuevos fármacos potenciales anti-tumorales, seleccionados inhibidores de molécula pequeña de un panel de proteína quinasas y un panel de proteínas fosfatasas de compuestos que podrían activar p53 [17]. A continuación se presenta la identificación de 5-iodotubercidin (UIT) como un activador de p53. Itu está siendo utilizado como un inhibidor de quinasa en general, especialmente la adenosina quinasa (ADK) debido a su afinidad para los sitios de estas enzimas de unión a ATP y se ha demostrado que afectan a la proliferación celular y la supervivencia. ADK cataliza la transferencia del grupo γ-fosfato de ATP a adenosina, con lo que la regulación negativa de los niveles celulares de nucleótidos de adenina [18] - [20]. UIT tiene una estructura similar a la adenosina y se mostró aquí para generar el daño del ADN, activar la vía Atm-p53, e inducir la detención del ciclo celular en la fase G2 en modales dependientes de p53. La UIT también promueve la muerte celular en las costumbres y dependiente de p53-independiente. Más importante aún, la UIT se encontró que tienen actividad antitumoral, también en unos modales dependiente de p53 y -independiente. Estos resultados sugieren que la UIT es un fármaco quimioterapéutico potencial con propiedades distintas de la mayoría de los anti-metabolitos. Desde Itu ejecuta su actividad antitumoral principalmente a través de la generación de daños en el ADN, la UIT también puede causar inestabilidad del genoma en células normales y potencialmente conducir al desarrollo de cáncer. Por lo tanto, se debe tener precaución cuando se utiliza la UIT para el potencial no relacionados con el cáncer finalidad terapéutica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
La experimentación con animales en este estudio, incluyendo BALB /ratones desnudos, cASlac /6 ratones normales C57B, cajeros automáticos +/- ratones, se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía Nacional Research Council para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio, con los protocolos aprobados por el Cuidado y uso de Animales institucional de Shanghai , china [SYXK (SH) desde 2.011 hasta 0.112 mil]. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los ratones
Cell Cultura y
El embrión de fibroblastos de ratón primario (MEF) células (de 6 ratones C57B /) y ATM -. /- MEFs (de 129 ratones ) se generaron en el laboratorio como se describe anteriormente [11]. El HCT116 líneas celulares de cáncer de colon humano (p53 + /+) y HCT116 (p53 - /-) fueron un regalo del laboratorio de B. Vogelstein [21], [22]. Estas células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Hyclone) a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2.
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón TNEN (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,5% NP-40, y 0,1% de Triton X-100) suplementado con NaF 1 mM, Na
2VO
3, 1 mM PMSF, y 1 mg /ml de aprotinina, leupeptina, y pepstatina A. concentración de proteína se determinó usando un ensayo de Bio-Rad. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Los anticuerpos contra p-ATM, p-Chk2 (Thr68), Chk2, p-p53 (Ser15), o p53 se obtuvieron de Señalización Celular. Los anticuerpos contra Atm (GTX70103) eran de Genetex. Los anticuerpos contra la β-actina eran de Santa Cruz Biotechnology.
El silenciamiento de ARN
ARN pequeño de interferencia (siRNA) focalización ADK humana se obtuvieron de la empresa GenePharma y se transfectaron en células HCT116 siguiendo el protocolo del fabricante. Baja regulación de ADK se evaluó mediante PCR en tiempo real las 72 horas después de la transfección. Las secuencias de siGENOME ADK SmartPool eran AGGGAGAGAUGACACUAUA; GGAGAGAUGACACUAUAAU; AAAGUUAU GCCUUAUGUUG; y GAGAGAUGACACUAUAAUG. Control negativo UUCU CCGAACGUGUCACGUTT; ACGUGACACGUUCGGAGAATT.
inmunofluorescencia histoquímica
MEFs o células HCT116 cultivadas en cubreobjetos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y después se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA), que se permeabiliza con 0,1% de Triton X en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS con 1% de BSA (1:200). Los portaobjetos se bloquearon (BSA 1% en PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente, se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, y seguido de incubación de anticuerpo secundario durante 60 min a RT. Los portaobjetos se montaron y se observaron al microscopio confocal.
La extracción de RNA y PCR en tiempo real
ARN de las células se extrajeron utilizando Trizol (Invitrogen). El ADNc se sintetizó usando un equipo de Quantscript RT (Tiangen). Los niveles de mRNA de interés se determinaron mediante PCR en tiempo real, y se normalizaron a los niveles de β-actina. En tiempo real PCR se realizó usando Applied Biosystems 7500 sistema.
célula de análisis del ciclo de
Las células se sembraron en placas de 35 mm y se cultivaron durante 24 horas, alcanzando 60-70% de confluencia. Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de la UIT para las 24 o 48 horas, se recogieron por tratamiento con tripsina, se resuspendieron en 200 l de PBS, y se fijaron en etanol al 100% durante la noche a 4 ° C. Las células fijadas se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 800 l de PBS que contenía ribonucleasa A (100 mg /ml) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. A continuación, 10 l de yoduro de propidio (PI, 4 mg /ml de PBS) se añadieron a las muestras, que fueron evaluados en un citómetro de flujo citómetro utilizando el software Cell Quest (BD Bioscience).
Ensayo de Supervivencia Celular
para medir las tasas de supervivencia de las células después del tratamiento Itu, las células se sembraron a 1 x 10
4 en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante toda la noche, que luego fueron tratados con la UIT durante 48 horas. Se añadió reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche) a cada pocillo y se incubó adicionalmente durante 4 horas a 37 ° C. La absorbancia se midió frente a un control usando lector de microplacas a 440 nm. La longitud de onda de referencia fue de 630 nm.
Modelos xenoinjerto de carcinoma de ratón
ratones macho BALB /cASlac-desnuda (3 semanas de edad) fueron adquiridos de Shanghai Laboratory Animal Slac C. LTD. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones de ratón SPF de 1 semana antes de ser inoculado con células HCT116. HCT116 (p53 + /+ y p53 - /-) las células se cosecharon por tripsinización, se contaron y resuspendieron en PBS a la concentración de 5 × 10
7 /ml. Se les inyectó por vía subcutánea 3 × 10
6 células a la espalda de ratones BALB /cASlac ratones desnudos, con p53 + /+ células en el lado izquierdo y p53 - células en el lado derecho - /. Después de 2 semanas, los ratones se dividieron en varios grupos y se trataron con la UIT o disolvente (PBS). Los ratones se pesaron y el tamaño del tumor miden. La longitud (L) y el ancho (W) del tumor se midieron con un calibrador digital y expresado como volumen de tumor (0,5 l × W
2, mm
3).
Análisis ADN genómico por HPLC-MS
células y las células HCT116 MEF en fase estacionaria o cerrar la sesión fueron tratados con la UIT para diferentes períodos de tiempo. El ADN genómico se extrajo con fenol /cloroformo, se lavó a fondo con 70% de etanol, y luego digerido usando un método previamente reportado con modificaciones [23]. Brevemente, alícuotas de ADN genómico se incubaron con 1 DNasa l I (2 U /l, NEB), 10 l de veneno de serpiente de la fosfodiesterasa (0,26 mU /l, Sigma Aldrich), y 2 l Antártico Fosfatasa (5 U /l, NEB) durante la noche a 37 ° C. La digestión completa dio lugar a una mezcla de mononucleosides, juzgado por HPLC. Las muestras de ADN digeridos se analizaron en un sistema de HPLC-MS equipado con una columna C18 de Agilent (Agilent, San Jose, CA, EE.UU.). El disolvente A era agua que contenía 0,5% (v /v) de ácido fórmico y disolvente B fue metanol que contiene 0,25% (v /v) de ácido fórmico. Un perfil de elución se utilizó de 2 a 20% de B durante 30 min cada vez mayor a 98% durante otros 20 min, a continuación, 98% de B durante 10 min, y finalmente volviendo a 2% de B durante 20 min. La velocidad de flujo se ajustó a 20 l /min y el eluato se controló a 254 nm. Por lo general, se inyectaron 5 l de cada muestra utilizando el muestreador placa de pocillos.
El análisis de espectrometría de masas de las muestras forman el sistema de HPLC se llevó a cabo directamente con un espectrómetro de masas Agilent ESI-TOF. Masa datos espectrales fueron registrados en modo de ión positivo durante toda la duración de la ejecución de HPLC. Los datos fueron analizados mediante el QS Analyst (Agilent, San Jose, CA, USA).
Análisis de los niveles de dNTP celular
Un enfoque LC-MS /MS validado previamente se utilizó para determinar las concentraciones de dNTP [24]. Las soluciones estándar de dATP y dGTP (dCTP y dTTP se quedaron fuera debido a dificultades técnicas utilizando este sistema) a una concentración de 100 mmol /l se utilizaron para construir un 0, 19.5, 39, 312.5, 625, 1250 y 2500 ng /ml curva de calibración estándar.
Las células se recogieron y se resuspendieron en 500 l de helado 60% de metanol, vórtex, y se coloca a 95 ° C durante 3 min y se sonicó durante 30 s en un Branson Sonifier 450 ( Branson, Danbury, CT, EE.UU.). Los extractos se centrifugaron a 16.000 g durante 5 min a 4 ° C para eliminar los desechos de células y precipitado de proteínas y de ADN. Los sobrenadantes resultantes se pasaron a través de filtros centrífugos previamente equilibrada Amicon Ultra-0,5-ml a 4 ° C para eliminar las macromoléculas (& gt; 3 kDa) siguiendo el protocolo del fabricante (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). El filtrado se evaporó bajo vacío centrífuga a -70 ° C y el pellet resultante se resuspendió en 25 agua libre de nucleasa l listo para someter a ensayo o se almacena a -80 ° C hasta su uso. Antes del análisis de HPLC, las muestras fueron de nuevo se secó al vacío, se suspendió en 0,5 ml de HPLC H
2O que contenía dos unidades de fosfatasa ácida (0,26 mU /l, Sigma Aldrich) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C, para generar desoxinucleótidos. 30 l de la muestra se inyectó en un sistema de HPLC Acquity UPLC (Waters, EE.UU.) que se ejecuta la columna Thermo C18 100 x 2,1 mm, seguido de partícula 5 micras espectrómetro de masas en tándem cuadrupolo (Applied Biosystems TRIPLE QUAD 5500). se aplicó programa de gradiente paso 1.5.2.A Analyst para separar todos los analitos con una velocidad de flujo de 300 ml /min. La fase móvil consistió en metanol (componente A) y /l de tampón acetato de amonio 20 mmol a pH 4,5 (componente B). Después de la separación, los analitos en la eferente HPLC se introdujeron en el espectrómetro de masas a través de una interfaz de TurboIonspray junto con una corriente de nitrógeno turbo calienta para evaporar los disolventes y para aumentar la eficiencia de ionización. Las siguientes transiciones de masa fueron monitoreados-dA: 252,2 /234,1; dA1:252.2 /96.0; DG: 268,1 /232,1; dG1:268.1 /184,1; dG2:268.1 /124.1. A y A1 son derivados de dATP y G, G1 y G2 son derivados de dGTP.
Resultados
Identificación de la UIT como un activador de p53
Para buscar activadores de p53, hemos examinado por Western blot un panel de inhibidores de la quinasa y un panel de inhibidores de la fosfatasa para buscar compuestos conocidos que podrían regular por incremento de p53 en los niveles de proteína (para la lista de los inhibidores, véase la Tabla S1) [17]. MEFs primarios fueron utilizados para el cribado debido a líneas celulares por lo general llevan mutaciones en p53 y /o sus reguladores aguas arriba. Estos inhibidores se aplicaron a 10 M, la concentración recomendada por el fabricante para la inhibición de quinasas o fosfatasas. Dos compuestos fuera de los inhibidores de 113 fueron capaces de inducir la expresión de p53 en los niveles de proteína. Una de ellas es 5-iodotubercidin (Fig. 1A), un compuesto que se utiliza como un inhibidor de la adenosina quinasa y otras quinasas tales como Erk2. La UIT ha demostrado tener actividad anticonvulsiva, así [19]. p53 inducida por la UIT se observó sobre regulación en ambos MEFs y HCT116, siendo esta última una línea celular de cáncer de colon positiva para p53 (Fig. 1B y 1C). experimentos de dosificación indicado que la UIT era capaz de regular por incremento de p53 a concentraciones tan bajas como 0,25 M (fig. 1B y 1C).
A. Las estructuras de la UIT, la adenosina, y fludarabina. blot B. Western muestra que la UIT hasta regula p53 en MEFs de una manera dependiente de la dosis. Las células se trataron con varias concentraciones de la UIT durante 8 horas y los niveles de p53 se analizaron mediante transferencia de western. blot C. Western muestra que la UIT hasta regula p53 en células HCT116 de una manera dependiente de la dosis. Las células se trataron con varias concentraciones de la UIT durante 8 horas y los niveles de p53 se analizaron mediante transferencia de western. Una película expuesta a más largo también se muestra para indicar que p53 se expresó en las células HCT116 en el nivel basal. D. knock-down de ADK no activar p53. Panel izquierdo: la disminución de ADK ARNm en presencia de siRNA ADK; Panel derecho:. los niveles de proteína de p53 en presencia de control y ADK siARN en las células HCT116
¿Cómo Itu inducen p53 sobre regulación? la expresión de p53 está regulado por diversos estrés y la activación de oncogenes, estrés genotóxico en particular [25]. Desde Itu es un inhibidor de la ampliamente utilizada de ADK, que desempeña un papel crítico en la homeostasis de la adenosina [26], [27], es posible que la UIT perturba la homeostasis de la adenosina, interfiere con la síntesis de ADN y causa daño en el ADN y por lo tanto se activa p53. Si esto es cierto, derribando ADK imitaría la inhibición ADK con la UIT en p53 hasta la regulación. Utilizamos siRNA agrupado para derribar ADK en las células HCT116 (Fig. 1D, panel izquierdo), y encontramos que la disminución de los niveles de ADK, a diferencia de la inhibición de la ADK con la UIT, no alteró significativamente los niveles de la proteína p53 en el nivel basal ( la Fig. 1D, panel derecho), lo que sugiere que p53 inducida por la UIT sobre regulación no es causado probablemente por la inhibición directa de ADK.
Itu Provoca daños en el ADN
la UIT tiene una estructura similar a la purina con "NH" se sustituye por "CI" en la parte 7
ª posición del nucleósido purina (Fig. 1A). UIT puedan incorporarse al ADN después de convertirse a la desoxirribosa por la ribonucleótido reductasa [4]. UIT teóricamente podrían formar enlaces de hidrógeno con 2 timidina en el ADN de doble cadena (Fig. S1). Sin embargo, la UIT-T emparejamiento puede causar un problema de separación como "C-I" de la UIT (posición 7) es mucho mayor que "N-H" de la adenosina, y el anillo de purina alterado puede no ser reconocible por ADN polimerasas. Por otra parte, "C-I" de la UIT es más activa e inestable. La UIT es por lo tanto probable que se metaboliza y posteriormente incorporada en el ADN de causar daños en el ADN. Para confirmar esto, primero a prueba si la UIT podría alterar los cariotipos de las células HCT116. Las células se trataron en primer lugar con la UIT durante 36 horas y luego con colchicina husillo veneno para condensan los cromosomas. El número y la apariencia de los cromosomas se analizaron bajo un microscopio de luz después de la tinción GIMSA. Es obvio que el tratamiento Itu dio lugar a la aparición de cromosomas rotos en el 32% de las células tratadas por la UIT en comparación con el 0% en las células no tratadas (Fig. 2A), lo que sugiere que la UIT podría causar roturas en el ADN de doble cadena.
A. imágenes representativas de los cariotipos de HCT116 en la ausencia o presencia de la UIT. B. Detección de derivado de la UIT en el ADN genómico en la reproducción de las células. El análisis por HPLC-MS de los metabolitos de la UIT en el ADN genómico de las células tratadas por la UIT. ADN genómico se aisló de las células tratadas con la UIT y digerida en nucleósidos, que fueron analizados por HPLC (panel izquierdo), que fue directamente relacionada con espectrómetro de masas. MS análisis de la molécula con el tamaño de DTU se muestra en el panel derecho. C. Los intracelulares piscinas dATP y dGTP no se vieron afectados por el tratamiento de la UIT. A y A1 son derivados de dATP y G, G1 y G2 son derivados de dGTP.
Algunos de los fármacos quimioterapéuticos trabajo intercalando ADN (por ejemplo, doxorrubicina) o ADN de reticulación (por ejemplo, cisplatino), mientras que los análogos de nucleósidos generan roturas en el ADN mediante su incorporación en el ADN e interrumpiendo el emparejamiento de nucleótidos. Para probar si la UIT podría ser metabolizados e incorporados en el ADN genómico durante la replicación, se analizaron directamente los nucleótidos derivados de ADN genómico aislado de células tratadas por la UIT que estaban ya sea en la fase estacionaria o la fase de registro, con espectrómetro de HPLC-masa. La identidad de los nucleósidos se confirmó mediante la comparación de sustancia de referencia correspondiente. UIT (MW 392.153) puede ser metabolizado en desoxi-iodotubercidin (Ditu, PM 376.154), tubercidina (TU (con la -I inestable eliminado), PM 266.257), y desoxi-tubercidina (DTU, 250.257 MW). primero Se compararon los nucleótidos derivados de ADN genómico de HCT116 y MEFs y encontramos que HCT116 mostró un espectro mucho más complicado de nucleótidos y sus derivados que los de MEFs, lo que sugiere que el metabolismo de nucleótidos podría ser alterado en las células cancerosas. Entonces decidimos utilizar para probar si MEFs derivados Itu se incorporan en el ADN. Se encontró que DTU estaba presente en el ADN genómico de las células en fase log tratados con Itu pero no en células estacionarias o las células no tratadas (Fig. 2B). Estos resultados sugieren que la UIT se metaboliza (con -I eliminados) y se incorpora en el ADN.
Varios estudios han demostrado que los análogos de la purina tales como fludarabina y clofarabina podría inhibir la ribonucleótido reductasa, una enzima que cataliza la conversión de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos, disminuyendo así los niveles de dNTPs celulares e interfiriendo con la síntesis de ADN [4]. Se encontró que el tratamiento con la ITU en dosis suficientes para regular al alza de p53 no mostró ningún efecto sobre los niveles de mRNA de la ribonucleótido reductasa. También comparamos las piscinas de dATP y dGTP, que son productos de la ribonucleótido reductasa, en el control y células tratadas por la UIT con espectrometría de masas siguiendo un protocolo establecido, y encontramos que el tratamiento Itu no afectó a las piscinas de dATP o dGTP en las células ( Fig. 2C). Estos hallazgos sugieren que la UIT no inhibe la ribonucleótido reductasa.
Para validar este hallazgo, se trataron HCT116 y MEFs con la UIT durante 8 horas y se analizó la formación de daño en el ADN inducido por focos nucleares, que se postula como el daño del ADN y centros de reparación [28], [29]. Entre las primeras proteínas se reunieron en las roturas en el ADN son γH2AX, una variante de la histona H2A que se expresa de forma ubicua. Puede ser fosforilada por miembros PIKK tales como ATM y ATR rápidamente después de los daños del ADN [30]. Hemos encontrado que el tratamiento Itu dio lugar a una acumulación de focos nucleares positivo para γH2AX tanto HCT116 (10,39 ± 1,82% para las células no tratadas frente a 90,19 ± 2,21% para las células tratadas Itu) y MEFs (7,45 ± 0,29% para las células no tratadas vs. 91,63 ± 0,73% para las células tratadas Itu) (Fig. 3A y 3B). Además, el tratamiento Itu también dio lugar a una acumulación de focos nuclear positiva para TopBP1, otra proteína focos-localizada, en HCT116 (14,25 ± 5,12% para las células no tratadas frente a 95,24 ± 1,39% para las células tratadas Itu) y MEFs (13,08 ± 5,15% para las células no tratadas frente a 93,32 ± 2,70% para las células tratadas Itu) (Fig. 3A y 3B).
a. El tratamiento de HCT116 con 1 M de Itu durante 8 horas inducidos focos nucleares positivo para γH2AX, TopBP1, y Atm activado. tratamiento cafeína disminuye la formación de estos focos. HCT116 células fueron pretratadas con cafeína (5 mM) durante 1 hora y después se añadió Itu a los cultivos durante 8 horas más. Las células fueron el fijadas y teñidas de γH2AX, TopBP1, o p-ATM. B. Tratamiento de MEFs con 1 M de Itu durante 8 horas indujo focos nucleares positivo para γH2AX, TopBP1, y se activa Atm.
Itu Activa Atm
Además de focos positivos para γH2AX y TopBP1, el tratamiento Itu también dio lugar a focos nuclear positiva para p-ATM (10,13 ± 2,88% para las células no tratadas frente a 85,84 ± 4,63% para las células tratadas Itu) (fosforilación S1981, una indicación de la activación Atm) (Fig. 3A y 3B) [31], lo que indica que la UIT provoca daños en el ADN y activa Atm. En consonancia con esta observación, inducida por la UIT p-atm y γH2AX focos formación en las células HCT116 podría verse disminuida (abajo a 15.37 ± 1.15% y 9.00 ± 1.19%, respectivamente) mediante el tratamiento con cafeína, un inhibidor de la ATM y ATR (Fig. 3A ). Para fundamentar la determinación de que la UIT activa Atm, se utilizó western blot para analizar la fosforilación Atm S1981, así como la fosforilación mediada por Chk2 Atm. Aunque Atm se piensa que es solamente activado por ADN doble hundidos rompe [7], [31], [32], los estudios recientes mostraron que los análogos de nucleósidos también pueden activar Atm, así como sus vías descendentes [30], [33], [ ,,,0],34]. ATM es resultó ser localizados en las horquillas de replicación en punto muerto y puede ayudar a prevenir el colapso tenedor en las células [30], [33]. Se encontró que el tratamiento Itu llevó a una fosforilación dependiente del tiempo en S1981 de Atm, así como la fosforilación Chk2 en Thr68 en las células HCT116 (Fig. 4A). tratamiento UIT también dio lugar a la fosforilación de Ser15 de p53 (Fig. 4A), que se lleva a cabo por PIKKs también. Del mismo modo, la UIT podría estimular la fosforilación de p53 y la fosforilación Chk2 en MEFs (Fig. 4B). Estos resultados apoyan la conclusión de que la UIT provoca daños en el ADN y activa Atm.
A. HCT116 células fueron tratadas con 1 mM de la UIT para diferentes períodos de tiempo y activación de ATM, Chk2, y p53 se evaluó con Western blot utilizando anticuerpos fosfo-específicos. B. Las células MEFs fueron tratados con 1 mM de la UIT para diferentes períodos de tiempo y activación de ATM, Chk2, y p53 se evaluó con Western blot utilizando anticuerpos fosfo-específicos.
Itu llevó a S fase de extensión y G2 /M detención en un dependiente de p53 Manner
Muchos análogos de nucleósidos causan la detención del ciclo celular en la fase S con excepciones como 20-C-ciano-20-desoxi-1-β-D-arabino pentofuranosylcytosine (CNDAC), que causa la detención del ciclo celular en la fase G2 [4], [35]. La incorporación de análogos de nucleósidos termina el alargamiento de la cadena de ADN naciente y conduce a estancamiento de las horquillas de replicación. Para probar si Itu activa punto de control, se trataron p53 + /+ y p53 - HCT116 células con diferentes concentraciones de la UIT para las 24 o 48 horas - /. Se encontró que 24 hr-tratamiento con concentraciones más altas de la UIT llevó a un modesto aumento en el porcentaje de células en fase S, que fue acompañado con una disminución en el porcentaje de células en fase G1, sin alterar significativamente el porcentaje de fase G2 /M las células (Fig. 5A y 5B). Cuando las células se trataron con varias concentraciones de la UIT durante 48 horas, más células estaban en la fase G2, acompañado por una disminución en la fase G1, pero ningún cambio significativo en el porcentaje de células en fase S (Fig. 5C y 5D). Una explicación es que las células estaban atrapados inicialmente en la fase S, pero lograron pasar a través de la fase S y finalmente se bloquean en la fase G2 /M. Por lo tanto Itu activa principalmente el punto de control G2. Esto está en contraste con la mayoría de los análogos de nucleósidos, que conducen a la detención de la fase S del ciclo celular [4], y la radiación ionizante (IR), que induce la detención del ciclo celular en G1 y la fase G2 y se acompaña de una disminución de la fase S en células HCT116 [21]. En ausencia de p53, 24-hr-tratamiento dio lugar a un aumento inicial de la fase S en dosis más altas de la UIT (Fig. 5A y 5B), sin embargo, 48 horas después del tratamiento, la diferencia entre el control y las células tratadas se convirtió mínima (Fig . 5C y 5D), indicando que p53 - /- células HCT116, pero no el p53 células + /+ HCT116, se someten a S fase de la detención y que p53 - /- células lograron escapar de este punto de control. Por otra parte, p53 - /- células no mostraron una detención en la fase G2 (Fig. 5A y 5B). Estos resultados indican que la detención en la fase G2 inducida por la UIT requiere la presencia de p53.
A. HCT116 (p53 + /+ y p53 - /-) fueron tratados con diferentes concentraciones de la UIT para las 24 hrs. Se fijaron las células, se tiñeron con PI, y se analizaron con FACS. se demostró porcentaje de células en diferentes fases. B. representativos perfiles del ciclo celular de p53 + /+ y p53 - /- HCT116 en presencia de 2,5 M de Itu durante 24 hrs. C. HCT116 (p53 + /+ y p53 - /-) fueron tratados con diferentes concentraciones de la UIT para las 48 hrs. Se fijaron las células, se tiñeron con PI, y se analizaron con FACS. se demostró porcentaje de células en diferentes fases. D. representativos perfiles del ciclo celular de p53 + /+ y p53 - /- HCT116 en presencia de 1,0 M de la UIT para las 48 hrs
Itu induce dependiente de p53 y la muerte celular -independiente
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p53 tiene un papel proapoptótico y ha sido bien establecido que el daño del ADN induce la muerte celular principalmente a través de la vía Atm-p53. A continuación, prueba la citotoxicidad de la UIT en HCT116 y la implicación de p53 inducida por la UIT sobre regulación. Itu tratamiento condujo a la muerte celular en p53 células + /+ HCT116 (EC50 = 1.88 M), sin embargo, p53 - /- células HCT116 mostró resistencia a la muerte celular inducida por la UIT (EC50 = 7,8 M) (Fig 6A.), Lo que sugiere un papel importante para p53 en la mediación de la muerte celular inducida por la UIT. Por otra parte, la deficiencia de Atm, que se conoce para disminuir la inducción de p53, también inhibió la muerte inducida por la UIT celular en MEFs (Fig. 6B) [36], en consonancia con el papel bien aceptado para Atm en la promoción de la muerte celular bajo estrés genotóxico. El rescate menos que completa de la muerte celular por la deficiencia de p53 sugiere que la UIT podría poseer citotoxicidad que es independiente de p53, por ejemplo, mediante la inhibición de la señalización como Erk2 pro-supervivencia.
A. las células HCT116 (p53 + /+ y p53 - /-) fueron tratados con varias concentraciones de la UIT durante 48 horas y el número de células se mide por WST-1 de ensayo. * P & lt; 0,05 cuando se compararon p53 - células para p53 + /+ células - /. B. Atm + /+ y Atm - /- MEF se trataron con varias concentraciones de la UIT durante 48 horas y el número de células se midieron por WST-1 ensayo. * P & lt; 0,05 cuando Atm - /- células se compararon con células ATM + /+. C. tipo salvaje y p53 - /- células HCT116 se trataron con Itu durante 24 horas y el número de células se midió por WST-1 de ensayo. UIT no indujo la muerte celular cuando las células se cultivaron en 0,1% de suero o confluentes en las células de tipo salvaje HCT116. * P & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas
Muchos de los análogos de nucleósidos requieren la incorporación de ADN para ejecutar su efecto citotóxico.. A fin de probar el efecto citotóxico de la UIT sobre las células que no se dividen, cultivamos HCT116 o bien hasta la fase estacionaria o en presencia de 0,1% de suero durante 24 horas, con la mayoría de las células de estar en la fase G1. En estas condiciones, la UIT no pudo matar a las células (Fig. 6C), lo que sugiere que la UIT debe ser incorporado en el ADN con el fin de ejecutar su actividad citotóxica. Esto es coherente con nuestra observación de que la UIT metabolito está presente en el ADN genómico de la replicación de las células (Fig. 2B).
Sin embargo, la citometría de flujo ensayos no revelaron un aumento significativo de las células en la fase sub-G1, una indicación de las células apoptóticas, después de 24 o 48 horas de la UIT-tratamiento con diversas dosis (Fig. 5B y 5D). Esto está en contraste con MGCD0103 IR o CDAV (histona desacetilasas) inhibidor, lo que condujo a un aumento marcado en la fase sub-G1 en las células HCT116 [21], [37]. Por otra parte, no se observaron escaleras de ADN después del tratamiento de la UIT (datos no mostrados).