Extracto
mutaciones de la línea germinal de
FH
, el gen que codifica para la TCA ácido tricarboxílico (TCA) de la enzima ciclo de fumarato hidratasa, se asocia con una forma hereditaria de cáncer hereditario conocido como Leiomiomatosis y cáncer de células renales (HLRCC). Los individuos con HLRCC están predispuestos al desarrollo de carcinoma de células renales altamente maligno y letal (RCC). Los mecanismos de tumorigénesis propuestas se han centrado en gran medida de las consecuencias bioquímicas de la pérdida de actividad enzimática FH. Mientras que la pérdida del gen supresor de tumores
Hippel Lindau von gratis (
BVS
) se piensa que es un suceso iniciador para la mayoría de los CRC, un papel para el
Hoteles en FH esporádica cáncer renal no ha sido explorado. Aquí mostramos que FH ARNm y la expresión de la proteína se reducen en el cáncer renal de células claras, la variante histológica más común de cáncer de riñón. Por otra parte, hemos demostrado que la reducción de
FH
conduce a la acumulación de factor inducible por hipoxia 2α (HIF-2α), un factor de transcripción conocido por promover la carcinogénesis renal. Por último, demostrar que la sobreexpresión de la HF en las células de cáncer renal inhibe la migración celular y la invasión. Estos datos proporcionan nuevos conocimientos sobre las funciones supresoras de tumores de cáncer de riñón en FH esporádica
Visto:. Sudarshan S, Shanmugasundaram K, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O'Neill CF, et al. (2011) La reducción de expresión de fumarato Hidratasa de células claras cáncer renal media la HIF-2α Acumulación y promueve la migración y la invasión. PLoS ONE 6 (6): e21037. doi: 10.1371 /journal.pone.0021037
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Enero, 2011; Aceptado: 17-may de 2011; Publicado: 14 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Sudarshan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Terapia e Investigación del cáncer (CITC) de la Universidad de Texas Health Science Center (Institutos nacionales de la Salud CA054174-17 P30). SS es apoyado por el NIH K08 CA138774, Fondo Young Investigator Award Voelcker, AUA Fundación /Premio Astellas Rising Star, y un regalo especial de Sr. Charles Butt y los empleados de HEB. SLN es apoyado por el NIH CA86402 CITC y U01. LZS está apoyado por el NIH R01 CA079683. KB es apoyado por los Veteranos Premio Administración de Desarrollo de Carrera (CDA-2) y el NIH R01 CA131272 NCI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En 2010, más de 57.000 hombres y mujeres será diagnosticada con carcinoma de células renales (CCR) y 13.000 personas morirán de esta enfermedad [1]. Aunque la supervivencia para los pacientes con enfermedad localizada es alta, los pacientes con enfermedad avanzada se enfrentan a un mal pronóstico a pesar agentes dirigidos recientemente introducidos. A pesar de la pérdida de la
Hippel Lindau von gratis (
BVS
) gen supresor de tumores se piensa que es un suceso iniciador para la mayoría de los CCR [2], se sabe poco acerca de los eventos genéticos posteriores y su impacto correspondiente en la tumorigénesis. La elucidación de estas vías será identificar nuevas dianas terapéuticas, así como facilitar el desarrollo de biomarcadores que pueden tener tanto significado diagnóstico y pronóstico.
mutaciones de la línea germinal de
FH
se asocian con una forma hereditaria de cáncer renal que se refiere como hereditaria Leiomiomatosis y cáncer de células renales (HLRCC) [3], [4].
FH
codifica el ciclo del ácido tricarboxílico fumarato hidratasa enzima (también referido como fumarasa) que cataliza la hidratación de fumarato para formar malato. Los individuos con HLRCC están predispuestos al desarrollo de los leiomiomas de la piel y el útero, además de RCC altamente maligno y letal. Los mecanismos de tumorigénesis propuestas se han centrado en gran medida de las consecuencias bioquímicas de la pérdida de actividad enzimática FH. Se ha propuesto que la pérdida de FH conduce a fumarato acumulación y promueve un estado pseudohypoxic en el que las vías de respuesta a la hipoxia se activan aberrantemente pesar de las condiciones de normoxia [5]. Fumarato se ha demostrado que inhiben la hidroxilación de prolina de la hipoxia factores inducibles HIF-1α y HIF-2α que son catalizadas por una familia de enzimas conocidas como las hidroxilasas de HIF prolil (PHDs) [5]. En su forma no hidroxilada, HIFαs evitar el reconocimiento por la ubiquitina ligasa E3 VHL (que se dirige a estas proteínas para la degradación proteosomal) y así se estabilizan [6], [7], [8], [9]. En estas condiciones, ya sea HIF-1α o HIF-2α son capaces de heterodimerizar con la proteína HIF-1β expresado constitutivamente, también conocido como ARNT (revisado recientemente [10]). Este heterocomplejo es capaz de activar transcripcionalmente varios genes, incluyendo
VEGF
y otros factores de crecimiento que pueden ser pro-tumorigénico cuando están alteradas. Pseudohipoxia también se ha implicado en la variante más común de RCC, carcinoma de células claras (ccRCC), en el que la pérdida de
VHL
es un evento genético común [11]. Como era de esperar, los niveles elevados de HIF-1α y /o HIF-2α se observan en los cánceres renales de células claras [12], [13]. Curiosamente, varias líneas de evidencia indican que HIF-2α en lugar de HIF-1α, es fundamental para la formación y /o la progresión [14] El CCR, [15], [16].
Mientras que
BVS
pérdida es claramente esencial para la estabilización de HIF-2α, mecanismos alternativos, además de la prevención de la degradación, pueden jugar un papel en el mantenimiento de HIF-2α en el cáncer renal. Anteriores trabajos de bloque
et al.
establecido un papel para las especies de oxígeno reactivas (ROS) generadas por NADPH oxidasas en el mantenimiento de la expresión de proteína HIF-2α través de un mecanismo de traslación de ARNm AKT-dependiente en células deficitarias de VHL [17] . Además, mTOR complejo de señalización 2 (mTORC2), un activador conocido de la señalización de AKT, se ha demostrado que la promoción de la acumulación de HIF-2α en
BVS
células de carcinoma renal null [18]. Más recientemente, el tratamiento de células de RCC con un inhibidor dual PI3K /mTOR suprimió la expresión de HIF-2α [19]. Estos datos apoyan la noción de que la síntesis de HIF-2α en curso es fundamental para el mantenimiento de este factor de transcripción oncogénica en células de cáncer renal.
FH
mutaciones han sido principalmente relacionado con el cáncer renal papilar de tipo II , una variante histológica que representa menos del 10% de todos los cánceres renales [20].
FH
mutaciones no han sido identificados en el cáncer renal de células claras esporádico. Sin embargo, un informe reciente ha ligado
FH
al desarrollo de cáncer renal de células claras en un paciente con una mutación germinal de
FH
[21]. Hasta la fecha, la expresión y función de
FH Hoteles en ccRCC no ha examinado. Por lo tanto, hemos investigado el papel de la HF en el cáncer renal de células claras esporádico.
Resultados
La reducción de expresión de la HF en células claras carcinoma renal
expresión FH en ccRCC tiene todavía ser explorado. Por lo tanto, lo primero que examinó la expresión de la proteína de la HF en un panel de tumores renales de células claras humanos y el parénquima renal normal paciente compatible. El análisis por inmunotransferencia de lisados de tejido demostró una marcada reducción de los niveles de proteína FH en los tumores en comparación con el tejido normal adyacente (Figura 1A). Para confirmar nuestros hallazgos, se realizó la tinción inmunohistoquímica para FH en los pares de tumor /normal de pacientes emparejados. Estos resultados se correlacionaron con los resultados de inmunotransferencia en que la tinción para FH fue menor en los tumores en relación con el control de tejido renal (Figura 1B). A continuación examinó los niveles de proteína FH en un panel de líneas celulares establecidas ccRCC (786-O, A498, RCC4, y ACHN). Todas las líneas celulares cultivadas demostrado un descenso de los niveles de proteína en relación con FH renal normal (Figura 1C). A continuación, examinó los niveles de expresión de ARNm de
FH
en el tejido tumoral en comparación con el tejido renal normal paciente con ajuste en especímenes de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (NCI). cuantitativa en tiempo real RT-PCR demostrado un descenso de
FH
los niveles de ARNm en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal (Figura 2). Análisis de los niveles de mRNA revela que más del 70% de las muestras tumorales demostrado un descenso de
FH
los niveles de mRNA en relación con el parénquima renal emparejado normal. Por otra parte, 15/32 muestras de los pacientes (47%) demostraron una reducción de más del doble en
FH
niveles de mRNA en muestras tumorales con respecto al control normal. En general, la reducción media de
FH
niveles de mRNA fue de 2,9 veces. Esta diferencia se determinó que era estadísticamente significativa. Estos resultados muestran una disminución de la expresión de
FH
en los niveles de ARNm y proteínas en ccRCC.
A) La proteína se aisló de muestras de células claras (CC) del tumor (T), además de renal normal emparejado parénquima (N). Las proteínas se sometieron a inmunotransferencia de los niveles de proteína FH. inmunoblot GAPDH se incluye como control de carga. B) La tinción inmunohistoquímica para la HF se realizó en pares de tumor /normal de pacientes emparejados. Las imágenes se obtuvieron con una lente de objetivo 40 ×. C) los niveles de proteína FH en líneas de RCC en relación con el riñón normal. Actina se incluyó como control de carga.
niveles de mRNA de
FH
se determinaron en un conjunto separado de muestras tumorales con respecto a paciente parénquima renal normal emparejado con el tiempo real de RT-PCR ( p = 0,004). Los niveles de expresión se normalizaron a 18 s rRNA niveles antes del análisis comparativo.
FH modula los niveles de HIF-2α
Los altos niveles de fumarato en FH deficientes RCC juegan un papel en la estabilización de HIF expresión de la proteína -2α través de la inhibición de la actividad prolinhidroxilasa evitando de este modo el reconocimiento de la BVS. Sobre la base de estos datos, la hipótesis de que la pérdida de la HF debería tener ningún impacto en los niveles de proteína HIF en
BVS
líneas celulares nulos. Sin embargo, encontramos que desmontables de siRNA mediada por FH dio lugar a un nuevo aumento de los niveles de proteína HIF-2α en dos líneas ccRCC que son
BVS
nula (786-O y A498) (Figura 3A). En apoyo de estos resultados, la sobreexpresión transitoria de FH bandera de etiquetado (FH-FLAG) redujo los niveles de HIF-2α en células 786-S (Figura 3B). En conjunto, esto sugiere que la historia familiar modula la expresión de la proteína HIF-2α en ausencia de la BVS.
A)
BVS
nulos células 786-S y A498 fueron cortados transversalmente con siRNA para FH y control de mezcla aleatoria ( SINC). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, lisados de proteínas se analizaron por inmunotransferencia para las proteínas indicadas. B) Las células 786-S fueron transfectadas transitoriamente con el vector de control (CV) y el vector que contiene FLAG etiquetados FH. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, lisados de proteínas se analizaron por inmunotransferencia para las proteínas indicadas. inmunoblot FLAG indica la expresión exitosa del transgén. ()) células 786-O Izquierda C fueron transfectadas de forma estable con la CV y FH-FLAG. Después de la selección en puromicina, clones de células individuales se cosecharon y se seleccionaron para la expresión FLAG. los niveles de HIF-2α se midieron en FH-FLAG expresando clones en relación con células CV transfectadas. Densitometría de las bandas se muestra cuantitativamente a la derecha. La media de los valores relativos +/- desviación estándar se obtuvieron con el software ImageJ a partir de experimentos independientes.
A fin de dilucidar el mecanismo por el cual FH regular la expresión de la proteína HIF-2α, creamos líneas celulares estables que sobreexpresan FH-FLAG en células 786-O deficitarias de VHL. Se identificaron 3 clones que expresaban de forma estable el constructo FH-FLAG. Todos los 3 clones mostraron niveles reducidos de HIF-2α en comparación con las células transfectadas de control del vector (Figura 3C). Inicialmente se consideró si los efectos sobre HIF-2α se mediada transcripcionalmente, sin embargo no se detectaron reducciones en los niveles de ARNm de HIF-2α con HF sobreexpresión (datos no mostrados).
pérdida FH activa AKT señalización
informes recientes han implicado la señalización PI3K /AKT en el mantenimiento de expresión de la proteína HIF-2α en
BVS
células nulas a través de un mecanismo de traducción [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Sobre la base de estos informes, se analizó la señalización de AKT con la modulación FH. Encontramos que desmontables siRNA mediada de
FH
tanto en las células 786-O y A498 resultados en aumento de la fosforilación de AKT en la serina 473 de AKT (Figura 4A). Correspondientemente, la sobreexpresión de FH rebajado fosfo-AKT niveles en células 786-O (Figura 4B), indicando que los niveles de FH se correlacionan inversamente con la señalización de AKT. A continuación examinó los efectos de la inhibición de PI3K en la expresión de la proteína HIF-2α FH-dependiente. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, FH señalización AKT caída activado y aumento de los niveles de HIF-2α compararon para codificar las células transfectadas (SINC) (Figura 4C). Sin embargo, el cotratamiento de las células transfectadas con el inhibidor de PI3K LY-294002 bloqueó el aumento de HIF-2α asociado con FH desmontables (Figura 4C). En conjunto, esto sugiere que la historia familiar mantiene expresión de la proteína HIF-2α a través de mecanismos dependientes de PI3K y AKT señalización.
A)
BVS
nulos células 786-S y A498 fueron transfectadas con siRNA para FH y control de mezcla aleatoria (SINC). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, lisados de proteínas se analizaron por inmunotransferencia para el total de AKT y Ser473 fosfo-AKT. B) Las células 786-S fueron transfectadas transitoriamente con el vector de control (CV) y el vector que contiene FLAG etiquetados FH. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, lisados de proteínas se analizaron por inmunotransferencia para las proteínas indicadas. ) células C 786-O fueron transfectadas con el ARNsi se indica. Veinticuatro horas después de la transfección, los medios de las células se reemplazó con medio que contenía inhibidor de PI3K LY-294002 (6,25 M). Las células fueron cosechadas 24 horas después y la proteína lisados fueron sometidos a análisis de inmunoblot para las proteínas indicadas.
expresión FH media la migración celular y la invasión
Las consecuencias biológicas de FH sobreexpresión en RCC se examinaron próxima células.
FH
tumores nulos son altamente invasivos y tumores metastásicos a menudo [20], y HIF-2α ha sido implicada previamente en este proceso celular [23]. Por lo tanto, hemos investigado el papel de la HF en la migración celular y la invasión en ccRCC. Encontramos que desmontables de HIF-2α con siRNA en células de RCC 786-O disminución de la motilidad celular como se determina por ensayo de curación de la herida en comparación con las células transfectadas codificar (Figuras 5A y 5B). La cuantificación de estos resultados se proporcionan en la Figura 5C. Mientras que casi el 80% de la brecha herida se cerró en las células control transfectadas por 12 horas, el 50% de la brecha de la herida permaneció en desmontables células HIF-2α. Teniendo en cuenta estos datos, hemos examinado la cicatrización de heridas en FH sobreexpresan subclones 786-S en comparación con las células transfectadas de control de vectores. Ambos clones que sobreexpresan FH habían reducido significativamente cierre de la herida en comparación con las células transfectadas de control de vectores, lo que sugiere que la pérdida de la HF contribuye a la migración en el RCC (Figura 6A). En las células transfectadas con vector de control, la diferencia de anchura de la herida fue casi completamente cerrado por 10 horas. En contraste, las células que sobreexpresan FH cierran la brecha de la herida por la mitad por 10 horas que indica la migración celular reducción fue resultado de la sobreexpresión FH. Estos resultados se muestran gráficamente (Figura 6B). Para corroborar estos datos, hemos examinado la migración celular utilizando un ensayo de cámara con suero bovino fetal al 10% como el quimioatrayente. Las células de control de vectores 786-S fueron significativamente más migratoria de los clones que sobreexpresan FH (Figura 6C). Por último, la sobreexpresión de FH en células de RCC reduce su capacidad invasiva como se determina por el ensayo de invasión Matrigel (Figura 6D). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la pérdida de expresión FH mejora la capacidad migratoria e invasiva de las células RCC.
786-O RCC células fueron transfectadas con siRNA control de mezcla aleatoria (SINC) o siRNA a HIF-2α. resultados de transferencia Western de extractos de células enteras se ponen de manifiesto en el panel A. B) ensayo de cicatrización de la herida se realizó en las células transfectadas. Las imágenes fueron tomadas en serie en el punto de tiempo indicado después de la inducción "herida". Los resultados se muestran gráficamente en el panel C. Los asteriscos (*) indican significación estadística con p & lt; 0,05 en relación a desordenar las células transfectadas de control
A) Cicatrización de heridas imágenes de ensayo en los puntos de tiempo indicados.. B) de la herida distancia ancho en los puntos de tiempo indicados. ensayo de migración de células C) Cámara de los clones indicados. Las células se sembraron en medio libre de suero con 10% de FBS utilizado como el quimioatrayente. Migrado recuentos de células de los clones a las 48 horas desde la siembra inicial. Los asteriscos (*) indican la significación estadística con p & lt; 0,05 en relación con las células control de vector transfectado. D) ensayo de invasión de Matrigel con 10% de FBS como el quimioatrayente. Asteriscos (*) indican significación estadística con p. & Lt; 0,05 en relación con el control de las células transfectadas vector
Discusión
En este informe, hemos demostrado por primera vez la reducción de expresión FH en el ARNm y los niveles de proteína en el carcinoma renal de células claras, la variante histológica más común que da cuenta de la mayoría de los cánceres de riñón. Estos hallazgos son importantes ya que los estudios anteriores no se identificaron
FH
mutaciones en líneas de RCC, así como muestras de RCC primarias [24]. Los mecanismos por los que los niveles de mRNA de
FH ¿Cuáles son reducidas están bajo investigación actual. La hipermetilación puede ser un mecanismo por el cual
FH
expresión se suprime. Dulaimi
et al.
No identificó hipermetilación en una isla CpG de la
FH
promotor en un panel de RCC papilar [25]. Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha han examinado
FH
estado de metilación en ccRCC. Mientras que la hipermetilación es un medio de supresor tumoral silenciamiento de genes, los mecanismos alternativos también pueden ser responsables de la reducción de la expresión de
FH
hemos identificado. El interés actual se ha centrado en el papel de microARN (miARN) en la regulación génica donde los informes sugieren que los genes implicados en la fosforilación oxidativa pueden estar sujetos a la regulación de miRNAs [26]. Claramente, estas posibilidades merecen una mayor investigación, dada la importancia biológica de nuestros resultados.
Hemos demostrado anteriormente que la reintroducción de tipo salvaje
FH
en un
FH
línea de células tumorales deficientes resulta en una reducción marcada en los niveles de HIF-1α nucleares [27]. Por otra parte, siRNA mediada desmontables de FH se ha demostrado que aumenta los niveles de HIF-1α en células de carcinoma de pulmón A549 que expresan BVS [5]. Los resultados de estos estudios, así como otros estudios bioquímicos, sugieren que el mecanismo principio por el cual esto ocurre es a través de la estabilización de proteínas HIF través de la inhibición de la actividad de prolil hidroxilasa como resultado de la pérdida de FH. Por tanto, estos hallazgos suponen que el efecto de la HF en HIF sólo sería evidente en la presencia de la BVS. Sin embargo, nuestros resultados son bastante novedoso ya que indican que la historia familiar puede modular HIF-2α con independencia de la BVS. Se han reportado vías BVS-independiente que median la degradación de HIF. En particular, Hsp90 y RACK1 han sido previamente demostrado que modulan HIF-1α degradación [28]. Por lo tanto, es posible que un mecanismo similar media la degradación de HIF-2α también. A pesar de la estabilización a través de la inhibición de la degradación de proteínas, existe una creciente evidencia de que las vías alternas juegan un papel en el mantenimiento de los niveles de proteína HIF-2α en ausencia de la BVS. Bloque
et al.
Demostró que las especies reactivas de oxígeno elevadas celulares, mediadas por oxidasas Nox basados p22-phox, mantienen los niveles de proteína HIF-2α en células de RCC a través de un /mecanismo dependiente de la traducción 4E-BP1 ARNm AKT [17] , [22]. Correspondientemente, la fosforilación de AKT y 4E-BP1 se han mejorado en humanos tejido RCC con respecto al tejido del parénquima normal [22]. Más recientemente, Toschi
et al.
Encontró que la activación de AKT, a través de la señalización a través del complejo de señalización 2 (mTORC2) mTOR, fue necesario para mantener HIF-2α en la BVS células nulas [18]. la activación de AKT es un nodo de señalización común en el cáncer y los mecanismos alternativos puede conducir a la activación de AKT en el RCC incluyendo la pérdida de la HF.
El mecanismo por el que la señalización de AKT se activa por pérdida de FH se encuentra bajo investigación. Hemos demostrado anteriormente que la pérdida de FH en las células epiteliales renales resultados en elevado estrés oxidativo celular [27]. Por lo tanto, ROS pueden ser un contribuyente a los niveles de HIF-2α elevados sobre FH caída. Alternativamente, los efectos de la pérdida FH pueden no estar relacionada con su papel en el ciclo TCA. Está bien establecido que FH también existe en una forma extramitocondrial, citosólica. En este momento, se sabe muy poco acerca de la función de esta forma de FH. Sin embargo, la evidencia reciente proporcionada por O'Flaherty
et al.
Indica que la pérdida de extramitocondrial FH puede contribuir a la estabilización de HIF [29]. Además, citosólica FH se ha implicado en la respuesta al daño de ADN [30]. Tras el daño del ADN, citosólica FH se ha demostrado que trasladar en el núcleo. El mecanismo por el cual FH participa en la respuesta al daño de ADN no está clara. Sin embargo, no es ciertamente la posibilidad de que FH y los metabolitos que interactúa con pueden regular la función de otras proteínas, potencialmente dentro del núcleo. Curiosamente, AKT también se ha demostrado que funcionan en el núcleo [31]. Teniendo en cuenta nuestros datos, así como estos informes recientes, la orientación AKT mediada vías de señalización, ya sea a nivel de AKT o aguas arriba, puede llegar a ser de beneficio terapéutico para el cáncer renal. Esto está en concordancia con los datos recientes que demuestran la
in vitro Opiniones y en
in vivo
eficacia de un inhibidor dual de la PI3K /mTOR en RCC [19].
Curiosamente, no es precedente para las alteraciones de la enzima ciclo del TCA en el cáncer. Varios otros genes que codifican enzimas del ciclo tricarboxílico (TCA) son considerados genes supresores de tumores incluyendo
SDHB
,
SDHC
, y
SDHD gratis (succinato deshidrogenasa subunidades B, C, D) [32], [33], [34].
SDH
mutaciones de las subunidades se han relacionado con feocromocitoma y paraganglioma y más recientemente con el tumor del estroma gastrointestinal (GIST) [35]. Además de las mutaciones, alteraciones de la expresión de estos genes se han relacionado con la malignidad. Dahia
et al.
Demostrado la expresión reducida de succinato deshidrogenasa subunidad B (SDHB) en un subconjunto de los feocromocitomas [36]. Más recientemente, la reducción de expresión de SDHB se identificó en gran proporción de los GIST sin mutaciones en
SDHB
u otros genes comúnmente mutado en GIST incluyendo
KIT
y
PDGFRA
[35] . Basándose en estos datos, un tema unificador potencial puede ser que los defectos en la fosforilación oxidativa, ya sea por mutación o los cambios de expresión, tienen un papel en la oncogénesis. Recientemente, Chen
et al.
Propone que el consumo de oxígeno a través del metabolismo mitocondrial puede regular el crecimiento del tumor mediante la limitación de la disponibilidad de oxígeno para actividades no mitocondriales que son contributivo al crecimiento del tumor [37].
de gran interés es la constatación de que la sobreexpresión de FH como resultado la emigración reducida y la invasión de las células RCC. Nuestros datos están en concordancia con un informe reciente de Costa
et al.
Que demostró que
FH
caída en ratón inmortalizada de fibroblastos embrionarios (iMEFS) produjo un aumento de la motilidad en comparación con iMEFS untransduced [38 ]. Además, el aumento en la motilidad era HIF-1α dependiente. El papel de HIF-2α en sus estudios no se pudo determinar ya que no fueron capaces de detectar la expresión de HIF-2α en fh iMEFS deficientes. Nuestros estudios se centraron en HIF-2α dada estudios previos que implican a su papel en la carcinogénesis renal. Dado que desmontables HIF-2α en células de RCC inhibe la migración, nuestros datos indican que los efectos de la sobreexpresión FH sobre la migración y la invasión son, en parte, mediada por los efectos sobre HIF-2α. HIF-2α previamente ha sido implicado en el comportamiento invasivo de las células de RCC. Por otra parte las propiedades que promueven invasivos de HIF-2α se han estudiado en las células 786-O, las mismas células empleadas en este estudio. Hughes
et al.
Demostró que desmontables HIF-2α en células 786-O reduce la expresión de múltiples integrinas que pueden mediar la motilidad celular y la invasión [39]. Petrella
et al.
Examinó el papel de la pérdida de la BVS en la invasión de células [40]. Encontraron que la reintroducción de tipo salvaje
BVS
en células 786-O deficitarias de VHL reducción de los niveles de HIF-2α y la invasión celular. Por el contrario, re-expresión de HIF-2α en
BVS
reconstituyen las células 786-O restaurados potencial invasor. Estos datos indican un papel de HIF-2α en la migración y la invasión RCC. Además, se encontró que la sobreexpresión de HIF-2α para mejorar el crecimiento de xenoinjertos de RCC, mientras que se encontró sobreexpresión de HIF-1α para inhibir el crecimiento de xenoinjertos [41]. Correspondientemente, estudios separados indican que HIF-2α, pero no HIF-1α, contribuye al crecimiento de
VHL
xenoinjertos de tumores nulos [16], [42]. Por lo tanto, nuestros datos se suman al creciente cuerpo de evidencia que demuestra los efectos promotores de tumores de expresión de HIF-2α en el CCR.
A pesar de la reciente aprobación de varios agentes para el cáncer renal avanzado, la mayoría de los pacientes con cáncer renal avanzado finalmente sucumbir a su enfermedad. Por lo tanto, la identificación de nuevas vías de señalización será fundamental para el desarrollo de terapias eficaces. Ahora hay más pruebas de que el cáncer renal es uno de los tumores que son representativos del paradigma emergente en la biología del cáncer de enlaces metabólicos a malignidad. Nuestros hallazgos sugieren con FH una reprogramación metabólica en el cáncer renal de células claras que promueve la expresión de factores que incluyen tumorigénicas HIF-2α a través de múltiples mecanismos. Desentrañar los mecanismos por los que el metabolismo del tumor se altera y las consecuencias celulares aguas abajo debe proporcionar un conocimiento profundo de la biología del cáncer renal, así como nuevas estrategias terapéuticas.
Materiales y Métodos
Las células
A498, 786-O, y células ACHN se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. RCC4 células fueron amablemente proporcionados por P. Ratcliffe (Oxford).
Productos químicos
LY294002 se adquirió de Sigma.
Las construcciones
El FH-FLAG constructo se ha descrito anteriormente [27].
Immunoblotting
se realizaron análisis de inmunotransferencia como Todos [27] en su conjunto de células lisados preparados con el uso de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Tris 50 mM descrito previamente HCl, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, y 0,1% de dodecil sulfato de sodio) suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes comerciales: GeneTex (FH-inmunotransferencia), Santa Cruz de Biotecnología (FH-inmunohistoquímica), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (tubulina, β-actina), Señalización Celular (AKT total y Ser473 fosfo AKT).
muestras de tejido cuantitativa en tiempo real PCR
Bioespecímenes para el análisis de ARN se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos del NCI /NIH. El ARN total se transcribió de forma inversa utilizando la alta capacidad de cDNA Archivo kit (Applied Biosystems). cDNA se utilizó como molde con los ensayos-on-Demand 20 × mezcla de ensayo de cebadores y sondas Taqman de Applied Biosystems. Cuarenta ciclos de amplificación se realizaron en el detector de secuencia de Applied Biosystems Prism 7900. Doblar los valores de cambio entre muestras tumorales y normales se calcularon utilizando la Δ
C
método de t con la normalización de los niveles de ARNr 18S. Como una prueba estadística se utilizó la prueba de Mann-Whitney emparejado prueba no paramétrica para comparar la expresión FH en el tumor en comparación con el tejido normal adyacente (implementado en GeneSpring, Agilent).
inmunotransferencia e inmunohistoquímica de especímenes tumorales humanas
las muestras tumorales y normales del tejido correspondiente de los pacientes con CCR se obtuvieron del Departamento de Urología de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio. Los tumores de este estudio fueron clasificados como histológicamente carcinoma renal de células claras por un patólogo genitourinario. La recogida y manipulación de muestras humanas se realizó de acuerdo a un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio. Basado en el protocolo, las muestras se obtuvieron de una manera desprovistos de identificación de pacientes sometidos a resección quirúrgica para el cáncer renal. A medida que se obtuvieron muestras y se analizaron de forma anónima, no se requiere el consentimiento del paciente.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se dejaron crecer hasta casi confluencia en placas de 60 mm. A continuación, cero uniforme se hizo por el centro de la placa usando una punta de micropipeta 200 microlitros, seguido por lavado dos veces con PBS. La misma marcada ámbito de la herida cero fue fotografiado usando un microscopio óptico Olympus (4 × objetivo) en los puntos de tiempo indicados. La anchura de la herida cero se midió en tres áreas diferentes con Q-Capture Pro Software. datos cuantificados representan la media +/- S. D. de al menos dos experimentos independientes.
Migración de ensayo
786-S células subclones (1 × 10
4) se sembraron en un 8 M de tamaño de poro fino-CERT para placas de 24 pocillos (Greiner Bio-One) en medio libre de suero. Setecientos cincuenta microlitros de medio FBS 10% se añadió a la cámara inferior como quimioatrayente. Después de 48 horas, las células en la parte superior de la membrana se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células migradas en la parte inferior se lavaron con PBS, se fijaron con etanol al 70% y se tiñeron utilizando 0,1% de cristal violeta para visualizar las células migradas. Las células migradas unidos al lado inferior de la membrana se enumeraron usando un microscopio de luz a 10 × magnificación. Counts representan el número de células promedio de diez campos microscópicos.
ensayo de invasión
invasión celular se determinó por el ensayo de invasión (membrana recubierta con una capa de proteínas de la matriz extracelular Matrigel) según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior e invadieron hacia la cámara inferior que contiene un medio FBS 10% como quimioatrayente. Las membranas se procesaron de manera similar como el ensayo de migración.
ARN de interferencia
Para FH y desmontables HIF-2α, las células se transfectaron con el reactivo de siRNA agrupado (Thermo Fisher) con el sistema de Amaxa Nucleofector de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron a las 48-72 horas después de la transfección. Una piscina scramble siRNA no director se utilizó como control negativo (Thermo Fisher).
Reconocimientos
Agradecemos a Cynthia Galindo y Dawn García para la asistencia técnica. Damos las gracias a la iniciativa de Biología Computacional (UTHSCSA /UTSA) para facilitar el acceso y la formación para el software de análisis utilizado.