Extracto
Los flavonoides y derivados de flavonoides, que tienen significativa biológica y farmacológica actividades, incluyendo actividades antitumorales y anti-inflamatorias, han sido ampliamente utilizados en la asistencia sanitaria humana. Para diseñar un agente antitumoral flavonoide más eficaz, alteramos la columna vertebral flavonoide con las sustituciones de los grupos piperazina y metoxi para sintetizar un nuevo derivado de flavonoide, LZ-207. El efecto anticancerígeno de LZ-207 contra las células cancerosas de colon HCT116 y el mecanismo subyacente de este efecto fueron explorados en este estudio. Específicamente, LZ-207 exhibió efectos inhibidores sobre el crecimiento y la viabilidad en varias líneas celulares de cáncer de colon humano y la apoptosis inducida en células HCT116 tanto in vitro como in vivo. tratamiento LZ-207 también suprimió la translocación nuclear de NF-kappa B y la fosforilación de I? B y IKK /β de una manera dependiente de la dosis tanto en las células HCT116 y células humanas agudas de leucemia monocítica THP-1. Por otra parte, LZ-207 también reduce la secreción de la citoquina pro-inflamatoria interleuquina-6 (IL-6) en células THP-1 inducida por LPS, y este efecto se confirmó a nivel transcripcional. Además, LZ-207 inhibió significativamente la proliferación de células HCT116 que fue provocada por células THP-1 inducida por LPS en un sistema de co-cultivo. Estos hallazgos dilucidado algunos mecanismos moleculares potenciales para prevenir el cáncer de colon inflamación impulsada por el uso de la nueva síntesis de flavonoides LZ-207 y sugirieron la posibilidad de seguir desarrollando nuevos agentes terapéuticos derivados de flavonoides
Visto:. Sun J, Li F, Zhao Y, Zhao L, Qiao C, Li Z, et al. (2015) LZ-207, un flavonoide de nueva síntesis, induce la apoptosis y suprime la inflamación-relacionados con el cáncer de colon mediante la inhibición del NF-kB vía de señalización. PLoS ONE 10 (5): e0127282. doi: 10.1371 /journal.pone.0127282
Editor Académico: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, Francia |
Recibido: Diciembre 10, 2014; Aceptado: April 13, 2015; Publicado: 29 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Ciencia & amp Nacional; Proyecto de Tecnología Mayor (No.2012ZX09304-001), el Programa de Proyectos de Laboratorio Estatal Clave de medicinas naturales, Universidad Farmacéutica de China (Nº JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303 y SKLNMZZJQ201302, G140042), el Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (IRT1193), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 91029744)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, más de 600.000 personas mueren de cáncer colorrectal (CCR) y 1,25 millones de personas son diagnosticadas con esta enfermedad. La extirpación quirúrgica del cáncer por la operación es la terapia tradicional para todas las etapas de CRC; Sin embargo, muchos pacientes tienen tumores no resecables y llegan a desarrollar metástasis [1]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de CRC
La evidencia acumulada ha demostrado que la inflamación es un componente crítico de la progresión del tumor [2].; sitios de infección, irritación crónica e inflamación podrían ser áreas de alto riesgo de convertirse en cáncer. La estrecha relación entre las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) y el cáncer de colon se ha propuesto desde 1925 y sigue siendo un poderoso argumento para demostrar la relación entre la inflamación y el cáncer [3, 4]. Estudios previos han informado de que los factores pro-inflamatorios de los sistemas inmune innata y adaptativa, incluyendo IL-6 [5] y TNF-α [6], podría contribuir al desarrollo y crecimiento de la neoplasia de colon. NF-B, que es uno de los muchos objetivos de abajo TNF receptor 1 de activación, es probable que desempeñe un papel destacado en la tumorigénesis la colitis asociada a la activación aberrante debido a NF-kB se detectó en & gt; 50% de los tumores de colon y colitis asociada y los estudios del ratón [7]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren un papel de peso para la inflamación en la carcinogénesis de colon.
flavonoides naturales se han generalizado en la dieta humana y plantas, incluyen todos los cítricos, arándanos, el perejil, la cebolla, el té negro, té verde, rojo el vino y el plátano [8]. Estos compuestos son sustancias de bajo peso molecular que se basan en una estructura de tres anillos común con diferentes sustituciones [9]. Desde la paradoja francesa dejó la impresión de que gran parte de la menor incidencia de enfermedad cardiaca asociada con altos niveles de consumo de vino tinto del país de Francia, los flavonoides de vino tinto se han convertido en un foco de estudios de investigación del cáncer [10]. Las propiedades beneficiosas de los flavonoides potenciales incluyen antioxidantes, antiaterosclerótica, anti-inflamatorio, antitrombogénico, antiosteoporótico, y efectos antivirales [10]. Recientemente, los efectos antitumorales de los flavonoides también se han reconocido [11]. Muchos flavonoides, tales como quercetina [12], la silimarina [13] y luteolina [14], ejercen actividad antitumoral contra varias líneas celulares de cáncer, lo que sugiere que estos flavonoides son agentes prometedores para la prevención del cáncer y requieren estudio adicional. Los flavonoides son cromonas sustituidos con fenilo (derivados de benzopirano) que consisten en un esqueleto básico 15 carbonos (C6-C3-C6) (Fig 1A) con un cromano (C6-C3) núcleo (el anillo benzo A y el anillo heterocíclico C) y con un grupo fenilo (el anillo aromático B) normalmente sustituido en la posición 2 [15]. En los últimos años, wogonina, que es un flavonoide, ha recibido una atención creciente para sus actividades antitumorales en hepatoma [16], carcinoma de mama [17], cáncer gástrico [18], carcinoma cervical [19], y la leucemia [20, 21] . Muchos derivados wogonina se han sintetizado a tener mejor solubilidad en agua y farmacobilidad, y algunos de estos derivados sintetizados han mostrado posibles efectos antitumorales. Por ejemplo, AVG-202, que es un derivado de wogonina, induce la apoptosis en las células HepG2 carcinoma hepatocelular humano a través de la inducción de la vía de ROS-mitocondria [22]. AVG-202 también induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de carcinoma colorrectal HCT116 humano a través de su regulación de p53 y p21WAF1 /Cip1 [23]. Otro derivado wogonina, LW-214, tiene una potente actividad antitumoral en células humanas de cáncer de mama MCF-7 al desregular la Trx-1 y mediante la activación de la vía de JNK, en última instancia, la inducción de la apoptosis mediada por mitocondrias-[24]. En este trabajo, nos centramos en LZ-207, que es un flavonoide recién sintetizado con una estructura similar a la de wogonina. Un grupo metoxi en LZ-207 está sustituido en la posición 6 ', y una sustitución de piperazina se produce en el 7'-posición (véase la figura 1B). Estas sustituciones mejoran la solubilidad en agua (tabla 1) y farmacobilidad de LZ-207 en comparación con otros miembros de la familia de los flavonoides. Por lo tanto, estábamos interesados en examinar los efectos antitumorales de LZ-207 en el cáncer asociado con la colitis y en la revelación de las interacciones entre las células inflamatorias y células tumorales. En este trabajo, se estudiaron los efectos inhibidores de crecimiento de LZ-207 en células HCT116 y los efectos inhibitorios de la LZ-207 en los procesos inflamatorios en monocitos THP-1. También se examinaron los efectos inhibidores de LZ-207 sobre la respuesta inflamatoria provocada por el cultivo de células HCT116 con células inducidas por LPS de monocitos humanos THP-1.
estructura (A) química de la columna vertebral de flavona 15-carbono. (B) Estructura química de LZ-207 (C
26H
32N
2O
6, PM = 468,5421).
Materiales y Métodos
Reactivos
LZ-207 (pureza & gt; 99%), que se obtuvo de Dr. Zhiyu Li (Universidad Pharmaceutical china, china), se disolvió en DMSO a 0,1 M como solución madre y almacenado a -20 ° C. LZ-207 estaba recién diluida con medio de cultivo celular a diferentes concentraciones finales antes de cada experimento. La concentración final de DMSO no excediera de 0,1% y no tuvo efectos sobre el crecimiento y la diferenciación celular.
Los lipopolisacáridos (LPS), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Un V-FITC kit de detección de apoptosis anexina, un ensayo de cambio de movilidad eléctrica quimioluminiscente kit (EMSA), e IL-1β humana y la IL-6 ligado a enzimas (ELISA) kits fueron adquiridos de Bender MedSystems Co., Ltd. (Burlingame, CA, EE.UU.), Beyotime Instituto de Biotecnología (Nanjing, china), y KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, china), respectivamente.
anticuerpo β-actina primaria se obtuvo de Boster Tecnología Biológica, Ltd . (Wuhan, china) y se usó en una dilución 1: 20.000. Primary Akt, Bax, caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, ERK, I? B?, NF-kB, JNK, p38, p-Akt, p-ERK, p-JNK, anticuerpos p-p38 se obtuvieron de Santa Cruz biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y se utiliza todo a una dilución de 1: 500. Bcl-2 Primaria, IKK /β, PARP, p-IKK /β, anticuerpos p-I? B? Se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE.UU.) y fueron utilizados a una dilución 1: 1000. IRDye anticuerpos secundarios conjugados 800 se obtuvieron a partir de Rockland, Inc. (Filadelfia, PA, EE.UU.) y se utilizan en una proporción 1:. Dilución de 15.000
Cultivo de células
células de carcinoma de colon humano HCT116, humana células colorrectales SW1116 cáncer y HT29, células HUVEC endoteliales de la vena umbilical humana, normal fibroblastos de pulmón humano MRC5 y células humanas agudas de leucemia monocítica THP-1 se obtuvieron del banco de células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). HCT116, las células HT29, SW1116, HUVEC, MRC5 y THP-1 se cultivaron en cualquier medio 5A de McCoy o medio DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation, Nueva York, EE.UU.). Todos los medios se complementaron con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, EE.UU.), 100 U /bencilpenicilina ml, y 100 mg /ml de estreptomicina a pH 7,4, y las células se mantuvieron en un CO
2 incubadora (Thermo Forma, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, EE.UU.) con una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C [25, 26].
la viabilidad celular de ensayo
las células SW1116, las células HT29, células HCT116, las células HUVEC, células MRC5 y células THP-1 se sembraron en placas de 96 pocillos con 100 l del medio apropiado a una densidad óptima. Las células se trataron con diferentes concentraciones de LZ-207 y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 para 24, 48 y 72 h. Posteriormente, se añadieron 20 l de solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 para otro 4 h. A continuación, los sobrenadantes se desecharon, y se añadieron 100 l de DMSO a cada pocillo. Las placas se agitaron durante 2 min para asegurar la solubilidad total de los cristales de formazán y se determinó la viabilidad celular basado en la conversión de MTT mitocondrial en formazán. La absorbancia (A) se midió a 570 nm usando un lector de microplacas universal (EL800, BioTek Instruments Inc.). La relación de inhibición (%) y la tasa de supervivencia (%) se calcularon utilizando las siguientes ecuaciones:
A
Tratada y A
de control eran los valores de absorbancia promedio de tres experimentos paralelos del tratado y de control grupos, respectivamente.
el IC
50, que es la concentración que provocó una inhibición del 50% de la viabilidad celular, se calculó utilizando el método logit [24].
ensayo de tinción con DAPI
Los núcleos celulares se visualizaron con tinción DAPI, que emite fluorescencia azul tras la unión a AT regiones de ADN, para detectar cualquier evidencia morfológica de apoptosis. Después del tratamiento LZ-207 durante 24 h, las células HCT116 se fijaron con frío 4% de paraformaldehído durante 30 min, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y luego se permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 durante 20 min a temperatura ambiente. Después de ser lavado dos veces con PBS, las células se incubaron con DAPI (1 mg /ml) durante 10 min y después se observaron mediante microscopía de fluorescencia (Olympus, Japón) con una longitud de onda pico de excitación de 340 nm [27].
Anexina V /PI doble tinción ensayo
muerte de células tumorales mediada por apoptosis se examinó utilizando un método de doble tinción con un Anexina V marcada con FITC /PI Kit de detección de apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. células HCT116 en medio 5A de McCoy que contenía 10% de FBS se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densidad cómodo para 24 h. Después del tratamiento LZ-207 (5, 10, o 20 mM) durante otras 24 h, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS frío, y luego se resuspendieron en 500 l de tampón de unión. A continuación, 5 l de anexina V y 5 l de PI se añadieron sucesivamente a cada tubo, se mezcló suavemente y se mantuvo en hielo durante 10 min en la oscuridad. adquisición y análisis de datos se realizaron con un flujo Becton Dickinson FACS Calibur citómetro con el software FlowJo 7 con excitación /emisión a 488/530 nm. La sección inferior izquierda de la fluorocytograms (An-, PI) representa las células normales, la sección de la parte inferior derecha de las fluorocytograms (An +, PI-) representa los primeros y mediados de apoptosis de células, y la sección superior derecha de las fluorocytograms (An +, PI +) representa células apoptóticas tarde [28, 29].
ΔΨm posibles cambios) mitocondrial transmembrana potencial (ΔΨm) evaluación
transmembrana mitocondrial (podrían indicarse por JC-1, un colorante fluorescente de Kit keygen JC-1 Detección de apoptosis (República Popular china). Después del tratamiento LZ-207 (5, 10, o 20 mM) durante 24 h, se recogieron las células HCT116, se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón de trabajo JC-1. Después de incubar a 37 ° C con 5% de CO
2 de 30 min, las células se lavaron dos veces con tampón de incubación y se analizaron por citometría de flujo y software FlowJo 7 con la configuración de FL1 (FITC, verde) y FL2 (PI, rojo ) [30].
Preparación de fracciones mitocondriales y citosólicas
el mitocondrial y fracciones citosólicas a partir de células se prepararon utilizando keygen kit de aislamiento de las mitocondrias (china) según las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento LZ-207 (5, 10, o 20 mM) durante 24 h, se recogieron las células HCT116, se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón de lisis frío, y se homogeneizaron en agua con hielo con una mano de mortero ajustada. A continuación, las células se transfirieron a tampón de medio y se centrifugaron durante 10 min a 4 ° C (1,200 g). Se recogió el sobrenadante y se centrifuga de nuevo durante 10 min a 4 ° C (7,000 g) para obtener la mitocondria (pellet) y fracciones de citosol (sobrenadante). Mitocondria y citosol fracciones de células HCT116 fueron almacenadas a -80 ° C [31].
inmunofluorescencia
HCT116 células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos durante 24 horas y se trataron con LZ -207 (5, 10, o 20 mM) con o sin LPS (10 mg /ml) durante otras 24 h. Entonces, las células se enjuagaron tres veces con PBS durante 5 min cada uno, se fijaron con frío 4% de paraformaldehído durante 30 min, se enjuagaron tres veces con PBS durante 5 min cada uno, permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 durante 20 minutos, se bloquearon con 5 % de BSA durante 60 min y se incubaron con anticuerpo NF-kappa B primario (diluido 1: 200) durante la noche a 4 ° C. Después de enjuagar tres veces con PBS que contenía 0,01% de Tween 80 durante 5 minutos cada uno, las células se tiñeron con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (1: 100) a 37 ° C durante 1 h en la oscuridad. Entonces, las células se enjuagaron tres veces con PBS durante 5 min cada uno y se tiñeron con DAPI. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio confocal Olympus FV1000 [32].
Preparación de lisados de células enteras y citosólica y extractos nucleares
resumen, las células se cultivaron hasta aproximadamente 80-90% de confluencia y tratado con LZ-207 a las concentraciones indicadas, con o sin LPS (10 mg /ml) durante 24 h. Los lisados de células enteras se prepararon como se describe anteriormente [33]. extractos de proteínas nucleares y citosólicas se prepararon utilizando un Kit Nuclear /citosol fraccionamiento de acuerdo con el protocolo del fabricante modificado a continuación. Después de lavar dos veces con PBS, las células se recogieron en tubos con PBS raspando con un raspador de células y se centrifugaron durante 5 min a 4 ° C (600 g). Luego, se eliminó el sobrenadante, se resuspendieron suavemente el sedimento celular con tampón de extracción citosólica y se incubó esta suspensión en hielo durante 15 min, seguido por una centrifugación de 15 min a 4 ° C (14,000 g). El sobrenadante (fracción citoplásmica) se transfirió cuidadosamente a un tubo de pre-refrigerado limpio y se almacenó a -80 ° C para su uso posterior. Después, se añadió el mismo volumen de tampón de extracción citosólico al sedimento de nuevo, y los mismos pasos se repitieron como antes, excepto el sobrenadante se descartó pasado. El sedimento nuclear se resuspendió en tampón de extracción nuclear, mantuvo en hielo durante 30 min, y después se centrifugó durante 15 min a 4 ° C (12,000 g). El sobrenadante (extracto de proteína nuclear) se transfirió cuidadosamente a un tubo limpio, previamente enfriada y se almacenó a -80 ° C [33].
EMSA
se extrajeron proteínas nucleares de células HCT116 como se describe previamente. EMSA se realizó usando un ensayo de desplazamiento en gel no radiactivo (marcado con biotina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las sondas de oligonucleótidos se sintetizaron, hibridaron, y etiquetados con un extremo 3 'kit de marcaje de ADN con biotina (Pierce). Siguiendo el protocolo del fabricante, los complejos ADN-proteína preparados se resolvieron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% en un tampón 0,5 x Tris-borato-EDTA a 380 mA durante 1 h y después se transfirió a una membrana de nylon. Por último, el desplazamiento en el gel de ADN marcado con biotina se visualizó mediante quimioluminiscencia utilizando un sistema de infrarrojos Bio-Rad y un quimioluminiscente EMSA kit [34].
Western El análisis de transferencia
los extractos celulares totales y citosólica y extractos nucleares de células tratadas se prepararon como se ha descrito anteriormente, y la concentración de proteína se midió usando un ensayo de BCA con un Varioskan multimodo microplaca espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU.) a 562 nm. Se prepararon cantidades iguales de muestras de proteína, separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa membranas (NC). Las membranas se bloquearon con 1% de BSA en PBS a 37 ° C durante 1 h y después se incubaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con anticuerpos secundarios IRDye 800 conjugados durante 1 h a 37 ° C. La detección se realizó utilizando el sistema de infrarrojos Odyssey Imaging (LI-COR Inc., Lincoln, NE, EE.UU.). Todos los blots fueron despojados y reprobed con anticuerpo policlonal anti-β-actina para determinar la carga igual de proteínas [35].
citoquinas de cuantificación por ELISA
Humanos IL-6 y IL-1ß kits de ELISA se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para cuantificar la expresión de citoquinas secretadas IL-6 y IL-1ß en los sobrenadantes de las células THP-1 tratadas. Las células THP-1 se trataron con LZ-207 (5, 10, o 20 mM) con o sin LPS (10 mg /ml). Cada experimento fue repetido tres veces. Los niveles de citoquinas se expresan en pg /ml. Las citocinas no se detectaron en el medio fresco usado para cultivar estas células [36].
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) de ensayo
ARN total a partir de células THP-1 tratadas se extrajo utilizando un método de fenol /cloroformo con el reactivo TRIzol (Invitrogen). La transcripción inversa (RT) se realizó usando cantidades iguales de ARNm, y cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) se realizó siguiendo el protocolo del kit Takara (Takara, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japón). ADNc también se recogió por cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que se realizó con un Chromo4instrument (Bio-Rad, Berkeley, CA, EE.UU.) con SYBR Green Mix Master (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). Se determinó la cantidad relativa de ARNm diana utilizando el método comparativa ciclo umbral (Ct) mediante la normalización de los valores de ARNm diana Ct a esos valores de β-actina (△ Ct) [37]. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron los siguientes:
IL-6-sentido: 5'-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3 ';
IL-6-antisentido: 5'-TACATTTGCCGAAGAGCC-3';
IL-1β-sentido: 5'-AGGCTGCTCTGGGATTC-3 ';
IL-1β-antisentido: 5'-GCCACAACAACTGACGC-3';
β-actina-sentido: 5'-CTGTCCCTGTATGCCTC T-3 ';
β-actina-antisentido: 5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'
Co-cultivo de células HCT116 con células THP-1 |
HCT116 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a 4 x 10
4 células por pocillo y se dejaron crecer hasta aproximadamente el 80% de confluencia. THP-1 células se recogieron por centrifugación (600 g durante 10 min, se lavaron, y se resuspendieron a una concentración final de 2 x 10
5 células /ml) y se añadieron a las células HCT116. Entonces, el sistema de co-cultivo se dejó sin tratar, activados con LPS, o tratado con LZ-207 junto con LPS. Después de 24 h, se detuvo el sistema de co-cultivo, y se eliminaron los medios de cultivo celular. Las células HCT116 se lavaron dos veces con PBS frío (pH = 7,4), y la viabilidad celular se midió usando ensayos de MTT como se describió anteriormente [38, 39].
efectos antitumorales sobre HCT116 xenoinjertos de ratones desnudos
el experimento con animales se realizó sobre la base del procedimiento de operación estándar establecido por la Administración de Drogas y Alimentos de Estado (SFDA) en china. Atímicos Balb /c ratones desnudos, femenino, 35-42 días de edad con un peso de entre 18 y 22 g se obtuvieron del Instituto de Materia Médica de Shanghai, Academia China de Ciencias. Los ratones desnudos libres de patógenos específicos se suscitaron en un ambiente controlado (23 ± 2 ° C, 55 ± 5% de humedad, luz 12h + 12h oscuro /día) y se alimentaron con comida estándar de laboratorio y agua. 1 × 10
6 células HCT116 se inyectaron en la axila derecha de cada ratones desnudos para establecer el modelo animal. Después de 12 días, se utilizaron los calibradores micrométricos para determinar el tamaño del tumor. ratones desnudos con el volumen tumoral similares fueron seleccionados y separados al azar en 5 grupos: 0,9% del grupo de control de solución salina (12 ratones desnudos), 5-FU 30 mg grupo /kg positivo (6 ratones desnudos), LZ-207 20 mg /grupo kg ( 6 ratones desnudos), LZ-207 10 mg /kg grupo (6 ratones desnudos) y LZ-207 10 mg grupo kg /(6 ratones desnudos). Los ratones nude recibieron inyección intravenosa cada tres días. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron también cada tres días. Después del tratamiento de 21 días, todos los ratones desnudos se sacrificaron, se recogió sangre periférica; tumores se retiraron y se ponderan; corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y riñones se separaron. El volumen tumoral (TV) se calculó mediante la siguiente ecuación: TV (mm
3) = D /2 × d
2, donde D y D son los más largos y los diámetros más cortos del tumor, respectivamente [27].
el análisis estadístico
Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD) a partir de experimentos realizados por triplicado de una manera paralela, a menos que se indique lo contrario. Todas las comparaciones de datos se hicieron utilizando de Student
t-pruebas
y se consideraron estadísticamente significativas a *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P Hotel & lt; 0.01.
Resultados
LZ-207 inhibe se utilizaron viabilidad de células tumorales
ensayos de MTT para examinar el efecto de varias concentraciones de LZ-207 sobre la viabilidad celular de las líneas celulares tumorales (SW1116, HT29 y HCT116), líneas celulares benignos (células HUVEC y MRC5) y THP-1 células. Después de un tratamiento de 48 h, LZ-207 inhibe eficazmente la viabilidad de SW1116, HT29 y HCT116 células (Figura 2A), con IC
50 valores de 25,1 ± 0,86, 39,5 ± 1,13 y 13,2 ± 1,49 m, respectivamente ( Fig 2B). Como se muestra en la figura 2C, las células HCT116 mostraron sensibilidad tiempo y dependiente de la dosis para LZ-207. El IC
50 valores de 24, 48 y 72 h LZ-207 tratamientos en células HCT116 fueron 19,81 ± 0,75, 14,58 ± 0,42, y 9,32 ± 0,50 mM, respectivamente (Fig 2D). Por lo tanto, la línea celular HCT116 se eligió para todos los experimentos posteriores utilizando 5, 10 y 20 mu M LZ-207 tratamientos para 24 h. Tres dosis de LZ-207 también mostraron ningún efecto evidente sobre la tasa de supervivencia de las células benignas y las células THP-1 que se utiliza en el sistema de co-cultivo por debajo de
.
(A) El efecto inhibidor de un 48 h de tratamiento con LZ-207 en SW1116, HT29 y las células HCT116. (B) IC
50 valores de un tratamiento de 48 h con células HCT116 LZ-207 en SW1116, HT29 y. células HCT116 (C) se trataron con diferentes concentraciones de LZ-207 para 24, 48 y 72 h. (D) IC
50 valores de 24, 48 y 72 h LZ-207 tratamientos en células HCT116. (E) La tasa de supervivencia de un tratamiento de 48 h con LZ-207 en HUVEC y MRC5 células. (F) La tasa de supervivencia de un tratamiento de 48 h con LZ-207 en las células THP-1. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3).
LZ-207 induce la apoptosis en las células HCT116
La morfología de las células HCT116 se vio gravemente alterada después de 24 h de tratamiento con LZ-207. Para examinar si LZ-207 apoptosis en las células HCT116 inducido, se utilizó la tinción DAPI para detectar los cambios nucleares. La microscopía de fluorescencia mostró que las células de control se tiñeron uniformemente con fluorescencia azul, lo que demuestra la distribución homogénea típica de la cromatina en el nucleolo. Por el contrario, las células HCT116 tratadas con LZ-207 emite una fluorescencia más brillante, lo que es indicativo de apoptosis temprana debido a la condensación de la cromatina y picnosis nucleolo (Fig 3A).
células HCT116 se trataron con 5, 10 o 20 M LZ-207 durante 24 h. No se observaron cambios (A) morfológicas del nucléolo mediante microscopía de fluorescencia (400 ×). Las células se examinaron para la presencia de cuerpos apoptóticos y picnosis nuclear. (B) Anexina V /PI ensayo de doble tinción de células HCT116. El
Y
eje x muestra la población PI-etiquetados, y el
X
eje x muestra las células de Anexina V marcada con FITC-positivo. (C) Las tasas de apoptosis de las células HCT116 inducidos por la LZ-207. (D) Análisis de transferencia de Western de PARP, Bax, Bcl-2, procaspasa-3, procaspasa 9, y procaspasa-8 en las células HCT116 tratadas con LZ-207. análisis (E-G) Densitométricas representa el pliegue del cambio relativo en la expresión de la proteína. (H-I) El cambio de ΔΨm se detectó mediante el uso de JC-1 tinción y se analizaron mediante citometría de flujo en LZ-207 células HCT116 tratados. (J-K) Western blot de citocromo c en la mitocondria y el citosol en LZ-207 células HCT116 tratados. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, una diferencia significativa en comparación con el control.
apoptosis inducida por LZ-207 en las células HCT116 se confirmó adicionalmente mediante ensayos /PI tinción con anexina V. Tras el tratamiento con 5, 10, o 20 mM LZ-207 durante 24 h, las tasas de apoptosis temprana en el control y las células HCT116 tratadas fueron 4,35, 10,21, 14,76, y 22,14%, respectivamente, y las tasas de apoptosis finales fueron 3,76, 9,75, 21,78, y 26,79%, respectivamente (figura 3B y 3C). Estos resultados demostraron que el tratamiento LZ-207 induce tanto temprano y tarde apoptosis de una manera dependiente de la concentración.
transferencias de Western mostró que el nivel de proteína de PARP escindido aumentó con concentraciones crecientes de LZ-207, mientras que el nivel de proteínas de PARP intacto disminuye, lo que confirma la capacidad de LZ-207 para inducir la apoptosis como parte de su efecto antitumoral en las células HCT116 (Fig 3D y 3E). También se encontró que Bcl-2 expresión disminuyó después de las células HCT116 se trataron con LZ-207 durante 24 h, mientras que la expresión Bax aumentó, lo que lleva a un aumento significativo en la relación de Bax /Bcl-2 (Fig 3F). Hemos detectado además que la expresión procaspasa-3 y procaspasa-9 disminuyó significativamente después del tratamiento LZ-207, lo que indica que esta vía mitocondrial puede estar implicado en la apoptosis inducida por LZ-207 (Fig 3G). Durante la apoptosis mediada por mitocondrias, la despolarización del potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm) acompañado por la liberación de citocromo c de la mitocondria en el citosol, lo que desencadena una apoptosis dependiente de caspasa. Hubo un aumento obvio en la fluorescencia verde de monómeros JC-1 en LZ-207 células HCT116 tratadas, lo que indica la despolarización del potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm) (Fig 3H y 3I). También se encontró que la expresión de Cyt-c disminuyó en la mitocondria mientras que el aumento en el citosol en LZ-207 células HCT116 tratadas (Fig 3J y 3K). Mientras tanto, la ligera degradación de la procaspasa-8 sugirió que una vía de la apoptosis extrínseca también puede correlacionar con la apoptosis inducida por la LZ-207 (Figura 3G).
Efecto inhibidor de LZ-207 en LPS inducido por p65 NF-kB la activación en las células HCT116
la familia NF-kappa B de factores de transcripción regula la expresión de múltiples genes, incluidos los genes asociados con la inflamación. Por lo tanto, la desregulación de la señalización de NF-kappa B es un marcador de desarrollo del cáncer. El uso de microscopía de inmunofluorescencia confocal (Fig 4A), se observó que el tratamiento LZ-207 inhibe NF-kB p65 translocación nuclear en las células HCT116. Se cuantificó la cantidad de p65 NF-kappa B en la fracción nuclear de células HCT116 tratadas con LZ-207 a través de análisis de transferencia de Western, la expresión de nuclear NF-kappa B aumentó con 10 mg /tratamiento LPS ml en células HCT116, como se muestra en la figura 4B y 4C; sin embargo, esta translocación nuclear de NF-kappa B inducida por LPS fue suprimida por el tratamiento LZ-207. El uso de ensayos EMSA, también hemos demostrado que LZ-207 suprime inducida por LPS actividad de unión a ADN de NF-KB en una forma dependiente de la dosis en las células HCT116 (Fig 4D).
células HCT116 se trataron con o sin LZ- 207 en presencia de LPS durante 1 h. Después de aislar los extractos nucleares y citoplasmáticas, NF-kB p65 niveles (A) se determinaron por inmunofluorescencia, y (B-C) NF-kB translocación p65 se midió por medio de transferencia Western. (D) LZ-207 suprime inducida por LPS actividad de unión a ADN de NF-kB de una manera dependiente de la concentración, tal como se detectó mediante ensayo de EMSA. (E-H) análisis de transferencia de Western de la fosforilación de I? B y IKK en las células HCT116 tratadas con o sin LZ-207 en presencia de LPS durante 1 h. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3). *
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Debido a NF-kB activación da como resultado de la rápida fosforilación, ubiquitinación y degradación proteolítica de I? B en última instancia, se analizó el efecto de la LZ-207 en la expresión de I? B fosforilada en células HCT116 inducida por LPS a través de Western blot. LZ-207 inhibió significativamente la fosforilación de I? B? En comparación con el control, pero no tuvo efecto sobre la expresión de proteínas I? B? (Fig 4E y 4F). Debido a la degradación de I? B depende principalmente de la activación de IKK, al lado, se analizó el efecto de la LZ-207 sobre la activación de IKK y encontramos que LZ-207 contención significativa de LPS inducido por IKK /fosforilación de β en las células HCT116 (Figura 4G y 4H).
LZ-207 inhibe las vías de señalización aguas arriba de NF-kB en las células HCT116
las células detectan los cambios de su entorno a través de la activación de las vías de transducción de señales bioquímicas que los programas directos que median la proliferación y la supervivencia. La familia mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) y las vías de señalización de Akt pueden regular estos procesos celulares fundamentales a través de la inducción de la activación de NF-kB IKK-dependiente. Se examinó la expresión de los factores corriente arriba de la activación de NF-kappa B, incluyendo MAPK p38, ERK1 /2, JNK y Akt, después del tratamiento LZ-207 en células HCT116 inducida por LPS. Como se muestra en la figura 5A y 5B, LZ-207 inhibe la fosforilación inducida por LPS de MAPK p38, ERK1 /2, JNK y Akt, mientras que los niveles de expresión de p38 MAPK, ERK1 /2, JNK, y Akt no se cambiaron. < β-actina se utilizó como control interno.