Extracto
La genisteína se ha demostrado que suprimir el crecimiento de varios tipos de cáncer a través de la modulación de las diversas vías. Sin embargo, no se han reportado los efectos de la genisteína sobre la regulación de oncogénico microARN-151 (miR-151). En este estudio, se investigó si la genisteína podría alterar la expresión de miR-151 oncogénico y sus genes diana que están involucrados en la progresión y metástasis de cáncer de próstata (CaP). Real-time RT-PCR mostró que la expresión de miR-151 fue mayor en células PC3 y DU145 comparación con las células RWPE-1. El tratamiento de células PC3 y DU145 con genisteína 25 mM reducido regulado la expresión de miR-151 en comparación con el control del vehículo. La inhibición de miR-151 en células de CaP por la genisteína inhibe la migración celular y la invasión significativamente.
in silico,
análisis demostró que varios genes (CASZ1, IL1RAPL1, sox17, N4BP1 y ARHGDIA) sugiere tener funciones supresoras tumorales fueron los genes diana de miR-151. los ensayos de reportero de luciferasa indicaron que el miR-151 se une directamente a sitios específicos en el 3'UTR de los genes diana. Análisis en tiempo real PCR cuantitativa mostró que los niveles de expresión de ARNm de los cinco genes diana en PC3 y DU145 se cambiaron notablemente con el miR-151 imita y inhibidor. Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank pruebas revelaron que los altos niveles de expresión de miR-151 tuvieron un efecto adverso sobre la tasa de supervivencia. Este estudio sugiere que la genisteína mediada por la supresión de miRNAs oncogénicos puede ser una estrategia terapéutica importante en la dieta para el tratamiento del CaP
Visto:. Chiyomaru T, Yamamura S, MS Zaman, Majid S, G Deng, Shahryari V, et Alabama. (2012) genisteína suprime el crecimiento del cáncer de próstata a través de la inhibición de la Oncogénicos microARN-151. PLoS ONE 7 (8): e43812. doi: 10.1371 /journal.pone.0043812
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2012; Aceptado: July 26, 2012; Publicado: 23 Agosto, 2012
Copyright: © Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuido, transmitido, modificado, construido sobre, o utilizado de otra manera por cualquier persona por cualquier propósito legal. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la investigación de los Institutos nacionales de Salud a través de los números de subvención R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 y VA Merit Review y el proyecto del Programa de VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es una de las enfermedades más comunes entre los hombres y ocupa el segundo lugar con el cáncer de pulmón en las muertes relacionadas con el cáncer [1]. Después de la terapia de privación de andrógenos. CaP puede reaparecer más enfermedades como independiente de los andrógenos, metastásico que conduce a la muerte dentro de varios años [2]. Actualmente, no hay tratamientos eficaces están disponibles para curar CaP independiente de los andrógenos. De este modo, los nuevos marcadores pronósticos y estrategias de tratamiento eficaces se necesitan con urgencia.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos que regulan la expresión génica a través de la represión de traducción de ARNm y división [3]. Bioinformática indican que miRNAs regulan 60% de los genes codificantes de proteínas [4]. En la actualidad, 1.527 miRNAs humanos se han registrado en la base de datos miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/). miRNAs están involucrados en una variedad de procesos biológicos, incluyendo el metabolismo, el desarrollo, y la diferenciación, y contribuyen al desarrollo de varios tipos de cáncer [5]. Muchos cánceres humanos tienen la expresión aberrante de miRNAs, que puede funcionar como supresores de tumores u oncogenes [6].
(A) perfil de expresión de miR-151 en líneas celulares de CaP (LNCaP, DU145 y PC3) y la normalidad células epiteliales de la próstata (RWPE-1). PCR en tiempo real mostró que los niveles de expresión de miR-151 fueron reguladas en líneas celulares de CaP andrógeno-independiente (DU145 y PC3). la expresión de miR-151 se normalizó a RNU48. Los datos se presentan como medias ± SE. Niveles (b) la expresión de miR-151 después del tratamiento con genisteína (25 m). Se encontró que la expresión de miR-151 que reducirse un 15-45% en las células tratadas con genisteína. *, P & lt;.
0,05
miR-151 se asigna a una región del cromosoma 8q. Que se ha encontrado que se amplifica frecuentemente en varios tipos de cáncer, incluyendo la vejiga, riñón, próstata, mama, pulmón, gástrico y el cáncer rectal [7] - [13]. Hemos demostrado anteriormente que la ganancia cromosómica del locus 8q24.3, donde reside gen oncogénico LY6K, puede tener un papel fundamental en el desarrollo del cáncer de vejiga [7]. Un artículo mostró que el aumento del número de copias del gen miR-151 en 8q24.3 en el CaP se correlacionó con metástasis [14].
La genisteína (4 ', 5,7-Trihydroxyisoflavone), un componente importante de isoflavonas soja y sus derivados, se ha demostrado que presentan efectos anticancerosos potentes en el CP [15], [16]. Las pruebas epidemiológicas indican que las tasas de incidencia y mortalidad por CaP son considerablemente más bajos en Asia en comparación con los Estados Unidos [17]. La concentración sérica media de la genisteína en los hombres asiáticos fue mayor que el de la población de Estados Unidos [18] y varios estudios han demostrado que la ingesta de isoflavona se asoció con una reducción en el riesgo de CaP [19] - [22]. La genisteína tiene múltiples dianas moleculares, incluyendo receptores, enzimas, y vías de señalización [15]. La genisteína también se ha demostrado para suprimir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer
in vitro
y
in vivo
, la reducción de la expresión de varios miRNAs oncogénicos. Hasta la fecha, no se han reportado los efectos de la genisteína sobre la regulación de miR-151. Por lo tanto, en este estudio se investigó si la genisteína podría alterar la expresión de miR-151 y su objetivo genes implicados en la progresión y la metástasis del CP.
(A) Derribo de miR-151a-5p inhibe significativamente la migración celular. Después de la transfección (48 horas), una herida se formó por raspado y la herida mide después de 24 horas. Imágenes representativas de ensayo de cicatrización de la herida se muestran con una ampliación de x200. **, P & lt; 0,0001 (B) Derribo de miR-151a-5p disminuyó significativamente la invasión celular. Imágenes representativas de ensayo de invasión se muestran con una ampliación de x200. **, P & lt;.
0,0001
Resultados
miR-151 está regulado en el CaP y Tratamiento La genisteína Disminución de miR-151
Para determinar los niveles relativos de expresión de miR-151 en células de CaP, se realizó un análisis en tiempo real PCR cuantitativa TaqMan usando dependiente de andrógenos (LNCaP) y andrógeno-independiente (PC3, DU145) las líneas celulares y los comparo con las células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1). miR-151 se compone de dos miRNAs maduros; miR-151a-5p y miR-151a-3p (miRBase). Hemos observado que la expresión de miR-151 fue notablemente hasta reguladas en líneas celulares de CaP independiente de andrógenos en comparación con RWPE-1 células (miR-151a-5p; PC3 4,02 veces, DU145 1,36 veces) (miR-151a-3p; PC3 5.14 veces, DU145 2,25 veces) (figura 1A)
la genisteína tratamiento significativamente reducido regulado el nivel relativo de expresión de miR-151 en comparación con el control del vehículo (miR-151a-5p;.. PC3 15% de disminución , DU145 14% de disminución) (miR-151a-3p; PC3 44% de disminución, DU145 32% de disminución) (figura 1B)
Efecto de miR-151 Derribo sobre la proliferación celular, la migración y la invasión en.. Líneas celulares de CaP
Para examinar el papel funcional de miR-151, hemos realizado estudios de la pérdida de la función utilizando anti-MIR miARN inhibidor transfectaron en células PC3 y DU145. La expresión de miR-151 se reprimió notablemente en anti-MIR miRNA inhibidor de transfectantes (datos no presentados) y se observó viabilidad celular similar en todas las líneas celulares, lo que sugiere que desmontables miR-151 no afectó a la proliferación de células (datos no presentados). ensayo de la cicatrización de heridas demostró una inhibición significativa de la migración celular en la lucha contra el miR-151a miARN-5p líneas celulares transfectadas con CaP en comparación con sus homólogos (Fig. 2A). Sin embargo, no se observó una inhibición significativa con líneas celulares transfectadas con CaP anti-MIR miRNA-151a-3p. El ensayo de invasión de Matrigel demostró que el número de células invasoras se redujo significativamente en contra de miR-transfectantes miARN-151a-5p en comparación con sus homólogos (Fig. 2B). Por lo tanto es probable que miR-151a-5p juega en papel importante en la migración de células tumorales y la invasión. Para evaluar los efectos simultáneos de miR-151a-5p y miR-151a-3p, pérdida de función se llevó a cabo estudios que utilizan líneas celulares de CaP inhibidor miARN co-transfectadas. No hubo ningún efecto adicional sobre la viabilidad celular por el miR-151a-5p y miR-151a-3p co-transfección (datos no mostrados).
PC-3 células fueron transfectadas transitoriamente con pre-miARN MIR precursor o anti-MIR miARN inhibidor o control negativo, seguido de transfección transitoria con plásmidos de tipo salvaje reportero 3'UTR o plásmidos mutados 3'UTR durante 24 horas. actividad de reportero 3'UTR se midió por ensayo de luciferasa y se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla. Los datos se presentan como la media ± SE. *, P & lt;. 0,05
Identificación de miR-151a-5p genes diana por análisis in silico
Para identificar los posibles genes diana de miR-151a-5p, que utiliza TargetScan y microRNA.org para identificar los sitios donde estos miRNAs se unen. Estos programas identificaron cinco genes que contienen sitios putativo objetivo de miR-151a-5p en su 3'UTR (N4BP1: proteína de unión Nedd4 1, CASZ1: ricino dedo de zinc 1, IL1RAPL1: 1 receptor de la interleucina accesorio semejante a la proteína 1, SOX17: SRY ( el sexo región determinante y) -BOX 17 y ARHGDIA:.. Rho PIB inhibidor de la disociación (GDI) alfa Estos genes fueron identificados por ambos algoritmos y análisis bioinformático mostraron que pueden tener la función supresora de tumores en varios tipos de cáncer [23] - [27]
(A) (B) (C) (D) (E) Los niveles de mRNA de cinco genes diana de miR-151a-5p se determinaron por cuantitativa en tiempo real los análisis de PCR después de la transfección con imita el miR-151a-5p , inhibidor de miR-151a-5p y el control negativo en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145). (F) Los niveles de mRNA de cinco genes diana de miR-151a-5p fueron determinados por cuantitativa en tiempo real los análisis de PCR después del tratamiento con genisteína ( 25 M) en líneas celulares de CaP (DU145). (G) Los niveles de proteína de los genes diana de miR-151a-5p se determinaron mediante análisis de Western blot después de la transfección con imita el miR-151a-5p, inhibidor de miR-151a-5p y negativo Control en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145). Los datos se presentan como la media ± SE. *, P & lt;. 0,05
luciferasa reportero ensayos utilizando vectores que contienen 3'UTR sitios putativos de los genes diana
CASZ1, IL1RAPL1 y ARHGDIA cada uno tienen Encuadernación predijo sitio de unión de miR 151a-5p en sus 3'UTRs mientras N4BP1 y SOX17 cada uno tiene dos sitios de unión predicha (Fig. 3). Hemos clonado los objetivos 3'UTRs miR-151a-5p putativos en un vector reportero de ensayo de luciferasa. ensayo de indicador de luciferasa demostró que miR-151a-5p disminuyó las actividades relativas de luciferasa de CASZ1, IL1RAPL1 y ARHGDIA (Fig. 4A, 4B y 4E). ensayo indicador de luciferasa también demostró que la supresión de miR-151a-5p aumento de las actividades relativas de luciferasa 3'UTR. La mutación del putativo sitios de unión en estas 3'UTRs miR-151a-5p disminuyó la respuesta a miR-151a-5p. Estos resultados indican que el miR-151a-5p se une directamente a la 3'UTRs de CASZ1, IL1RAPL1 y ARHGDIA. ensayo indicador de luciferasa también demostró que el miR-151a-5p disminuyó las actividades relativas de luciferasa, y la caída de miR-151a-5p incrementó las actividades relativas de luciferasa con tanto de tipo salvaje SOX17 3'UTRs (posición 472-478 y 769-776 Posición) (Fig. 4C y 4D). N4BP1 3'UTR Posición 3383 a 3389 no mostró ningún cambio de actividad luciferasa, ya sea con imita el miR-151a-5p o inhibidor de miR-151a-5p. El otro sitio de destino (posición 4077 a 4083) mostró que el miR-151a-5p disminuyó notablemente la actividad de luciferasa relativa y supresión de miR-151a-5p aumentado de manera significativa la actividad de luciferasa con el UTR 3 'de tipo silvestre. Por lo tanto estos datos sugieren que miR-151a-5p se une directamente a un sitio (posición 4.077 a 4.083) en la 3'UTR del mRNA N4BP1.
(A) miR-151 expresión en muestras clínicas (BPH, n = 17; CaP, n = 30). **, P & lt;. 0,0001 (B) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia global mediante la expresión de miR-151a-5p (P = 0,0944) guía empresas
Regulación de la Expresión Génica de destino en el CaP líneas celulares por Mir -151a-5p
cuantitativo en tiempo real PCR análisis mostró que los niveles de expresión de ARNm de los cinco genes diana en PC3 y DU145 fueron reprimidos notablemente en los transfectantes miR-151a-5p en comparación con los controles (Fig. 5A -MI). Además, la expresión de ARNm de los cinco genes diana en PC3 y DU145 fueron marcadamente hasta reguladas en los transfectantes inhibidor de miR-151a-5p en comparación con los controles. También se evaluó el efecto de la genisteína en la expresión del ARNm de los objetivos de miR-151a-5p. Estos genes diana eran casi hasta reguladas con el tratamiento con genisteína en líneas celulares DU145 (Fig. 5F). Los niveles de expresión de proteínas de SOX17 y ARHGDIA se redujo significativamente en los transfectantes miR-151a-5p en comparación con los controles y hasta reguladas en los transfectantes inhibidor de miR-151a-5p (Fig. 5G).
Up- La expresión regulada de miR-151-5p en el CaP muestras
Se evaluaron los niveles de expresión de miR-151-5p en el CaP (n = 30) y el cáncer de próstata benigna (HPB) (n = 17) tejidos. Los niveles de expresión de miR-151-5p fueron significativamente mayores en el CaP en comparación con los tejidos de BPH (P = 0,0001; Fig. 6A). Para determinar si los niveles de miR-151a-5p en los tejidos tumorales se correlaciona con la supervivencia de los pacientes con CaP, también medimos miR-151a-5p niveles de expresión en muestras de tumores humanos (Fig. 6B). Los resultados muestran que los pacientes con alta expresión de miR-151a-5p tenían una tasa de supervivencia menor que aquellos con baja expresión 151a-5p, aunque estos resultados no alcanzaron significación estadística (p = 0,0944). Tampoco hubo correlación significativa con otros factores clínico-patológicas (estadio del tumor y la puntuación de Gleason) (datos no mostrados).
Discusión
En este estudio hemos demostrado que el MIR -151 es altamente expresado en líneas celulares de CaP independientes de andrógenos y que la motilidad celular y la invasión se reducen en líneas celulares desmontables miR-151a-5p (PC3 y DU145). miR-151 se compone de dos miRNAs maduros; miR-151a-5p y miR-151a-3p. Dos maduras miRNAs se escindieron del mismo tallo-bucle-precursor de miR-151a. Por lo tanto miR-151a-5p y miR-151a-3p tienen diferentes secuencias y, por tanto, se dirigen a diferentes ARNm. Cicatrización de heridas ensayo de ensayo y la invasión demostró que desmontables de miR-151a-5p, pero no miR-151a-3p, disminuyó significativamente la migración celular y la invasión CaP. Estos resultados sugieren que las funciones de miR-151a-5p como un oncogén mediante el aumento de la migración celular y la invasión en el CaP. Por el contrario, no hubo ningún efecto significativo sobre la proliferación celular en células de CaP transfectadas inhibidores de miR-151a-5p, lo que sugiere que miR-151a-5p no está involucrado en la actividad de proliferación. En este estudio, hemos demostrado que la regulación de la expresión de miR-151a-5p en los tumores se relaciona con una menor supervivencia de los pacientes con CaP sin embargo, estos resultados no fueron significativamente diferentes con este parámetro o otras características clínico-patológica. Desde nuestra cohorte no era grande (n = 30) e incluyó sólo cinco muestras de cáncer avanzado (más de pT3) y tres muestras con una puntuación de Gleason de 8 o más, los estudios sobre un mayor número de muestras con un fondo patológica equilibrada tendrán llevarse a cabo para la evaluación estadística más precisa.
bioinformática Computacional y 3 'ensayos de reportero de luciferasa indicar que el miR-151a-5p tiene varios genes diana potenciales (CASZ1, IL1RAPL1, sox17, N4BP1 y ARHGDIA). CASZ1, un gen de diferenciación neuronal, se han demostrado poseer actividad supresora de tumores. En sumples tumorales clínicos primarios, la expresión de CASZ1 se redujo significativamente en neuroblastoma agresivo con respecto a los tumores favorables [28]. La restauración de la expresión CASZ1 inhibe la migración tumoral
in vitro
y suprimió la tumorigenicidad
in vivo
[23]. El gen IL1RAPL1 se encuentra en una región en el cromosoma X y la proteína codificada por este gen es un miembro de la familia del receptor de la interleucina 1 y es similar a la interleucina 1 proteínas accesorias [29]. IL1RAPL1 se ha informado de que se downregulated en muchas líneas celulares de tumores cerebrales y xenoinjertos en comparación con los tejidos normales [24] lo que sugiere que puede funcionar como un supresor de tumores [30]. El gen codifica una SOX17 miembro de la familia SOX de factores de transcripción implicados en la regulación del desarrollo embrionario y en la determinación de la suerte de células [31]. PCR en tiempo real cuantitativa mostró que la expresión SOX17 fue menor en los tejidos de cáncer gástrico que los de los tejidos normales [32]. SOX17 se informó a ser un gen supresor tumoral candidato que inhibe la vía de señalización Wnt /β-catenina canónica en el cáncer colorrectal y el carcinoma hepatocelular [25], [33]. N4BP1 ha sido identificado como un sustrato para la ubiquitinación mono por E3 ubiquitina ligasa Nedd4 [34]. Se ha demostrado que interactúa con N4BP1 y regula negativamente la actividad PICOR E3 dirigida hacia sus sustratos que incluyen proteínas relacionadas con p53-supresores de tumores (p73 y p63) [35] c-Jun y. ARHGDIA es una proteína reguladora celular que se une a y negativamente regula la mayoría de las GTPasas Rho incluyendo RhoA, Rac1, Cdc42 y [36]. La pérdida de ARHGDIA potencia la metástasis y la resistencia al tamoxifeno en el cáncer de mama [37] y la pérdida de expresión ARHGDIA promueve el desarrollo y la progresión de CaP [27]. En thisb estudio se demostró que los niveles de expresión de mRNA de estos genes diana supresor tumoral en cinco PC3 y DU145 se cambiaron notablemente en la experimentación con imita el miR-151a-5p y inhibidor de miR-151a-5p, lo que indica que el miR-151-5p directamente objetivos estos genes.
la genisteína se ha demostrado para suprimir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer de
e in vitro
in vivo
, la reducción de la expresión de miRNAs oncogénicas, tales como el miR -21 [38], el miR-27a [39], el miR-221 y miR-222 [40]. En este estudio, hemos demostrado que el tratamiento con genisteína significativamente reducido regulado el nivel relativo de expresión oncogénica de miR-151. Recientemente, nuestro grupo mostró que la genisteína inhibe la expresión de miR-21 en células de cáncer de riñón y en los tumores formados después de la inyección tratada genisteína células cancerosas renales en ratones desnudos a lo largo con la inhibición de la formación de tumores [38]. miR-27a se ha informado de que un miARN oncogénicos en varias células cancerosas, y su expresión génica y de destino (ZBTB10) los niveles eran dependientes de la dosis de genisteína [39]. Hemos demostrado anteriormente que la genisteína upregulated gen supresor de tumores ARHI mediante la regulación negativa de miR-221 y miR-222 en el CaP [40]. La genisteína también se ha informado de suprimir el crecimiento de varios tipos de cáncer mediante el aumento de la expresión de los supresores de tumores, miR-146a [41] y miR-1296 [42]. El tratamiento de células de cáncer de páncreas con compuestos de isoflavona (incluyendo 70,54% de genisteína), aumento de la expresión de miR-146a, causando downregulation de EGFR, MTA-2, IRAK-1, y NF-kappa B, resultó en la inhibición de la invasión de células [41]. También hemos informado de que la genisteína incrementó la expresión de miR-1296 (de 3 a 5 veces) en células de CaP y downregulated significativamente la expresión de MCM2 que es objetivo de miR-1296 [42].
En este estudio, se han demostrado que el miR-151 se dirige directamente a varios genes supresores de tumores y que participan en la progresión y la metástasis del CP. Además, este es el primer informe para demostrar que la genisteína regula a la baja la expresión de miR-151 que sugiere que la genisteína puede servir como un agente terapéutico importante de la dieta para el tratamiento del CaP.
Materiales y Métodos
Clínica las muestras de próstata
Todas las láminas de tejido fueron revisados por un patólogo certificado por el consejo para la identificación de los focos de cáncer de próstata, así como el epitelio glandular normal adyacente. Todos los pacientes con cáncer tenían niveles elevados de antígeno prostático específico (PSA) y se habían sometido a prostatectomía radical entre 1999 y 2004. características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Los tejidos no cancerosos fueron obtenidos de pacientes con HBP que se habían sometido a prostatectomía transuretral o una resección. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer de próstata humano, LNCaP, PC-3 y DU145 y una línea celular epitelial de próstata no maligno, RWPE-1, eran adquirido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas celulares de cáncer de próstata se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37 ° C. RWPE-1 línea celular fue cultivada en medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con 5 ng /factor de crecimiento epidérmico recombinante humano ml y 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células subconfluentes (60% -70% de confluencia) fueron tratadas con genisteína (25 mmol /L; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) disuelto en dimetilsulfóxido y células tratadas con vehículo (dimetilsulfóxido) sirvió como control. medios celulares y genisteína se cambian cada día y se cultivaron durante 4 días.
La extracción de RNA
ARN fue extraído de muestras FFPE humanos utilizando un kit incluido en parafina fijado en formol-miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) después de microdisección. Para digerir el ADN, se utilizó el kit Qiagen DNasa libre de RNasa. El ARN total se extrajo también de las líneas celulares de cáncer de próstata y una línea de células epiteliales de próstata no maligno utilizando un kit miRNeasy mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total extraído se transcribe de forma inversa en ADNc monocatenario usando un kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y un kit TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó con un Applied Biosystems Prism7500 secuencia rápida sistema de detección usando TaqMan PCR Universal mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando el sistema 7500 Fast SDS software versión 1.3.1 (Applied Biosystems). Cuantitativos parámetros de PCR para los ciclos eran las siguientes: 95 ° C durante 20 segundos, 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 3 segundos, y 60 ° C durante 30 segundos. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de reacción de 10 l por triplicado. Los datos se analizaron con el método de Ct delta-delta para calcular el factor de cambio. sondas TaqMan y cebadores para CASZ1 (ensayo ID: Hs00214901_m1), IL1RAPL1 (ID ensayo: Hs00990788_m1), SOX17 (ID ensayo: Hs00751752_s1), N4BP1 (ID ensayo: Hs00206373_m1), ARHGDIA (ID ensayo: Hs00366348), GAPDH (ID ensayo: Hs02758991_g1), miR-151a-5p (ensayo ID: 002642), el miR-151a-3p (ensayo ID: 002254), RNU48 (ensayo ID: 001006) se obtuvieron de Applied Biosystems. GAPDH y RNU48 se utilizaron como controles internos.
Western Blot Analysis
A las 72 horas después de la transfección, las células se lisaron con tampón RIPA (Pierce, Brebieres, Francia) que contienen inhibidores de la proteasa (Sigma). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). lisado de proteínas (30 mg) se separó por 4% a 20% en geles de SDS poliacrilamida y se transfirió a membrana de nitrocelulosa. Un anticuerpo contra SOX17 se adquirió de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra ARHGDIA y GAPDH se adquirieron de GeneTex (Irvine, CA, EE.UU.). La membrana se lavó y después se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.). complejos específicos se visualizaron con un echochemiluminescence (ECL) sistema de detección (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), y se evaluó el nivel de expresión de estos genes mediante el uso de software ImageJ (ver 1.43;. http://rsbweb.nih.gov/ij /index.html).
la transfección
Pre-MIR precursor de miARN y el control negativo (Applied Biosystems) fueron utilizados en los experimentos con ganancia de función, mientras que los anti-MIR miARN y inhibidor negativo control (Applied Biosystems) se utilizaron en los experimentos de pérdida de función. células PC3 y DU145 fueron transfectadas transitoriamente utilizando reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. transfecciones simuladas, con el reactivo de transfección, se utilizaron como controles.
proliferación
celular, la migración y la invasión ensayos
La proliferación celular se midió utilizando un CellTiter 96 acuosa Una célula de soluciones Ensayo de proliferación (MTS) (Promega, Madison, WI, EE.UU.) realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proliferación celular se determinó por medidas de absorbancia a 490 nm usando SpectraMax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EE.UU.). actividad de migración celular se evaluó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Las células se sembraron en placas de seis pocillos, y las monocapas de células se rasparon con una punta de micropipeta P-20. La anchura de la separación inicial (0 h) y la brecha residual 24 horas después de la herida se calcularon a partir fotomicrografías. Un ensayo de invasión de células se llevó a cabo utilizando modificado Boyden Salas compuestas de Matrigel insertos de filtro de membrana Transwell-pre-revestido con ocho poros micras en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.). medio esencial mínimo que contenía 10% de FBS en la cámara inferior servía de cebo químico, tal como se describe anteriormente [43]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado
predicción de los objetivos microARN
Los genes objetivo previsto y sus regiones de semillas miARN sitio de unión se determinaron utilizando TargetScan (versión 5.2, http:. //www.targetscan. org /) y microRNA.org (agosto de 2010 la liberación, http://www.microrna.org/microrna/home.do). Las secuencias de los miRNAs maduros predichos fueron confirmados por miRBase (liberación 18,0; http://microrna.sanger.ac.uk/).
Construcción de plásmidos y ensayos Dual-Luciferase Reporter
Para 3 'UTR ensayo indicador de luciferasa, se utilizó PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega). Las secuencias de oligonucleótidos (de tipo salvaje) utilizados se muestran en la Tabla S1. También se construyeron oligonucleótidos mutados para cada uno de los oligonucleótidos de tipo salvaje (Tabla S1). En un volumen total de 25 l, 1 l cada uno de 100 mM de avance y oligonucleótido inverso, 2.5 l de 10 x tampón de hibridación (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl y 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético) y 20,5 l de agua eran se incubaron a 95 ° C durante 3 min y luego se coloca a 37 ° C durante 15 min. Los oligonucleótidos se ligaron en el sitio PmeI-XbaI de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión. Para 'ensayo de luciferasa 3 UTR, las células de cáncer de próstata fueron co-transfectadas con pre-MIR precursor de miARN o Anti-MIR miARN inhibidor y pmirGLO Dual-Luciferase miARN objetivo Vectores de expresión utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y X-tremeGENE HP reactivo de transfección de ADN ( Roche Diagnosis, Basilea, Suiza, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. reportero de ensayo de luciferasa se realizó utilizando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega) 24 horas después de la transfección.
Análisis estadístico
La relación entre dos variables y los valores numéricos obtenidos por tiempo real RT -PCR se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney o la prueba t pareada. La relación entre las tres variables y los valores numéricos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney U-ajustado de Bonferroni. Asociación de la expresión de miR-151 con la supervivencia global se estimó mediante el método de Kaplan-Meier y las curvas resultantes se compararon mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis se realizaron utilizando Statview de Expertos (versión 4, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). En la comparación entre las tres variables, un nivel no ajustado estadístico de significación de P & lt; 0,05 corresponde a un nivel ajustado por Bonferroni de P & lt;.
0,0167
Apoyo a la Información sobre Table S1.
secuencias de oligonucleótidos cebadores (de tipo salvaje y mutado).
doi: 10.1371 /journal.pone.0043812.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito .