Extracto
quimioterapia basada en taxanos es el tratamiento estándar en cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Hay pruebas convincentes de que la terapia de taxano afecta a los receptores de andrógenos (AR), pero los mecanismos exactos que han de ser estudiada posteriormente. Nuestros estudios identificaron c-jun como un actor clave fundamental que interactúa con AR y por lo tanto determina el resultado de la terapia de taxano dado. agentes docetaxel (DOC) y paclitaxel (PAC) mostraron diferentes efectos en LNCaP y LNb4 evidenciadas por la alteración en la proteína y los niveles de ARNm de c-jun, AR y PSA. phophorylation docetaxel inducida por c-jun se produjo antes de la fosforilación de JNK lo que sugiere que la fosforilación de c-jun es independiente de las vías de JNK en células de cáncer de próstata. Un estudio de xenoinjerto mostró que los ratones tratados con Pac y bicalutamida mostraron peor resultado el apoyo a nuestra hipótesis de que la regulación positiva de c-jun podría actuar como un factor antiapoptótico potente. Hemos observado en nuestros estudios in vitro de una regulación de los niveles de PSA-inversa y AR-mRNA en las células tratadas LNb4 Doc. Esto también se observó para la calicreína 2 (KLK 2), que siguió el mismo patrón. Teniendo en cuenta el hecho de que la respuesta al tratamiento con taxanos se mide por la disminución de PSA tenemos que considerar que esto podría no reflejar la verdadera actividad de la AR en pacientes CRPC
Visto:. Tinzl M, Chen B, Chen SY, Semenas J , Abrahamsson PA, Dizeyi N (2013) la interacción entre c-jun y del receptor de andrógenos determina el resultado de la terapia de taxano en el cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10.1371 /journal.pone.0079573
Editor: Elad Katz, AMS Biotecnología, Reino Unido
Recibido: 12 Abril, 2013; Aceptado: September 25, 2013; Publicado: 8 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tinzl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto está financiada por fondos privados Sandbergs, Fundación Percy Falk cáncer y la financiación de Malmö. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las opciones de tratamiento para pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) son todavía limitados. A pesar de los nuevos fármacos prometedores como inhibidor arbiraterone CYP17A1 y MDV3100 han entrado en el mercado, la quimioterapia basada en taxanos todavía se considera la piedra angular de todo el mundo más importante del tratamiento cuando la terapia de privación de andrógenos (ADT) ha fallado [1-4]. Además de los clásicos, los taxanos paclitaxel y docetaxel, Cabazitaxel se utiliza como agente quimioterapéutico en el tratamiento de pacientes CRPC, este último sobre todo para tratar pacientes con enfermedad resistente Doc [5].
células de detención taxanos en el G2-M fase por hyperstabilization de los microtúbulos que provocó las células a la muerte celular [6]. Además de este efecto, así se describe en las células tumorales hay pruebas convincentes de que la terapia de taxano también interfiere con el receptor de andrógenos (AR) en células de cáncer de próstata [7-11]. Nuestro grupo ha identificado c-jun como un jugador clave importante en esta interacción entre AR y taxanos que afecta el resultado del tratamiento en el estado resistente a la castración de las células del cáncer de próstata.
El factor de transcripción c-Jun es un prototipo oncogén y pertenece a la familia AP-1 que consiste en las jun, fos y ATF-2 subfamilias [12,13]. AP-1 proteínas homo- o heterodimerizan antes de la unión a su sitio diana de DNA. Las proteínas AP-1 son multifuncionales y que participan en la regulación de las señales de respuesta al estrés, el crecimiento celular y la apoptosis [12]. Sin embargo, existen datos que sugieren fuertemente que el c-Jun es un promotor del crecimiento y el proto-oncogén [14,15]. Shemshedini y colaboradores demostraron que, similar a lo observado con otros coactivadores AR, c-jun puede mediar la interacción AR-N-a C para mejorar la unión de ADN [16,17]. Además, fosforilados c-jun está frecuentemente sobreexpresado en los cánceres humanos [18,19] y se ha relacionado con las propiedades invasivas de cáncer de próstata y de mama [18,20,21]. Sin embargo, el papel de la activación de c-jun y la posible interacción con AR en el destino de las células después de la exposición a Doc es parte de una red compleja y aún no se ha dilucidado. Este estudio se realizó para investigar la consecuencia de la interacción de c-jun y AR en tratamiento con taxanos de células de cáncer de próstata resistente a la castración. Para optimizar la eficacia de la quimioterapia con taxanos que necesitamos para identificar una molécula o vía específica que pueden conferir respuesta o resistencia. En el presente estudio hemos tratado de examinar el efecto de los taxanos como agente único o en combinación con bicalutamida en AR y su cofactor c-jun
in vitro
y
in vivo
.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares y reactivos
El cáncer de próstata humano líneas celulares LNCaP y PC-3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). Se generaron células LNb4 en nuestro laboratorio a partir de células LNCaP expuestas a bicalutamida (5 M en el suero reduce a 5%). Las células fueron cultivadas en RPMI (LNCaP) y Hams-F12 (PC-3) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies, Paisley, UK). Las células se trataron con docetaxel (Taxotere®, Sanofi Aventis) y paclitaxel (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Islandia) en la concentración indicada en cada figura. Dihidrotestosterona (DHT) se adquirió de Steraloids Inc. (Newport, RI) y bicalutamida de AstraZeneca (Londres, UK). Todos los reactivos de Western blot se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.), excepto inhibidor de JNK XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Alemania).
Transfección y pequeños ARN de interferencia (siRNA)
transitoria transfecciones con c-jun, mutante de c-jun (c-jun Ala63 /73) y los plásmidos AR (todos amablemente proporcionados por Shao-Yong Chen, Escuela de Medicina de Harvard) en PC-3 células de cáncer de próstata fueron realizadas utilizando Fugene 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemania) según lo recomendado por el fabricante. El mutante c-jun (c-jun Ala63 /73), en el presente documento se hace referencia como juna, utilizados en los experimentos lleva una mutación en el sitio serina 63/73 (Ala63 /73), que es el principal objetivo de la fosforilación por estímulos de estrés. Para los experimentos de siRNA, células LNCaP PC-3 y se transfectaron durante 48 horas con 100 nM siRNA c-jun o no la orientación siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.). La transfección se lleva a cabo utilizando el reactivo de transfección X-tremeGENE siRNA (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Proliferación
La viabilidad celular se define por exclusión con azul de tripano (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ESTADOS UNIDOS). PC-3, las células LNCaP y LNb4 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 25.000 células por pocillo. Después del tratamiento de 24 y 48 horas con Doc o DMSO (Sigma-Aldrich) a las concentraciones indicadas flotante y las células unidas se recogieron por tripsinización. Porciones iguales de suspensiones de células y 0,4% de azul de tripano se mezclaron, y el número de células viables de tripano, azul-excluyendo se contaron usando un hemocitómetro. El porcentaje de células viables se expresa por 100 del total de células (media ± SD). Las células PC-3 transfectadas fueron evaluados mediante el ensayo de MTS. Después de 48 horas de la transfección las células fueron expuestas a Doc o permanecieron sin tratar durante 48 horas más. Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 4 horas, se midió el número de células vivas utilizando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2 - (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS) de ensayo (Celltiter 96 Aqueous One-solución ensayo de proliferación celular, Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de múltiples pocillos (Modelo 680, Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.), con los pocillos que contenían solamente medio que sirven como controles en blanco.
citometría de flujo para el ciclo celular y análisis de apoptosis
distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Brevemente, las células transfectadas se trataron con Doc durante 48 horas y se fijaron y tiñeron con yoduro de propidio durante 40 minutos. fueron cerrada Las células viables, y el contenido de ADN de al menos 10 000 células marcadas se cuantificó con un clasificador de células activadas por fluorescencia. La apoptosis se determinó por anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y tinción con 7-AAD (BD Pharmingen de BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). Las células fueron tratadas con el Doc durante 48 y 72 horas y las células teñidas se sometieron a análisis de citometría de flujo en un instrumento FACSCalibur (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). Los datos presentados se obtuvieron a partir de dos experimentos independientes en los duplicados y se analizaron utilizando el software de FCS Express (DeNovo Software, Los Ángeles, CA, EE.UU.).
El análisis de Western Blot e inmunoprecipitación
Para la proteína total Western blot se extrae usando un ensayo de radioinmunoprecipitación tampón (RIPA) (50 mmol /l de Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, 1 % de NP40, 0,1% de SDS, 1 mM Na3VO4, NaF 1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) suplementado con el cóctel inhibidor de proteasa completo Mini (Roche, Mannheim, Alemania). La concentración total de proteínas se midió usando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Las muestras de proteína (20 a 30 g) se cargaron en 4-12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Bio-Rad ensayo (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y se sometieron a análisis electroforético y transferencia. Las membranas se sondaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-AR (441 y N-20), anti-c-jun, anti-p-cJun (ser 63/73), y anti-β-actina, todo adquirido de Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PSA (Dako, Glostrup, Dinamarca), p-JNK de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos secundarios (IRDye 680, IRDye 800) se obtuvieron de Li-Cor Biotecnología (Nebraska, EE.UU.) y proteínas detectadas por el sistema óptico de infrarrojos Odyssey.
Para las células de inmunoprecipitación fueron tratados como se indica y se recogieron en tampón de lisis. Los lisados celulares se homogeneizaron, contenido de proteína medidos y 500 g de proteína precleared se incubó con anticuerpo anti-AR a 4 ° C durante la noche con agitación continua. Igual cantidad de IgG de ratón se utilizó como control negativo. Proteína G cuentas (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) se añade a cada muestra y se incubaron a 4 ° C durante 2 horas. Las muestras se centrifugaron a 2000 x g 2 min y tampón de muestra de Laemmli (30 l) sin β-mercaptoetanol y la mezcla se incubó a 65 ° C durante 15 minutos para eluir las proteínas unidas. fracciones de eluato se centrifugaron a 2000 x g, se añadió 1μl de β-mercaptoetanol y las muestras se sometieron a transferencia de Western como se describe anteriormente. La expresión de proteínas se evaluó en relación con ß-actina la expresión mediante análisis densitométrico.
cuantitativa en tiempo real el análisis de PCR
ARN total fue aislado de las células LNCaP y LNb4 utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, Reino Unido) siguiendo el protocolo de los fabricantes y se trató con DNasa libre de RNasa (DNasa I; Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Suecia) para eliminar los posibles contaminantes de ADN genómico. Cada ADNc fue sintetizado por transcripción inversa a partir de 1 g de ARN total usando el Sistema StrataScript primer capítulo de síntesis y cebadores hexámeros aleatorios (Stratagene; diagnósticos AH, Estocolmo, Suecia). PCR en tiempo real se realizó con SYBR Green QPCR mezcla maestra (iScript de BioRad) en un sistema de detección MX 3000P (Stratagene) con una etapa de iniciación a 95 ° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 1 minuto y 72 ° C durante 1 minuto.
Se utilizaron los siguientes cebadores para cada gen: PSA (F5'-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 'y R5'-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3'), AR (F-5 'GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3' y R5 'GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 '), GAPDH (5' -CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA-3 'y 5'-AGG GGT CTA CAT GGCAACTG-3'), c-jun (F-5 'GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 y R5 'GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 '), Nkx3.1 (F 5'-3' GTACCTGTCGGCCCCTGAACG y R5'-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3 '), c-Myc (F 5'-3' y GGCGGGCACTTTGCACTGGA-R5'- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3 '), KLK2 (F 5'-AGATGAAGACTCC-AGCCAT-3' y 5'-R GATACCTTGAAGCACACCA 3 '), β-actina (F 5'-CGTGG- GGCGCCCCAG 3' y 5'-R TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG - 3 ').
la cantidad de ARNm se determinó utilizando el comparativo C
T método. Las muestras se analizaron por triplicado y los datos en comparación con la expresión de mRNA en el control no tratado que fue establecido como un valor de referencia.
Animales y la inoculación del tumor
De cuatro a seis semanas de edad de sexo masculino ratones NMRI desnuda de Taconic Europa (Lille Skensved, Dinamarca) se utilizaron en el experimento. El modelo de xenoinjerto se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado específicamente por el Comité de Ética de la Universidad de Lund (número de autorización M 239-10). Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con las directrices dadas por el Comité Ético de Malmö-Lund. Se inyectaron células LNCaP (2x10
6 células) por vía subcutánea en ambos flancos resultan en dos tumores por ratón. Después de tumores han desarrollado se realizó la castración quirúrgica. Los animales fueron asignados en 6 grupos: los ratones fueron tratados con vehículo, Doc, Pac o bicalutamida como agente único y Doc o Pac combinado con bicalutamida. Los fármacos se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) (a 20 mg /kg) en 100 l de volumen una vez a la semana durante 5 semanas a excepción de bicalutamida que se administró dos veces por semana. En el punto de tiempo designado semanas 0, se inició el tratamiento y los ratones se sacrificaron una semana después del último tratamiento. Los tumores se cosecharon, se fijaron en formalina y embebidos en parafina para el análisis inmunohistoquímico.
Inmunohistoquímica
xenoinjertos de tumores disecados se fijaron en 4% de paraformaldehído y posteriormente se incluyeron en parafina. Cuatro micras de espesor secciones se deparaffinized, rehidratada y microondas tratados durante 10 minutos en un pH elevado solución de recuperación diana (Dako, Glostrup, Dinamarca) antes de ser procesado en Techmate 500 máquina automática tinción inmunohistoquímica (Dako) utilizando anticuerpos contra la AR, c-jun, p -cjun, y Ki-67 (Dako). DAB (3,3'-diaminobenzidina) se utilizó como un sustrato cromogénico y se desliza se contratiñeron con hematoxilina. Los especímenes fueron vistos con un microscopio Olympus 70 AX con un aumento de x 10. Se aplicó una puntuación semicuantitativo arbitraria para evaluar las señales de tinción y marcó en tres categorías; tinción negativa (0), débil pero detectable tinción de algunas o de todas las células (1), la tinción moderada (2) o fuerte tinción (3). Al menos dos secciones por tumor se determinaron y los resultados fueron representativos de al menos el 70% de la superficie de tejido analizado.
Sub-celular fraccionamiento
fraccionamiento celular se realizó de acuerdo con el protocolo suministrado con los reactivos de extracción nucleares y citoplasmáticas NE-PER (Pierce, Rockford, IL). las células LNCaP se expusieron a Doc o Pac de 6, 24 y 48 horas o permanecieron sin tratar. Las fracciones se hirvieron con tampón de muestra SDS, se sometieron a SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondearon como se indica con anticuerpos primarios a AR, β-actina o lamina A, todos de Santa Cruz, seguido por anticuerpos secundarios (IRDye 680, IRDye 800), que se obtiene a partir de Li-Cor Biotecnología (Nebraska, EE.UU.). Las proteínas se detectaron por el sistema óptico de infrarrojos Odyssey.
Análisis estadístico
Los resultados se obtuvieron a partir de al menos tres experimentos realizados y se expresan como la media ± desviación estándar. La significación estadística se determinó con la prueba t de Student para datos independientes. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
resistencia a la sobreexpresión de c-Jun inducida al tratamiento Doc
La función de c-jun como un factor de transcripción relacionados con la proliferación ha sido reportado en el cáncer de próstata antes [22 ]. Para investigar el impacto de c-jun en células de cáncer de próstata tratados Doc, los experimentos se llevaron a cabo en LNCaP, LNb4 y células PC-3. Hemos observado que las células LNCaP tratadas con Doc eran más resistentes al tratamiento en los puntos de tiempo indicados en comparación con células PC-3 (30% vs 9%, p = 0,003) (Figura 1A). A pesar de que no detectó una diferencia estadísticamente significativa entre LNCaP y LNb4 pudimos ver una tendencia que el tratamiento a largo plazo con bicalutamida aumenta la resistencia (Figura 1A). Además el análisis de apoptosis se realizó mediante el uso de anexina V /7AAD confirmando menos apoptosis en las células expuestas a LNb4 Doc comparación con las células LNCaP parentales
(A) La viabilidad celular examinado por exclusión de azul de tripano en LNCaP (LN), LNb4 y PC células -3. (B) Determinación de la apoptosis por citometría de flujo. Después del tratamiento de las células con Doc, el grado de apoptosis se evaluó mediante el ensayo de anexina V /7AAD. (C) MTS ensayo en células PC-3 transfectadas como se indica en la figura y tratada 48 horas con 5 nM Doc. (D) Los gráficos de citometría de flujo en células mencionadas en (C) que demuestra la población de células de ciclo tiñó con yoduro de propidio. Las células se trataron con Doc durante 48 h o permanecieron sin tratar y ordenados en diferentes etapas de la mitosis por citometría de flujo. (E) Análisis de transferencia de Western para mostrar la expresión de proteínas en las células transfectadas mencionadas en (C). (F) Análisis de la interacción proteína-proteína se determina por inmunoprecipitación en presencia o ausencia de Doc o Pac en células LN y LNb4. Las células se inmunoprecipitaron con anti-AR (441) de anticuerpos y las membranas se sondaron con anticuerpo anti-c-jun. Para el control, se usó 20 g de lisado celular como entrada y la igualdad de carga fue confimed con anticuerpo AR.
(Figura 1B). Para examinar si c-jun está implicado en la respuesta a la terapia Doc, las células PC-3 fueron transfectadas con c-jun, c-jun mutante (juna) y co-transfectadas con AR (AR /c-jun, AR /Juna, respectivamente) plásmidos y ensayo de MTS llevaron a cabo. Células PC-3 transfectadas con juna mostraron un aumento estadísticamente significativo (p = 0,01, juna vs control) en la proliferación celular (Figura 1C), mientras que la transfección con AR disminución de la viabilidad celular comparable a Doc células tratadas de control. Aunque no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las células de control tratadas Doc y transfectadas las células c-Jun PC-3 había una clara tendencia a una mayor viabilidad en el segundo. Curiosamente, la co-transfección de AR en células PC-3 que sobreexpresan de c-jun o juna no abroga este efecto sobre la proliferación (Figura 1C), sugiriendo un papel de c-jun como un factor antiapoptótico potente. Entonces se llevó a cabo análisis del ciclo celular y se muestra la detención celular en la fase G2-M en tratados Doc células PC-3 (Figura 1D). Hemos observado que células PC-3 transfectadas con AR o juna mostraron una tendencia similar con una marcada disminución de porcentaje de células en fase G2-M (18,6% y 19,9%, respectivamente), mientras que se incrementó la fase S (43 , 4% y 43,5%, respectivamente), lo que sugiere que la fosforilación de c-jun juega un papel crucial en la respuesta celular a Doc (Figura 1D).
A continuación examinó la expresión de la proteína en las células PC-3 transfectadas. análisis de transferencia Western mostró un marcado incremento en la proteína AR en las células co-transfectadas con AR /cJun comparación con las células transfectadas con AR solo o AR /juna (Figura 1E). Estos resultados sugieren que la interacción entre AR y c-jun es dependiente del sitio de fosforilación disponible 63/73. A fin de evaluar el efecto de los agentes de taxano en endógena c-jun y AR inmunoprecipitación se realizó en LNCaP y LNb4. Encontramos una interacción entre AR y c-jun en ambos tipos de células, las cuales se mejoró por Doc y el tratamiento Pac (Figura 1F). Estos resultados confirman que existe una interacción física entre c-jun y AR que regula el efecto de la terapia de taxano en las células PC.
Efectos de c-jun siRNA sobre la respuesta Doc
Para investigar si la regulación a la baja de c-jun puede alterar la respuesta celular a la PC Doc transfectadas las células PC-3 y LNCaP con siRNA o nontargeted siRNA, el cual sirvió como control (Figura 2A). Las células se expusieron a Doc durante 24 o 48 horas y se sometieron a ensayo de MTS. c-jun se downregulated significativamente aunque no completamente disminuido en ambas líneas celulares (Figura 2A). células LNCaP silenciados con siRNA mostraron una clara disminución de la viabilidad después de 24 horas a la exposición Doc comparación con las células LNCaP parentales (p = 0,002). En las células PC-3 no se observó un cambio significativo en la viabilidad celular en el mismo punto de tiempo. Después de 48 horas el efecto de c-jun disminuyó silenciamiento y células recuperadas como se muestra en la Figura 2B.
(A) análisis de transferencia de Western que muestra la eficiencia de transfección de ARNsi c-jun en células PC-3 y LNCaP. (B) La proliferación celular en LNCaP (panel superior) y las células transfectadas con c-jun siRNA o vector (control) nontargeted PC-3 (panel inferior). Las células se trataron con Doc durante 24 y 48 horas. células LNCaP albergan c-jun siRNA mostró una disminución significativa en la proliferación (p = 0,002) mientras que las células PC-3 no se vieron afectados.
expresión de P-cJun taxano inducida es independiente en vía de JNK en células PC
Se ha informado de que la quimioterapia Doc induce su efecto a través de la activación de JNK selectivamente en células de cáncer [23] . Una vez activado, JNK fosforila y activa una serie de factores de transcripción tales como c-jun. Para abordar esta cuestión hemos analizado si la vía de señalización de JNK tiene un papel en la muerte de las células del cáncer de próstata inducida Doc. las células PC-3 y LNCaP fueron tratadas con 500 nM de inhibidor de JNK para 2 o 8 horas, mientras que Doc y Pac células realizadas en los puntos de tiempo 2, 4, 8 y 24 horas tratados. Como se muestra en la Figura 3A fosforilación de c-jun se indujo 2 horas después de la exposición a Doc en las células PC-3, mientras que la fosforilación de JNK apareció 24 horas después de la exposición en las células PC-3 solamente (Figura 3A). En las células LNCaP expuestas a Doc se observaron cambios notables en la fosforilación de JNK en cualquier punto del tratamiento farmacológico (Figura 3B) el tiempo. Esto sugiere que la activación de JNK puede ser un efecto secundario del tratamiento Doc y la fosforilación de c-jun es un objetivo principal de Doc. Especialmente en AR expresan las células LNCaP, una interacción directa con AR que causa una rápida inducción de la fosforilación de c-jun no se puede excluir. Además, se obtuvieron resultados similares en las células mencionadas anteriormente expuestas a Pac (Figura no mostrados). Vale la pena mencionar que un nivel basal de p-c-jun en células no tratadas se expresó en ambas líneas celulares.
análisis de transferencia Western de las células PC-3 y LNCaP (B) (A) expuestos a Doc ( 5 nM) durante hasta 24 horas o permaneció sin tratar (0). las células PC-3 y LNCaP fueron sembradas en placas de 24 pocillos a una densidad de 50.000 células por pocillo y se trataron con Doc y Pac o en combinación con 500 nM de inhibidor de JNK (SB) como se indica.
agentes de taxano alteran los niveles de proteína de AR y PSA
Otros experimentos se llevaron a cabo exclusivamente en las células LNCaP y LNb4 solamente. Basado en nuestro resultado anterior se examinaron con más detalle cómo la terapia de taxano afecta a la expresión de genes regulados AR tales como PSA en el nivel de proteína. Se observó un aumento concomitante de los niveles de AR y de la proteína PSA en las células LNCaP tratadas Doc (p = 0,01, Doc 24 vs control) (Figura 4A). Sin embargo, en Pac tratado células LNCaP una disminución gradual de la proteína de AR se observó de forma concomitante con el nivel de PSA después de 48 horas (Figura 4A). Curiosamente, el aumento del nivel de proteínas en las células AR LNb4 fue más pronunciada por el tratamiento Doc, mientras que el nivel de proteína PSA se redujo claramente después de 48 horas (p = 0.02, Doc Doc 24 vs 48). La exposición de células a LNb4 Pac condujo a una marcada disminución de la expresión de la proteína AR y PSA (Figura 4B). Expresión de p-cJun difería en LNCaP y LNb4 (Figura 4C, D). En las células LNCaP tratamiento Doc aumento de la expresión de p-c-jun gradualmente (p = 0,04, Doc 6 vs Doc 48), mientras que en las células Pac tratados se observó un aumento a las 24 horas, que fue seguido por una marcada disminución a las 48 horas (Figura 4C) . Sin embargo, las células en el tratamiento LNb4 Pac resultó en una inducción dependiente del tiempo de p-c-jun, mientras que el tratamiento Doc no lo hizo (Figura 4D). No se observaron cambios notables en los niveles de c-jun en ambas líneas celulares y bajo todas las condiciones examinadas.
análisis de transferencia Western de la expresión de AR y PSA en las células (A) y LNCaP LNb4 (B). Las células expuestas a 5 nM de Doc, 5 nM de Pac o 10 nM de DHT durante un máximo de 48 horas o se mantuvo sin tratar. Los mismos lisados se utilizaron para analizar la expresión de p-cJun y c-jun en LNCaP (C) y las células LNb4 (D). los niveles de expresión de proteínas se evaluaron mediante análisis densitométrico (paneles inferiores).
Efecto del tratamiento con taxanos en la expresión de c-jun y ARNm del RA
Para investigar los cambios de ARN debido al tratamiento con taxanos, QRT-PCR se llevó a cabo en las células LNCaP y LNb4. Las células fueron tratadas como se indica en la Figura 5. Aunque se observó una inducción inicial de la AR y el ARNm de PSA en células LNCaP tratadas Doc, esto no ocurrió en el tratamiento de APA. Curiosamente, las células LNb4 mostraron un aumento continuo de la expresión de AR ARNm de una manera dependiente del tiempo cuando se tratan con Doc, mientras que PSA mRNA se correlacionó negativamente a la expresión AR ARNm (Figura 5A). Hubo una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de AR y PSA mRNA a las 24 y 48 horas de exposición a Doc (p = 0,05 y p = 0,003, respectivamente). Sin embargo, en Pac células tratadas LNb4 se observó una inducción inicial de AR y PSA ARNm que se redujo a un nivel significativo después de 48 horas. Por el contrario, la expresión de ARNm de c-jun aumentó significativamente en las células tratadas con Pac LNb4 (p = 0,03), que no se pudo demostrar en las células tratadas con Doc (Figura 5B). Como la expresión de mRNA KLK2 esperado mostró un patrón similar como PSA mRNA en todas las células tratadas. los nuevos análisis en c-myc y se realizó Nkx3.1 como se muestra en la Figura 5B. Los resultados no muestran ninguna tendencia significativa en la expresión de c-Myc mRNA independientemente de taxano utilizado y el tiempo de tratamiento. Sin embargo se observó un incremento en la expresión de Nkx3.1 mRNA en todas las células tratadas DOC, mientras que éste era menos pronunciado en las células Pac tratados (Figura 5B).
La expresión de AR (A) y PSA y (B) c -jun, KLK2, Nkx3.1 y c-Myc los niveles de mRNA en respuesta a Doc o Pac se evaluó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). El nivel de expresión de ARNm media relativa de los genes regulados AR se midió por cuantitativa en tiempo real RT-PCR por triplicado.
Para resumir nuestros resultados muestran una clara correlación entre la AR, c-jun y PSA en las células tratadas con taxanos. El resultado del tratamiento depende de la situación del receptor de AR y la expresión de ARNm c-jun y el taxano usado.
Animal modelo
Para evaluar la respuesta terapéutica de la línea celular de cáncer de próstata LNCaP in vivo establecimos un modelo animal, como se indica en la Figura 5. Los ratones fueron tratados con Doc o Pac como agente único o en combinación con bicalutamida. Una reducción significativa en el tamaño statisitically tumor de ratones tratados con Doc solo se muestra (p = 0,04, Doc vs ctr) (Figura 6A). En los ratones tratados con Pac una estabilización pero no disminución en el volumen del tumor se observó (Figura 6A). No hubo diferencia significativa entre los ratones y los ratones tratados Doc recibir tratamiento combinado con bicalutamida (Figura 6C). Curiosamente, los tumores en los ratones tratados con Pac y tumores de bicalutamida comenzaron a crecer de nuevo después de una estabilización inicial (Figura 6C). Hubo una reducción del tamaño del tumor estadísticamente significativa en el Doc /bic comparación con los ratones tratados Pac /BIC (p = 0,003).
(A) Curva de crecimiento de los ratones tratados con el Doc o Pac solo, Doc vs CTR (p = 0,04). (B) tinción inmunohistoquímica correspondiente de tejido tumoral. curva (C) Crecimiento de los ratones con el tratamiento combinado, Doc /bicalutamida (BIC) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) la tinción inmunohistoquímica correspondiente de tejido tumoral. Tenga en cuenta que p-cJun se expresó diferencialmente en ratones tratados con Doc y Pac. expresión de Ki67 fue mayor en Pac en comparación con los ratones tratados Doc.
A continuación examinó la expresión de c-jun, c-jun-p, proteínas AR y Ki67 en los tejidos tumorales recogidas para evaluar el efecto del tratamiento farmacológico. No hubo un cambio significativo en los niveles de AR nucleares en los animales tratados con Doc solo o Doc /bic (Figura 6B y 6D, respectivamente). En ambos grupos de tratamiento de aproximadamente 60% de la población de células muestra una translocación citoplasmática de AR, en comparación con los ratones en el grupo control (Figura 6B). En contraste, los ratones tratados con Pac o terapia de combinación la translocación citoplasmática de AR fue menos pronunciado. Sin embargo, la expresión de p-cJun en los tejidos de los animales de control muestra una tinción intensa, mientras que se observó que la p-cJun nuclear era más clara en los ratones tratados Pac en comparación con los animales tratados Doc donde también se encontró una expresión citoplásmica (Figura 6B). Ningún cambio significativo en el patrón de expresión de c-Jun se observó en animales control y tratados. expresión de Ki67 fue más pronunciado en Pac ratones que refleja la pobre respuesta de los tumores a este taxano en vivo tratado.
Para confirmar la translocación citoplasmática de AR por la terapia de taxano in vitro, los experimentos de transferencia Western se realizaron en células LNCaP ( Figura S1). De acuerdo con los datos in vivo se demostró que independiente sobre el taxano utilizado AR se transloca al citoplasma. La translocación fue más pronunciado en las células tratadas con Doc (panel superior) en comparación con las células tratadas Pac (panel inferior), especialmente después de 48 horas de tratamiento.
Discusión
En este estudio, hemos aclarado la papel de la AR y su coactivador c-jun en la respuesta de las células PC a la terapia de taxano. Hemos demostrado que la sobreexpresión de c-jun en células PC-3 confiere una estadísticamente significativa mayor resistencia al tratamiento Doc comparación con las células co-transfectadas con AR /c-jun o AR solo. células LNCaP fueron más resistentes a Doc en presencia o ausencia de la bicalutamida en comparación con células PC-3. La transfección con el mutante juna aumentó la viabilidad, lo que sugiere que c-jun y el sitio de fosforilación 63/73 es un regulador clave de la respuesta celular a los taxanos en PC. Hemos demostrado por primera vez que el tratamiento Doc y Pac afecta de manera diferente de proteína y niveles de ARNm de AR y PSA en las células LNCaP y LNb4 parentales. Estas diferencias se reflejaron en el crecimiento tumoral en el modelo de ratón. Los resultados presentados aquí proporcionan evidencia de que el efecto del tratamiento taxano es fuertemente dependiente de la condición c-jun y AR de la línea celular utilizada y de la fármaco utilizado para el tratamiento.
Se sabe que la AP-1 factor de transcripción es multifuncional y, a veces polémico discutido en la literatura [24]. c-jun se ha demostrado para transducir una respuesta mitogénica y para promover el crecimiento de células como un solo gen o en cooperación con un ras gen activado [25,26]. Por consiguiente, hemos encontrado que la sobreexpresión de c-jun (mutante juna) confiere resistencia a las células PC-3 a la terapia Doc. Curiosamente, juna se encontró que era más potente en la prevención de la muerte celular en comparación con AR que sugiere que el sitio de fosforilación 63/73 es crucial para la interacción y la estabilización de los complejos de AR y c-jun. Este resultado está en línea con los informes anteriores estudios que indican que c-jun puede actuar como un factor antiapoptótico en lugar de proapoptótico en contexto con la exposición a agentes quimioterapéuticos [14,27].