Extracto
Antecedentes
La apolipoproteína A-II (ApoA- II) se regula hacia abajo en el suero de páncreas de adenocarcinoma ductal (PDAC) de los pacientes, lo que puede ser debido a aumentar la utilización de alta densidad de lipoproteínas de lípidos (HDL) por el tejido de cáncer de páncreas. Este estudio examinó la influencia de la ApoA-II exógeno en la absorción de lípidos y el crecimiento celular en el cáncer de páncreas (PC) tanto
in vitro y Hoteles en
in vivo.
Métodos
Cryo microscopía electrónica de transmisión (TEM) examinó la influencia de la ApoA-II en la morfología de la emulsión SMOFlipid. La influencia de la ApoA-II sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer se determinó por incubación de las mismas con lípidos +/- ApoA-II y el anticuerpo anti-SR-B1. Lípidos fue marcado con el fluoróforo, DiD, para rastrear la absorción de lípidos de las células cancerosas
in vitro fotos: por microscopía confocal y
in vivo Hoteles en PDAC paciente xenoinjertos de tumores derivados (PDXT) por imágenes de fluorescencia. tipo-1 Scavenger receptor de clase B (SR-B1) expresión en líneas celulares de PDAC y en PDAC PDXT se midió por transferencia de Western e inmunohistoquímica, respectivamente.
Resultados
ApoA-II convierte espontáneamente lípidos emulsión en muy pequeña rHDL unilamelar como vesículas (rHDL /a-II) y la absorción de lípidos mejorada en PANC-1, CFPAC-1 y del tumor primario células como se muestra por microscopía confocal. la expresión de SR-B1 fue de 13,2, 10,6, 3,1 y 2,3 veces más alta en las líneas celulares que la línea normal de páncreas celular (HPDE6) y 3,7 veces mayor en el tejido PDAC que en el páncreas normal, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 y BxPC3 . ApoA-II más lípidos aumentaron significativamente la absorción de esfingosina marcada y el crecimiento celular en células BxPC3 promovido que fue inhibida por el anticuerpo anti SR-B1 PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 y. Además, ApoA-II aumentó la absorción de lípidos en xenoinjertos de 3,4 veces.
Conclusión
Nuestros datos sugieren que la ApoA-II mejorar la orientación potencial de lípidos en el cáncer de páncreas que puede tener de formación de imágenes y de drogas potencialidades de entrega
Visto: SM. Julovi, Xue A, Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) La apolipoproteína A-II Plus emulsión lipídica mejorar el crecimiento de la célula a través de SR-B1 y Target cáncer pancreático
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10.1371 /journal.pone.0151475
Editor: Yingmei Feng, Beijing clave Laboratorio de Prevención e Investigación de la Diabetes, CHINA
Recibido: 3 de septiembre de 2015; Aceptado: 29 de febrero de 2016; Publicado: 22 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Julovi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos se encuentran dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación: Parte de este estudio fue presentado y premiado como mejor poster en New Horizons 2014 y la Junta de Investigación Científica, el 17-19 de noviembre de 2014. este estudio no tiene publicado en otra parte o no esté siendo considerada para una publicación. El estudio fue apoyado por la fundación CanSur y en parte por el Fondo de Investigación Enseñanza Ramsay, pero no tienen ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. afiliación comercial de los autores en CSIRO no juega ningún papel en el estudio y no tienen ningún intereses en competencia en materia de empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo y los productos comercializados
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses. afiliación comercial de los autores en CSIRO no juega ningún papel en el estudio y no tienen ningún intereses en competencia en materia de empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo y los productos comercializados.
Introducción
se encontró apolipoproteína a-II en suero (ApoA-II) a deprimirse en pacientes con cáncer de páncreas y fue un biomarcador potencial de diagnóstico [1]. Este trabajo ha sido confirmada por Honda y colegas [2] y otros [3]. ApoA-II es un componente de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en que tiene un papel importante en la dirección del destino del metabolismo de los lípidos en la HDL. El papel más importante para HDL es la entrega de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado donde se metaboliza en sales biliares o se excreta a la bilis. El tipo 1 del receptor scavenger clase B (SR-B1) es frecuente en los hepatocitos y atrae HDL donde se endocitosis [4, 5] o difusa del lípido [6, 7] en los hepatocitos.
SR-B1 es un receptor multi-ligando y altamente expresado en una variedad de células tumorales incluyendo próstata, mama, colorrectal y de células de cáncer de ovario [8]. La lipoproteína en la superficie de HDL se une a SR-B1 y entrega su lípidos en la célula a través de un poro formado por SR-B1 el aumento de la absorción de éster de HDL-colesterol (CE) [9], un nutriente esencial para la proliferación celular maligna y metástasis [10, 11]. El treinta por ciento de HDL está asociado con la ApoA-II que se cree que para que el HDL menor que con ApoA-I solo y hace que el HDL /ApoA-II menos atraídos por el hepática SR-B1 [12]. Además, ApoA-II mantiene los niveles de HDL en parte por la inhibición de la lipasa hepática [13]. Estos resultados en un tiempo de circulación relativamente más largo para HDL /ApoA-II. ApoA-II altera la unión de HDL a SR-B1 en diferentes tejidos y es particularmente atraído al tejido steroidogenic [14] en el que el colesterol se utiliza para la síntesis de hormonas pero que crecen rápidamente las células del cáncer también requieren colesterol para las membranas celulares [15]. Las células cancerosas tienen un aumento de la expresión de SR-B1in relación con la expresión de sus células no malignas de origen [16, 17] y es posible que esto resulta en aumento de la captación de HDL por el tejido de cáncer que es una explicación para la reducción en el suero de ApoA-II en los casos PDAC [1-3]. Curiosamente cáncer de páncreas no se acumula fludesoxiglucosa (FDG) con suficiente fuerza para ser fiable como un agente de contraste para la tomografía de emisión de positrones (PET) [18], que probablemente indica que el cáncer de páncreas tiene una preferencia por los lípidos como su fuente de calorías principal [19]. Si los lípidos es la principal fuente de energía para el tejido de cáncer de páncreas es posible que el HDL es una fuente importante de este lípido. El metabolismo energético de las células está implicado en la carcinogénesis complejo [20, 21]. El papel del metabolismo del colesterol en el proceso de la carcinogénesis También se ha informado [22 a 24] .Cancer y otras células que proliferan rápidamente requieren colesterol y otros componentes de la membrana para optimizar el crecimiento [25]. HDLs han sido implicados en la prestación de colesterol en algunos tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama [26], cáncer de ovario [8], tumores suprarrenales [27] y el cáncer de próstata [28]. Es probable que el cáncer de páncreas es también ávidamente utilsing HDL
.
La hipótesis puesta a prueba en este trabajo es que la ApoA-II acelerará la absorción de lípidos en el tejido de cáncer de páncreas y por lo tanto aumentará el crecimiento celular. Además, la hipótesis de que el nivel de expresión de SR-B1 se correlaciona con la captación de lípidos por las células de cáncer de páncreas y será mayor que la del tejido normal.
Materiales y Métodos
Cell cultura y
PANC-1, MIAPaCa-2, y BxPC3-1 CFPAC líneas celulares de cáncer de páncreas fueron regalos de Prof. Barry Allen (St George hospital de, NSW, Australia), y normal del epitelio ductal pancreático humano (HPDE6) las células [29] eran del Dr. Chris Scarlett (School of Environmental & amp; Ciencias de la vida, Universidad de Newcastle, NSW, Australia). A549 línea celular de cáncer de pulmón, las líneas celulares de cáncer de mama T47D y MCF7 fueron amablemente proporcionados por el profesor Ross Davey (Instituto Kolling de Investigación Médica, Hospital Royal North Shore, Nueva Gales del Sur, Australia). línea celular de cáncer de próstata PC3 fue proporcionado amablemente por el Prof. Qihan Dong (Escuela Clínico Central, Instituto Bosch, Universidad de Sydney, NSW, Australia). Excepto línea celular HPDE6, todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC. Las líneas celulares se tipificaron por repeticiones cortas en tándem de perfiles y que se ajustaban a las normas de referencia ATCC (CellBank, Westmead, NSW, Australia). BxPC3, CFPAC-1, A549, líneas de células T47D y MCF7 fueron cultivadas en RPMI 1640, PANC-1 y MIAPaCa-2 se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y las células de próstata PC3 se cultivaron en F-12K (Gibco, BRL) con 10% de SFB, que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; ICN, Aurora, OH) en 75 cm
2 frascos a 37 ° C en un 5% humidificado de CO
2 atmósfera. Las células fueron cultivadas en HPDE6 (KSF) medio de queratinocitos libre de suero complementado por el factor de crecimiento epidérmico y extracto de pituitaria bovina (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).
El cultivo primario
Humano especímenes de tumores pancreáticos se obtuvieron en el hospital Royal North Shore (Sydney, Australia), con su consentimiento informado por escrito, siguiendo los protocolos aprobados por el Comité del Norte de Sydney área básica de salud humana Ética de la Investigación (NSLHD HREC) (número de protocolo: 0909-227M, Sydney , Australia). cultivos de células de tumores primarios fueron establecidos por el crecimiento de explantes de fragmentos pequeños (mm) ≈1 disecados de los tejidos tumorales PDAC, colocadas en DMEM (pH 7,4) suplementado con FBS inactivado por calor al 10% con 50 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. Los cultivos se utilizan después del paso 3 para evitar la contaminación residual por los macrófagos [30]. Se recogieron todas las culturas en condiciones de crecimiento y suero idénticas. Utilizamos las células privadas de suero de 24 h para los experimentos para evitar la expresión del gen precoz inducida por el suero.
Etiquetado de SMOF lipídica con el fluoróforo
DiD
La emulsión de lípidos SMOF que contiene aceite de soja, de cadena media triglicéridos, aceite de oliva y aceite de pescado {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, y se utiliza para la nutrición intravenosa, se utilizó en los experimentos después de marcar con un fluoróforo trazador lipófilo 0,05%, DID , (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, CA). La emulsión de lípidos SMOF se secó en un evaporador rotatorio, se liofiliza antes de mezclar bien con lípidos hizo en una solución etanólica. El etanol se evaporó y, finalmente, la película de lípido residual se rehidrata por adición de agua estéril Baxter para hacer la concentración final a 20% SMOFlipid, seguido por agitación dura y 30 minutos de ultrasonidos homogeneización del baño.
Recogida y purificación de ApoA -II
ApoA-II se purificó como se ha descrito en estudios previos [31-33]. HDLs se ultracentrifugally aisladas de muestras mezcladas de plasma humano normal (1,063 & lt; d & lt; 1,21 g /ml) y delipidated. El apoHDL resultante se sometió a cromatografía en una columna de flujo rápido de Q-Speharose sujetarse a un sistema Akta FPLC (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, Reino Unido). Las fracciones que contienen apoA-II se combinaron y pureza se comprobó mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie, que reveló una única banda. Las muestras combinadas se liofilizaron, se reconstituye con 3 M hidrocloruro de guanidina /mM Tris 10 /0,01% (p /v) EDTA-Na
2, y se dializó en PBS libre de endotoxina antes de su uso.
Cell ensayo de proliferación de
la proliferación celular se lleva a cabo en diferentes líneas de células y se cuantificó mediante el ensayo de cristal violeta como se describe en anteriormente [34], donde el ensayo de MTT no es adecuado en las células tratadas de lípidos [35]. 4 × 10
4 células /ml de células fueron sembradas en noventa y seis microplacas, para todas las líneas celulares excepto PANC-1 y MIAPaCa-2 donde 2x10
se sembraron 4 células /ml a un volumen final de 200μl. células libre de suero se trataron con o sin SMOFlipid (lípido) solo, ApoA-II solo y en combinación o en diferentes concentraciones y se incubaron durante 24 h, 48 h y 72 h. Para probar el efecto de la SR-B1, las células se trataron previamente con anti SR-B1 (2.5μg /ml) durante 2 h y se lavan por los medios 3 veces durante 5 minutos cada uno. A continuación, las células se trataron con o sin lípidos además de ApoA-II durante 48 h. El medio de cultivo se retiraron y se tiñeron con violeta de cristal 1 mg /ml (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) disuelto en 25% de metanol (v /v) y 75% de agua destilada (v /v). cristal violeta unido se solubilizó con 0,1% de sodio dodecil-sulfato-(SDS) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La densidad óptica de cada pocillo se determinó a la longitud de onda 550 nm. Los resultados se expresaron como relación con el control. Hemos encontrado que la dilución de 1:30 de lípidos y 50 mg /ml de ApoA-II eran las concentraciones óptimas a las 48 h y esta condición se utilizó en el estudio posterior.
Immunoblotting
El análisis por inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [1]. En pocas palabras, 4 x 10
5 células de cada línea de células sembradas en placas de 6 pocillos y las células se cultivaron hasta confluencia. Igual cantidad de proteínas se separaron por 10% SDS-PAGE en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. El anticuerpo primario utilizado fue el conejo anti-SR-B1 (Novus Productos Biológicos, Littleton, EE.UU.). La inmunorreactividad se detectó con el sistema de detección de electroquimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). anticuerpo β-actina anti-humano se incluyó para normalizar contra la carga desigual.
La microscopía confocal
La ejecución de los SMOFlipid marcado con hicimos fue investigado por microscopía confocal. Brevemente, 1x10
5 células /pocillo fueron sembradas en 8 diapositivas de cultivo bien (BD Falcon, BD Bioscience) durante la noche y se trató con esfingosina marcada con colorante DiD a una dilución de 1:30 con o sin ApoA-II durante 48 h. En algunos experimentos con células fueron pre-incubadas con the1: 40, 1:30 y 1:10 diluciones de no marcado SMOFlipid y anti SR-B1 en (2,5 mg /ml) durante 2 h, se lavó con medio libre de suero y se incubaron con el lípido además de ApoA-II durante 48 h. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (Univar, Redmond, WA, EE.UU.), se permeabilizaron con 0,3% de Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia) y se incubaron con o sin anticuerpo primario, cabra anti-humano de la ApoA-II ( Abcam, Abcam Inc., MA, EE.UU.) durante 2 h y después se incubaron con fluoróforo verde isotipo conjugado emparejado anticuerpo secundario (AlexaFlour
burro A488 de cabra anti IgG (h + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 h a temperatura ambiente. las células fueron montadas con los medios de glicerol con DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la captación celular se examinó bajo la microscopía confocal Leica (Leica, Tokio, Japón).
Para obtener imágenes de células vivas, 1x10
5 células /pocillo fueron sembradas en μ- Slide 4 así IBI Treat Cámara de Microscopía (ibidi GmbH, Martinsried, Alemania) durante toda la noche y se trató con esfingosina marcada con el tinte DiD a las 1:20 y 1:10 de dilución con o sin ApoA- II para 24 h. la captación celular se examinó bajo el Leica confocal Microscopy (Leica, Tokio, Japón). intensidad absorción de lípidos se cuantificó por el Leica Microsystem lAS AF (GmbH, Mannheim, Alemania) y los resultados se expresaron como la intensidad relativa.
Cryo microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Un sistema de vitrificación con control de humedad de laboratorio construido se utilizó para preparar las muestras para Cryo-TEM. La humedad se mantuvo cerca del 80% para todos los experimentos y la temperatura ambiente era de $ ~ $ 22 ° C. Una parte alícuota de 4 l de la muestra con una pipeta en una rejilla de cobre de malla 300 recubierto con película de encaje formvar-carbono (Pro-de SciTech, Thuringowa, Queensland). Después de 30 s tiempo de adsorción, la rejilla se transfirió de forma manual utilizando papel de filtro Whatman 541, de entre 2 y 10 s. A continuación, la rejilla se hundió en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido. rejillas congeladas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que sea examinado. Las muestras fueron examinadas usando un cryoholder Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, CA, EE.UU.) y un Tecnai 12 Microscopio Electrónico de Transmisión (FEI, Eindhoven, Holanda) a una tensión de 120 kV, equipada con un CCD de la FEI Águila 4k x 4k (FEI, Eindhoven, Países Bajos). Las muestras fueron vistos en 100 000-150 000 veces de aumento.
La electroforesis en gel
Un acuosa al 0,5% m /m en gel de agarosa se preparó y se sumergió en 1 × TBE (Tris-borato de amortiguación-EDTA , preparado por dilución de 10x soluciones madre, pH 9) buffer [36, 37], se ejecutan en un sistema de electroforesis horizontal (Mini-Sub GT Cell, Biorad, electrodo espaciado de 15 cm) durante 45 min a 90 imágenes V. gel fueron tomadas con un Carestream MI en longitud de onda de 650 nm de excitación y 700 nm de emisión.
ApoA-II plus de lípidos fue reconstituida por la incubación de 2 l ApoA-II (2 mg /ml) y 2 l de SMOFlipid marcado (10 mg /ml) a 37 ° C durante 24 hr. Antes de cargar el gel con la muestra, cada muestra se diluyó a 1: 5 en PBS (pH 7,4) y se añadió 2 l de solución de carga de colorante 6X (# R0611, Fermentas, ciencias de la vida) contienen 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% de azul de bromofenol, 0,03% xileno cianol FF, 60% de glicerol, EDTA 60 mM tampón. 12 l de muestra se cargaron en cada pocillo del gel. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.
Generación de PDAC xenoinjerto de tumor derivado del paciente (PDTX) en los no obesos inmunodeficiencia combinada /grave diabético (NOD /SCID)
Todos los experimentos con animales hechos conforme a las directrices del Comité de Ética Animal (NSLHD) Norte de Sydney área básica de salud en este estudio y alojados en las instalaciones de Kearns, Instituto Kolling de Investigación médica, la Universidad de Sydney. El protocolo fue aprobado por el comité de ética animal NSLHD (número de Protocolo 1011-015A). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia mediante el uso de isoflurano con el NO
2 y oxígeno (2: 1) y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Hemos establecido modelo PDTX como se describe por Wong MH y Xue A et al. [38, 39] en el marco del protocolo de NSLHD HREC- 0909-227M. En pocas palabras, NOD /SCID macho, edades de 6 a 8 semanas, se anestesiaron usando isoflourane con el NO
2 y oxígeno (2: 1). Pequeños trozos de tejidos tumorales recientes de los pacientes se xenoinjertado bajo la cápsula sub-renal (SRC) en un ratón. A las ocho semanas posteriores a xenoinjertos, se utilizaron ratones para investigar el
la absorción de lípidos in vivo.
Los animales que llevan los primeros xenoinjertos generación (F1) fueron asignados al azar y distribuidos en tres grupos (a) vehículo (solución salina); (B) de lípidos (c) además de los lípidos de la ApoA-II y se inyecta a través de la vena de la cola. Para homogeneizar los volúmenes de los tumores algunos de los tumores F1 se paso a otro grupo de ratones (F2) y, posteriormente, paso a F3. La generación F3 cojinete animales de tumores de xenoinjertos se utilizaron para el estudio de validación. la absorción de lípidos se midió a diferentes puntos de tiempo por Carestream Molecular Imaging (MI) (Carestream Molecular Imaging, EE.UU.). Al final de cada experimento se recogieron los órganos y tumores y se analizaron más.
In vivo imagen análisis
Para in vivo de imágenes ópticas, los ratones portadores de tumores se inyectaron con DiD307 marcado de lípidos con o sin Apo-AII mediante inyección en vena de cola. Imaging se realizó inmediatamente después de la inyección, en 4 h, 24 h, 48 h y 96 h por in-vivo Carestream sistema de imágenes de MI. Los ratones fueron sacrificados a las 48 h después de la inyección, el riñón de con tumor, el hígado, el bazo, el páncreas, los pulmones, el cerebro y el músculo se cosecharon y se analizaron por Carestream MI en longitud de onda de 650 nm de excitación y 700 nm de emisión.
Histología y inmunohistoquímica
Las muestras de tejido fueron fijadas en 10% formalina tamponada con fosfato y embebidos en parafina. secciones de parafina, fijados con formol se cortaron secciones gruesas de 4 micras y se tiñeron con hematoxilina de Mayer y eosina (H & amp; E). Por inmunohistoquímica, las secciones fueron incubadas con anticuerpos anti-ApoA-II (ab#54796, Abcam, Abcam Inc, MA, EE.UU.) (1 en 4000), anti-SR-B1 (#NB 400-104, Novus Productos Biológicos, Littleton, EE.UU.) (1 en 4000) y los anticuerpos IgG isotipo. La inmunodetección se realizó utilizando el Dako Envision + Sistema-marcado con HRP kit de detección de polímero (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.), según el protocolo de los fabricantes y de contraste con hematoxilina de Mayer y solución de azulado de Scott. Después del montaje, se observaron las secciones con un microscopio óptico (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokio, Japón).
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (S. D.). La significación estadística de las diferencias entre los grupos fueron analizados por pares de
t-test
y el análisis de la varianza (ANOVA), seguido por el test post hoc de Bonferroni (en su caso). La significación estadística fue aceptada en el
p Hotel & lt; 0.05.
Resultados
efecto de la ApoA-II en SMOF emulsión de lípidos
Cuando se añadió la ApoA-II de la emulsión de lípidos opaca, se produjo una transición de fase y la emulsiona opaca solución transforma en un líquido claro transparente en menos de una hora (Fig S1). Cryo imágenes TEM de SMOF lípidos además de la ApoA-II demostraron que las partículas emulsionadas transforman en vesículas unilaminares (Figura 1B). Más interesante es el pequeño tamaño de estas estructuras, muchos de los cuales eran de 10-50 nm de diámetro, mucho más pequeña que las partículas originales en la emulsión. Este cambio morfológico en estructura y tamaño son muy probablemente debido a la interacción y la integración de la ApoA-AII dentro de los lípidos de auto-conjuntos y la transformación a una solución transparente que contiene en su mayoría pequeñas vesículas unilamelares, como se demuestra por Cryo-TEM (Fig 1A y 1B).
Cryo-TEM imagen micrografía de la emulsión SMOFlipid sin ApoA-II (A) y después de la adición de ApoA-II (B). Tenga en cuenta la estructura bi-capa de la superficie de los lípidos de la nanopartícula como estructuras en presencia de ApoA-II (flechas negras). (C) Fotografía de color espectral de fluorescencia de una corrida en gel de agarosa 0,5% durante 45 min a 90 V en 1 x tampón TBE. SMOFlipid marcado con DiD no migrar a través de la etiqueta bien pero reconstituido SMOFlipid con la ApoA-II migró como una banda.
La electroforesis en gel demostrado que reconstituye la ApoA-II más complejos de lípido migró a través del gel como una banda mientras que los lípidos solo aún permaneció en el pozo (Fig 1C), lo que sugiere que la ApoA-II alterado la emulsión de lípidos y redujo el tamaño de partícula que permiten la migración en el gel. Esto es consistente con los resultados crio TEM (Fig 1A y 1B).
La microscopía confocal de células de cáncer cultivadas en soluciones de lípidos con y sin ApoA-II
La captación de lípidos por CFPAC-1 células (Fig 2A3), PANC-1 (Fig S2A) y líneas celulares de tumores primarios (S2B FIG) se mejoró cuando se reconstituye de lípidos además de ApoA-II se añadió al medio de cultivo. Efectos similares se observaron en las células de cáncer de pulmón A549 (Fig S2C). En estos experimentos ApoA-II fue visualizado por anticuerpos ApoA-II que demostró que era localiza en las membranas celulares de cáncer (Fig 2A y S2 FIG). Aunque se observó la intensidad de fluorescencia reducida en las células CFPAC-1 cuando se pre células se incubaron con el SR-B1 anticuerpo anti bloqueo (Fig 2A4). Cuando se pre células CFPAC-1 se incubaron con el no marcado gran exceso SMOFlipid solo (Fig 2B1) y luego incubadas con el reconstituido SMOFlipid /ApoA-II /DiD (Fig 2B2) aún más la absorción del TID producido y el anticuerpo ApoA-II manchado componentes periféricos de las células. Así, aunque la preincubación redujo la absorción de la captación de SMOFlipid /ApoA-II todavía producido a través del mecanismo de la atracción superficie a ApoA-II [4, 5]. En presencia de la absorción de lípidos ApoA-II es significativamente mayor a diversas concentraciones en comparación con el lípido por sí sola (Figura 2C y 2D). Estos resultados sugieren que la ApoA-II es atraído a la membrana celular mientras lípidos fue el transporte a las células PC. Este hallazgo está en un acuerdo con el ventilador Y
et al
. [4] y de plata
et al
. [5]. Tomados en conjunto estos resultados apoyan la idea de que las nanopartículas de lípidos puede ser endocitosis.
SMOFlipid se marcó con DiD (rojo), la ApoA-II fue etiquetado verde con un anticuerpo secundario y DAPI tiñe los núcleos azul. células (A1) tratados con células ApoA-II solo, (A2) tratados con lípidos solas, las células (A3) tratados con lipoproteínas reconstituidas después de la adición de ApoA-II DID etiquetados SMOFlipid (SMOF /A-II) que demuestra aumento de la captación y (A4 ) las células tratadas con (SMOF /A-II) después de tratamiento previo con anti-SR-B1antibodies que reduce la absorción de lípidos (barra de escala, 20 micras). (B) Las células se trataron previamente con lípidos no marcado a 1:10 de dilución y (B2), después se añadió 2 h SMOF /A-II, que parecía estar endocitosis en vesículas citoplásmicas como se muestra en (B3) y (B4). ApoA-II (verde) está unido con la membrana celular (cabeza de flecha amarilla) y así en el citoplasma, en parte asociada con el lípido (cabeza de flecha roja) Imagen contraste de interferencia diferencial (DIC) de superposición (barra de escala de 25 micras) en. (C) experimento de imágenes de células vivas demostró una mayor absorción de lípidos en las células cuando se reconstituye lipoproteínas después de añadir la ApoA-II hizo etiquetado SMOFlipid se añadió a los medios de comunicación para las concentraciones de lípidos de 1:20 y 1:10 (barra de escala 100 micras). (D) La intensidad de la tinción hizo fue mayor cuando 4 muestras fueron examinadas con ocho a doce áreas de interés para cada estudio en el que APOA2 aumenta la absorción de lípidos 25,6 ± 2,2,
P
= 0,02 y 54,8 ± 2,2 ,
P = 0,004
para diluciones de 1:20 y 01:10, respectivamente.
SMOFlipid ApoA-II objetivos PDAC PDTX in vivo
para evaluar el tumor capacidad de los lípidos más ApoA-II de orientación se empleó un modelo de PDAC PDTX en el ratón. Lípido /DID o lípido /DID /ApoA-II se inyectó en la vena de la cola de ratones portadores de tumores primera generación. formación de imágenes animales completos después de 48 h reveló la absorción de lípidos en los tumores xenoinjertos PDAC se limita en el lípido más ApoA-II inyecta ratones en comparación con el lípido por sí solo (Fig 3A y Fig S3A), sino también en el hígado, el estómago y el bazo. Esto fue confirmado en los órganos explantados por
ex vivo de imágenes
pero poco lípidos se observó en los pulmones y el cerebro, pero que no se ve en el páncreas normal (figura 3B y la figura S3 B). La intensidad de fluorescencia relativa se incrementó en 3,4 veces en los tejidos de cáncer específicos, ¿cuándo te-lípido /ApoA-II se inyectó (figura 3C) en comparación con DID-lípido, en consonancia con la figura 2. En conjunto nuestros resultados sugieren que la ApoA-II humana se dirige PDAC
.
(A) imágenes de fluorescencia de reflectancia espectral de 8 semanas de edad xenoinjertos tomadas 48 horas después de la inyección en vena de cola de PBS, DiD etiquetados SMOFlipid sin o con la ApoA-II utilizando la imagen molecular Carestream. Tenga en cuenta la amplia distribución de DiD es mejor localizada a los tumores cuando ApoA-II se incluye con los lípidos. Las flechas indican el sitio de los tumores. (B) Las imágenes de fluorescencia espectrales de los tumores y órganos explantados tomadas 48 horas después de la inyección de los ratones después de una inyección en la vena caudal de PBS, lípidos /DiD (n = 2) o lípidos /DiD más ApoA-II (n = 2) (panel de la derecha ) junto con el H & amp; e foto micrografía del tumor a partir de dos ratones (panel izquierdo), conservó las características morfológicas de los tumores de PC del paciente original en lípidos y los lípidos además de la ApoA-II ratones tratados. Tenga en cuenta la absorción de la fluorescencia por los tumores, el hígado y el bazo. (C) Gráfico representa la captación por el tumor en relación con la captación del hígado como una fracción del área. Estos resultados se normalizaron luego al valor para los ratones que recibieron solamente de lípidos (que se define como 1) cuando la captación tumoral de los ratones que recibieron los lípidos y ApoA-II tenía 3,4 veces mayor absorción. Los valores son medias ± SD;
n = 3.
receptor scavenger clase B 1 (SR-B1) es más alta expresión humana PDAC
Por el Western Blot, por primera vez, hemos demostrado que la expresión de SR-B1 fue de 13,2, 10,6, 3,1 y 2,3 veces mayor en PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 y líneas de células BxPC3, respectivamente, en comparación con la línea celular normal del páncreas (HPDE6) (figura 4A). La inmunohistoquímica (IHC) demostró que la expresión de SR-B1 era 3,7 veces mayor en el tejido en comparación con PDAC páncreas normal (Fig 4B). De acuerdo con la figura 2, se encontró que la expresión de la ApoA-II fue mayor en los tumores cuando se inyectaron los ratones con la combinación de los lípidos y la emulsión de ApoA-II (Fig 4C), mientras que no hubo diferencia en la expresión SR-B1 en los tumores en ningún grupo ( La figura 4C).
(A) HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 y las células se cultivaron BxPC3 y SR-B1 expresión se midió por el Western Blot. La intensidad de la banda de las proteínas se normalizó con β-actina y HPDE6 se definió como 1. Los valores son la media de dos experimentos separados. (B) Expresión de SR-B1 por IHC en el páncreas normal (NP) y los tejidos humanos PDAC. Inserción, IgG representa el principal anticuerpo isotipo emparejado a los anti SR-B1. El gráfico muestra la cuantificación de la expresión de SR-B1 por el porcentaje de células teñidas X intensidad de 3 pacientes diferentes y NP se definió como 1. (C) Expresión de SR-B1 y ApoA-II por IHC en correspondientes tumores PDAC xenoinjertados en 48 h después de la inyección en vena de cola de lípidos con o sin la ApoA-II. Inserción, IgG representa el isotipo emparejado con el anticuerpo primario anti-ApoA-II. (d) los efectos de la lucha contra SR-B1 sola en HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 y crecimiento de las células BxPC3. (E) Las células se trataron previamente con o sin el anticuerpo SR-B1 (2,5 mg /ml) durante 2 horas y luego tratados con ApoA-II, los lípidos y los lípidos más ApoA-II durante 48 horas. La proliferación se midió mediante el ensayo de cristal violeta. Los valores son medias ± SD;
n = 4.
*
, ‡,#y ± p & lt; 0,05 frente al control, ApoA-II, de lípidos y lípidos + ApoA-II, respectivamente, con el uso de análisis de varianza.
ApoA-II mejoró la proliferación celular en células de cáncer humano
Cuatro líneas celulares PC PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 y BxPC3 creció más rápidamente (figura 4E) cuando tenían los lípidos y la ApoA-II añaden a su medio de cultivo en comparación con los controles, la ApoA-II solo o con lípidos solos (excepto las células CFPAC-1). Alternativamente ApoA-II downregulated células HPDE6 normales (figura 4E). Esto fue más evidente a las 48 h, e implica que la combinación de lípidos y ApoA-II aumentó la absorción de lípidos y por lo tanto la energía permitiendo que las células PC a crecer más rápidamente. Hubo un efecto similar en las líneas celulares de cáncer humano de pulmón, de mama y de próstata a las 48 h (Fig S4). Sin embargo, la ApoA-II no promovió el crecimiento de la línea celular de cáncer de mama MCF7, que retiene las características de diferenciación y crece lentamente [40]. Además, la preincubación con anticuerpo anti SR-B1 revertir completamente lípidos más ApoA-II estimula la proliferación celular en células BxPC3 PANC-1, CFPAC-1 y y parcialmente pero significativamente en MIAPaCa-2 células (Fig 4E). Curiosamente, la inhibición de SR-B1 mejorada ApoA-II plus lipídica inducida downregulation de crecimiento celular en HPDE6 (Fig 4E). Anti SR-B1 sola en 2.5μg /ml no tuvo ningún efecto significativo sobre HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2 y de células BxPC3 líneas, mientras que significativamente downregulated CFPAC-1 de crecimiento de células (Fig 4D). Esto puede ser debido a la diferencia de nivel de densidad de SR-B1 en CFPAC-1 líneas celulares (Fig 4A) PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC3 y.
Discusión
ApoA-II cambiado la estructura física de SMOF de lípidos reduciendo el tamaño de las partículas de lípidos y la inducción de la formación de una membrana de bicapa nanoparticle- como la estructura. Esto es consistente con la estructura conocida y la función de ApoA-II en HDL [41]. La combinación de ApoA-II y lípidos promovió significativamente el crecimiento de las líneas celulares PC y líneas celulares de cánceres de pulmón, mama y de próstata. Además, ApoA-II a la absorción de lípidos en PANC-1, CFPAC-1, las células tumorales primarias y en los PDXT. La absorción de la emulsión de lípidos exógenos con ApoA-II en tumores de PC puede utilizar el receptor SR-B1 (Fig 2A4), debido a que forma una HDL como la estructura que tiene una alta afinidad para SR-B1 [26].