Extracto
desarrollo y progresión tumoral se ven influidas por los macrófagos del microambiente circundante. Para investigar la influencia de un microambiente tumoral inflamatoria en el crecimiento y la metástasis de cáncer de próstata, el presente estudio se utilizó un modelo de co-cultivo de células de cáncer de próstata (CaP) con macrófagos asociados a tumor (TAM) medio -conditioned (MCM). MCM promovido celular CaP (LNCaP, DU145 y PC-3) de crecimiento, y un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos demostrado consistentemente que MCM podría promover el crecimiento del tumor. MCM también estimuló la migración y la invasión
in vitro
. derivado de somatostatina (smsDX) atenuó significativamente la proliferación estimulada por TAM, la migración y la invasión del cáncer de próstata. La inmunohistoquímica reveló que NF-kB fue sobreexpresada en CaP y HPB con muestras de tejido inflamatorio crónico y se correlacionó positivamente con la infiltración de macrófagos. La investigación adicional en el mecanismo subyacente reveló que NF-kB juega un papel importante en la infiltración de macrófagos. SmsDX inhibe el bucle paracrino entre las células de TAM y PCA y puede representar un agente terapéutico potencial para el CP
Visto:. Guo Z, Xing Z, X Cheng, Fang Z, Jiang C, D J, et al. (2015) La somatostatina Derivados (smsDX) Atenúa el TAM-estimuló la proliferación, migración e invasión de cáncer de próstata a través del Reglamento NF-kB. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10.1371 /journal.pone.0124292
Editor Académico: Fabricio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIA
Recibido: 30 Agosto, 2014; Aceptado: March 12, 2015; Publicado: 26 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30772294). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común que afecta a hombres y representa la segunda causa de muerte por cáncer en el mundo occidental [1]. La mayoría de cáncer de próstata progresa de neoplasia intraepitelial prostática a través de adenocarcinoma localmente invasivo a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [2], que conduce a la alta mortalidad y poco tratamiento es eficaz. A pesar de un gran trabajo de investigación, el mecanismo intrínseco sobre CRPC todavía no está claro. Recientemente, Zhu et al encontraron que las citoquinas incluyendo IL-1β producida por los macrófagos contribuyeron a la progresión de la CRPC [3].
Los macrófagos son por lo general la población inmune más abundante presente en el micro-entorno de tumor [4-6 ]. Recientemente, se han identificado dos estados distintos de los macrófagos polarizadas: la "clásica 'activado (M1) y los macrófagos alternativamente' 'activados (M2). Y es ahora generalmente aceptado que TAM tiene un fenotipo M2 y podría producir una serie de citocinas /quimiocinas en el microambiente local del tumor que podría estar asociado con la promoción del crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis en el cáncer de próstata [7-10]. Sin embargo, el mecanismo detallado sigue siendo desconocido.
factor kappa B nuclear (NF-kappa B) es un miembro de una familia de factores de transcripción expresado de forma ubicua que participa en la inflamación, la inmunidad y la oncogénesis [11,12]. Es ampliamente presente en la mayoría (si no todas) las células, incluyendo macrófagos. Y su activación aberrante también se ha observado en la mayoría de los tumores. Recientemente, varios estudios han demostrado que las citoquinas (por ejemplo, IL-1 y TNF) producidos por TAM podrían promover la activación de NF-kB [13,14], a continuación, promover la proliferación de células tumorales, la tumorigénesis, la migración y la invasión [15,16]. Además, la activación de NF-kappa B en los macrófagos podría exacerbar insensibilidad a la insulina y afectar el metabolismo de la glucosa, y consiste en los trastornos metabólicos como la obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2 y la aterosclerosis [17-19]. Se cree que NF-kB promueve el crecimiento celular y la oncogénesis, al menos en parte, mediante la reorganización de trazados de circuito metabólicas.
somatostatina (SMS) es un polipéptido ácido, que se encuentra ampliamente distribuido en todo el sistema nervioso central, periférico diferente tejidos y órganos. Tiene una amplia gama de actividades biológicas en endocrino, inflamación y tumor. derivado de sms (smsDX) se basa en sms14 natural, y podría obligar a los cinco subtipos de receptores de somatostatina (SSTR) [20]. Nuestra investigación previa ha encontrado smsDX podría promover la apoptosis, reprimir la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer de próstata [21]. Y varios estudios mostraron receptor de somatostatina estaba presente en los macrófagos, sms y su análogo podría modular la función de los macrófagos [22-24]. Sin embargo, el mecanismo no está claro. La somatostatina y su análogo se han reportado en varios estudios para suprimir la actividad de NF-kB [25,26]. Sin embargo, si smsDX puede regular NF-kB en el cáncer de próstata sigue siendo desconocido.
El presente estudio se evaluó la correlación entre la expresión de NF-kB y la infiltración de TAM en el cáncer de próstata (CaP), hiperplasia prostática benigna (HPB) y la HPB con muestras de inflamación crónica mediante inmunohistoquímica. Para simular el microambiente tumoral, un modelo de co-cultivo de células de CaP (LNCaP, DU145 y PC-3) con medio acondicionado TAM (MCM) se establecieron
in vitro
. MCM promovió la proliferación, la migración y la invasión de células de CaP, y esta simulación puede ser inhibida por smsDX. Los análisis adicionales indicaron que NF-kappa B juega un papel vital en este proceso, y puede estar implicado en un bucle autocrino /paracrino entre TAM y células de CaP. Nuestros hallazgos sugieren que un microambiente inflamatorio promueve la progresión del CaP, y que smsDX puede representar un fármaco auxiliar para el cáncer de próstata debido a su potencial papel antiinflamatorio.
Resultados
P65 expresión se correlaciona positivamente con el reclutamiento de macrófagos en los tejidos de la próstata humana
tinción inmunoreactiva para la subunidad P65 de NF-kB se evaluó en la muestra de 24 CaP, 12 HBP con la inflamación crónica y 33 muestras de HPB. Cuando el grado de tinción en todas las muestras de tejido se cuantificó en el + escala de 0-3, se observó un aumento gradual entre los tejidos de BPH, BPH con muestras inflamación crónica, y PCA. Ninguno de los tejidos de BPH manchada como 3+, y el 87,8% exhibió 0+ 1+ o manchas. La cantidad de manchas en la HBP con muestras de inflamación crónica fue intermedia, con un 75% de las muestras que exhiben 1+ o 2+ tinción y el 25% que exhiben 3+. En contraste, todos los especímenes de cáncer eran 2+ a 3+ (37,5 y 62,5%, respectivamente), como se muestra en la Tabla 1. Además, sólo se observó tinción débil P65 en el citoplasma en los tejidos de BPH, se observó tinción P65 tanto el citoplasma y núcleo de células tumorales e inflamatorias.
a fin de evaluar la relación entre P65 y la infiltración de macrófagos en los tejidos de la próstata humana, las secciones no teñidas fueron immunolabeled con CD68. Como se muestra en la figura 1, las células CD68-positivas y P65 se expresaron de forma coordinada en niveles de moderados a altos en BPH con lesiones inflamación y el cáncer de próstata crónicas. Por el contrario, se observó un color mínimo CD68 para la HPB. Además, la mayoría de las células CD68-positivas exhibió características morfológicas de los macrófagos. Por lo tanto, la expresión de P65 se correlacionó positivamente con la densidad de macrófagos.
(A) tinción fuerte de NF-kB en el citoplasma y núcleo de CaP. (B) la infiltración moderada de macrófagos en el CP. (C) la tinción moderada de NF-kappa B en el citoplasma y el núcleo de la prostatitis. (D) de alta infiltración de macrófagos en la prostatitis crónica. (E) tinción débil de NF-kappa B en el citoplasma de la HBP. (F) leve infiltración de macrófagos en la HPB. Todas las imágenes son imágenes representativas.
SmsDX inhibe la formación y la proliferación de colonias promovido-MCM de las células de cáncer de próstata
Para estudiar los efectos de MCM y smsDX sobre la proliferación de células de CaP, LNCaP, DU145 y PC-3 células se expusieron por separado a MCM y smsDX durante 24, 48 y 72 h en un ensayo de CCK-8. En consecuencia, MCM promovió significativamente la proliferación de LNCaP, DU145 y PC-3 células de una manera dependiente del tiempo, mientras que smsDX podría debilitar el impacto de MCM sobre la proliferación celular (Fig 2). La viabilidad de LNCaP, DU145 y PC-3 células aumentó a 51,7%, 44,3% y 57,6%, respectivamente, después de la exposición a MCM durante 72 h, sin embargo, la viabilidad se redujo a 44,8%, 44,1% y 41,6%, respectivamente, sobre smsDX tratamiento.
El efecto de MCM y /o smsDX sobre la viabilidad celular se midió a través de CCK-8 ensayo. células LNCaP (A), (B) células DU145 y (C) las células PC-3 fueron co-cultivadas con MCM y /o tratados con smsDX para 24, 48 y 96 h. Co-cultivo con MCM promovió significativamente la proliferación de células de CaP en una forma dependiente del tiempo, wheras smsdx podría atenuar sustancialmente esta influencia. (D) El efecto de MCM y smsDX en la formación de colonias. (E) El número de colonias, asclusters definidas de al menos 50 células, se contó bajo el microscopio. Los resultados representan las medias ± SD de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± SD, * p & lt; 0,05, ** p & lt;.
0,01
Además, examinó los efectos de MCM y smsDX en la formación de colonias de células de CaP. MCM facilita drásticamente la formación de colonias de LNCaP, DU145 y células PC-3. Sin embargo, el número de colonias se redujo significativamente después del tratamiento con smsDX como se muestra en la figura 2 (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
Efectos de MCM y smsDX sobre la migración celular y la invasión
in vitro
se llevaron a cabo los ensayos de cero para evaluar los efectos de MCM y smsDX sobre la migración de las células de CaP. Las capacidades de migración de LNCaP, DU145 y PC-3 se incrementaron notablemente después de co-cultivo con MCM durante 24 h (Fig 3). A fin de probar la influencia de MCM y smsDX sobre la migración celular y la invasión, se realizó transwell ensayo. Nuestros resultados demostraron que el número de células migratorias e invasivas que pasan a través del filtro aumentó significativamente cuando se cultivaron los macrófagos en la cámara inferior (Fig 3) (# P & lt; 0,05, ## P & lt; 0,01). Sin embargo, smsDX (10 nM) podría inhibir de manera espectacular la migración y la invasión de células de CaP.
(A, C, E) Co-cultivo con MCM aumentó la migración de células de LNCaP, DU145 y células PC-3. SmsDX suprime el efecto de MCM. (B, D, F) El cambio de migración se presenta como el porcentaje de la distancia inicial entre los dos bordes. (G, I, L) Transwell migración y la invasión de ensayo de LNCaP, DU145 y PC-3 células tratadas con MCM y /o smsDX. (H, J, M) Se contó el LNCaP, DU145 y PC-3 células que migraron e invadió con éxito. Los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01,#p & lt; 0,05, ## p. & Lt; 0,01
SmsDX inhibe el crecimiento tumoral MCM-dependiente en un modelo de xenoinjerto
Después de demostrar la eficacia de smsDX en la inhibición de la viabilidad celular y la invasión CaP
in vitro
, que investigarse más a fondo su potencial efecto antitumoral en ratones. las células PC-3 (5 × 10
6) fueron inyectadas subcutáneamente en cada flanco de ratones desnudos. El tratamiento con MCM aumentó significativamente el volumen promedio del tumor. Sin embargo, el crecimiento tumoral se inhibió después del tratamiento con smsDX a 1 mg /kg /d (Fig 4) (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01). Además, no se observó toxicidad significativa en ratones tratados con MCM y smsDX (1 mg /kg /d) como evaluó usando el peso de cada animal en los 3 grupos (Fig 4). Para investigar la expresión de NF-kappa B, así como la infiltración de macrófagos
in vivo
, inmunohistoquímica se realizó en secciones de parafina de PC-3 xenoinjertos de tumores de ratones desnudos. NF-kB y CD68 fueron altamente expresado en los ratones tratados con MCM, y se asoció positivamente con el volumen tumoral (figura 4)
.
Imágenes de los ratones desnudos (A) y los tumores extirpados (C) se tomaron de diferentes grupos. curva (B) peso corporal de ratones desnudos portadores de tumores PC-3 en diferentes grupos. (D) gráficos que representan los volúmenes promedio de tumor de PC-3 xenoinjertos tratados con MCM y /o smsDX. (E) La correlación entre CD68 y NF-kB en xenoinjertos tumorales CaP. Los datos se presentan como el medio ± SD, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01
SmsDX inhibe la translocación nuclear y la activación de NF-kB inducida a través de macrófagos medio acondicionado en células de CaP
NF-kB puede representar una relación mecanicista crítica entre la inflamación y el cáncer, y su activación aberrante puede promover la proliferación de células tumorales, la tumorigénesis, la migración y la invasión [15,16]. Nosotros observamos primero la expresión de P65 fosforilada, que modula la actividad de transcripción NF-kB [27,28]. Como se muestra en la figura 5, co-cultivo con MCM significativamente hasta reguladas P65 fosforilada en las células LNCaP, que se expresó más fuertemente cuando se incubaron estas células con MCM para 30 min. Posteriormente, se analizó el efecto de smsDX sobre la fosforilación de p65. Los regulados hasta los niveles de fosforilación de p65 secundarias al tratamiento MCM se suprimen de forma eficaz a través de smsDX en tres líneas celulares PCA (Figura 5).
(A) los niveles de fosforilados NF-kB en las células LNCaP después de la exposición a MCM para diferente duración. (B-D) El phosphory niveles y el total de NF-kB se analizaron mediante Western Blot. La cuantificación de la relación de p-NF-kB /NF-B se determinó mediante análisis de densitometría.
A fin de evaluar los efectos de MCM y smsDX en la translocación de NF-kB, citosólicas y proteínas nucleares se extrajeron, respectivamente. El análisis de transferencia Western reveló que MCM redujo la abundancia de p65 en el citoplasma de las células LNCaP (Fig 6). Por otra parte, se observaron mayores niveles de P65 en el núcleo (Fig 6), lo que indica que NF-kappa B se activó. Sin embargo, el tratamiento con smsDX durante 24 h inhibió dramáticamente el efecto de MCM sobre la activación de NF-kB. Se obtuvieron resultados similares en el DU145 (Fig 6) y las líneas de PC-3 de células (figura 6). Los resultados de inmunofluorescencia de la figura 7 confirman además que, similar al ensayo de transferencia Western, un aumento significativamente en la acumulación nuclear de p65 se observó después de co-cultivo con MCM en las células LNCaP, y que smsDX drásticamente inhibida translocación P65. Se observaron resultados similares en el PC-3 líneas celulares (Figura 7) y DU145.
(A, C, E) La expresión de p65 en el citoplasma se redujo después del co-cultivo con MCM, smsDX atenúa este efecto en LNCaP, DU145 y PC-3 células. A-tubulina fue elegido como el control de carga de proteína citosólica. (B, D, F) Co-cultivo con MCM aumentó la expresión de p65 nuclear, y el tratamiento con smsDX debilita el efecto de MCM. Las histonas fueron elegidos como el control de la carga de proteínas nucleares. La cuantificación de la C-p65 /a-tubulina y N-p65 /relación de la histona se realizó como análisis de densitometría.
(A) Co-cultivo con MCM promovió significativamente la acumulación nuclear de p65 en LNCaP Células. El tratamiento con smsDX inhibe p65 translocación nuclear. (B y C) La expresión y translocación de p65 después de la exposición a MCM y el tratamiento con smsDX en DU145 y PC-3 células, respectivamente, fueron analizados por medio de inmunofluorescencia.
Discusión
la presencia de leucocitos dentro de los tumores se observó por primera vez en el siglo 19 por Rudolf Virchow, esta observación proporciona la primera indicación de una relación entre la inflamación y el cáncer [29]. Los estudios epidemiológicos han demostrado recientemente que los macrófagos representan un componente principal del infiltrado de leucocitos anfitrión en la mayoría de los tumores malignos [30]. Sin embargo, la importancia clínica de TAM se infiltra en el cáncer de próstata sigue siendo controvertido. Kiran el al informaron de que el número medio de TAM fue mayor en el cáncer de próstata que en el tejido benigno [31], mientras que Norio et al informaron el resultado opuesto [32]. En el presente estudio, se observó el aumento de la infiltración de macrófagos en el cáncer de próstata y la BPH con la inflamación crónica en comparación con el tejido benigno. El aumento de la infiltración de TAM También se ha informado que se asocia con la progresión de la pobre CaP [33]. Por lo tanto, TAM pueden representar un predictor potencial de cáncer de próstata. Algunos estudios previos también han revelado que polarizados-M2 macrófagos THP-1 pueden promover el crecimiento tumoral, invasión y metástasis [34,35]. En el presente estudio, encontramos que el TAM-como los macrófagos de tipo M2 aumentó la migración y la invasión de células de cáncer de próstata. Además, MCM promovió la tumorigenicidad de las células PC-3 en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Por otra parte, la administración de smsDX atenúa el potencial migratorio e invasivo de las células de cáncer de próstata que fue estimulado por los macrófagos de tipo M2.
También observó que la expresión de NF-kB en el CaP y HPB con muestras de inflamación crónica fue significativamente mayor que en BPH, esta expresión se correlacionó positivamente con la infiltración de macrófagos. Por lo tanto, nos hemos centrado en el papel de NF-kB en este proceso. factor kappa B nuclear (NF-kappa B) es un factor de transcripción inducible dimérica que pertenece a la familia Rel /NF-kB. La sobre-expresión de genes que codifican para factores de RelA /NF-kB se ha observado en muchos tumores [36-39], y se cree que el desregulación de NF-kappa B para promover la proliferación celular, la motilidad, invasión y metástasis en la mayoría de los tumores de próstata incluyendo cáncer [40,41]. NF-kappa B se considera que es un productor molecular importante de la inflamación y puede promover la inmunidad mediante el control de la expresión de genes implicados en la inflamación [42]. El presente estudio demostró que los macrófagos activados NF-kB en el CaP. Esto llevó a la progresión de las células de cáncer de próstata después de co-cultivo con MCM. En el microambiente tumoral, las citoquinas de TAM podría activar NF-kB en las células tumorales, promoviendo así la tumorigénesis. Las células tumorales a su vez expresan CSF-1 y pueden estimular aún más y reclutar macrófagos [43]. Por lo tanto, hay un bucle paracrino dentro de la progresión del tumor mejorada-TAM. Y NF-kB juega un papel importante en la acción de este bucle.
La somatostatina y sus análogos son hormonas neuroendocrinas y representan importantes mediadores entre el nervioso y el sistema inmunológico. Nuestra y otros grupos han encontrado que estas hormonas pueden inhibir la proliferación y la invasión de varios tipos de tumores [21,44]. Más recientemente, los datos experimentales significativos han demostrado que los análogos de SMS exhiben actividad anti-inflamatoria, debido a su efecto inhibidor sobre la secreción de TNF-α, IL-8 e IL-1β [45,46]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, no se han realizado estudios sobre los efectos de los análogos de SMS en la expresión de NF-kB y el comportamiento biológico de las células de CaP en un microambiente inflamatorio. En el presente estudio, se encontró que smsDX atenúa sustancialmente la estimulación mediada por macrófagos de la proliferación celular y la invasión CaP mediante la inhibición de la expresión y la actividad de NF-kB
in vitro
y
in vivo
. subtipos de receptores de la somatostatina 1 y 2 se han detectado en los macrófagos humanos [22], y la somatostatina inmunorreactiva se ha detectado en el citoplasma de los macrófagos. Por lo tanto, se especula que smsDX podría unirse con SSTR1 o 2 en la superficie de los macrófagos y romper el bucle paracrino entre el tumor y el microambiente inflamatorio, aliviando de ese modo la progresión de macrófagos estimulada de CaP.
Recientemente, trastornos metabólicos incluyendo la obesidad, la diabetes tipo 2 y la aterosclerosis se han visto histológicamente como la inflamación crónica de bajo grado con infiltración de macrófagos significativa [47,48]. Los macrófagos se ha observado que estar en estrecha proximidad con las células metabólicas y se observaron a poseer una extensa firma transcripcional que regula el metabolismo de adipocytessuch como piruvato carboxilasa, PPAR-γ, apolipoproteína C1, etc [18]. En individuos obesos, el excedente de energía o productos de los macrófagos pueden activar NF-kB, además está promoviendo el reclutamiento de macrófagos, activación y la iniciación y el mantenimiento de una reacción inflamatoria que finalmente resulta en la resistencia a la insulina [18]. Además de exacerbar insensibilidad a la insulina periférica, NF-kB también puede afectar el metabolismo de la glucosa y la respiración mitocondrial, que es importante para el crecimiento celular y la oncogénesis [49]. Nuestro estudio anterior informó que smsDX puede afectar el metabolismo celular y la función mitocondrial de células de CaP. Por lo tanto, se especula que smsDX puede atenuar el efecto de MCM en células de CaP a través de la acción sobre el metabolismo celular, además de anti-inflamación.
En conjunto, nuestro estudio demuestra que TAM puede promover el desarrollo y la progresión del CaP, y que smsDX atenúa este efecto por abajo de la regulación de NF-kB. Estos resultados indican que smsDX puede ser un fármaco terapéutico prometedor para pacientes con cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todas las muestras humanas fueron obtenidas durante la cirugía terapéutica. Este estudio se realizó con las muestras en los estantes después del diagnóstico patológico. Nos llamó a todos los pacientes y obtuvo el consentimiento informado verbal. Esto es específicamente aprobado por el Comité el Hospital de la Universidad de Qilu Shan Dong para experimentos humanos. Todo el cuidado de los animales y los protocolos experimentales cumplido con las Normas de Gestión Animal del Ministerio de Salud de la República Popular de China (documento n ° 55, 2001). Todos los animales se mantuvieron en el Laboratorio Clave de remodelado cardiovascular y la investigación de las funciones en el Hospital de la Universidad de Shandong Qilu. Este estudio fue aprobado por el Comité de Qilu Hospital de la Universidad de Shan Dong para experimentos Humanos y por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Shandong.
Pacientes y muestras
Un total de 24 pacientes con diagnóstico de CaP y 45 pacientes con diagnóstico de HBP tratados en el Departamento de Cirugía Urología, Qilu hospital de la Universidad de Shandong entre octubre de 2010 y julio de 2012, fueron inscritos en este estudio. Dentro de esto, dieciséis de los pacientes con CaP fue sometido a biopsia prostática transrectal, y 8 pacientes fueron sometidos a resección transuretral de la próstata. Doce de 45 pacientes hiperplasia benigna de próstata (HBP) fueron diagnosticados con la inflamación crónica de la próstata histológico. Los parámetros clínicos y patológicos clasificaciones se presentan y se resumen en la Tabla 1. Ninguno de los pacientes habían recibido tratamiento adyuvante preoperatorio. El diagnóstico de cada caso fue confirmado por dos patólogos.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de CaP humano (LNCaP, DU145 y PC-3) y THP-1 células de CaP fueron adquiridos de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia china de Ciencias. Todas las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) que contenía 10% de suero de ternera fetal a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. Robaba TAM representa una distinta población de macrófagos polarizado-M2 [50], monocitos THP-1 se diferenciaron en macrófagos en medio RPMI que contenía 5 ng /ml de forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para 48 h de acuerdo con protocolos establecidos previamente [51]. A continuación, los sobrenadantes del cultivo fueron esterilizadas por filtración y se almacenó a -20 ° C hasta que esté listo para su uso.
inmunohistoquímico análisis
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [52]. Brevemente tejidos incluidos en parafina fueron desparafinados y rehidratados. Después de la recuperación de antígeno, todas las muestras fueron expuestas a anticuerpo primario (CD68 01:50, P65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4 ° C, y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con biotina durante 30 min a 37 ° C, seguido de complejo de avidina-peroxidasa biotinilada durante 20 min a 37 ° C. La tinción se ejecuta con tertrahydrochloride 3,3N -Diaminobencidina y hematina. El nivel de expresión de la proteína se evaluó de acuerdo con el porcentaje de células tumorales teñidas positivamente y de la intensidad de la tinción por dos patólogos como se describe anteriormente [53]. Brevemente, el porcentaje de tinción positiva se puntuó como 0 (0-9%, negativo), 1 (10% -25%, esporádico), 2 (26% -50%, focal) o 3 (51% -100%, difuso), y la intensidad como 0 (sin manchas), 1 (tinción débil, visible a gran aumento), 2 (tinción moderada, visible a bajo aumento) y 3 (coloración oscura, sorprendentemente positiva a bajo aumento). La puntuación total de la inmunotinción fue calculado con el valor de la puntuación de porcentaje de positividad × puntuación de intensidad de tinción, que varió de 0 a 9. El nivel de expresión de proteínas se define de la siguiente manera: "0+" (negativo, y marcó el 0), "1+" ( débilmente positivo, la puntuación de 1-3), "2 +" (positivo, la puntuación de 4-6), y "3+" (fuertemente positiva, score7-9).
ensayo de viabilidad celular
viabilidad celular se determinó mediante ensayo de CCK8. Brevemente, LNCaP (6 × 10
3 células /pocillo), DU145 (4 × 10
3 células /pocillo) y PC-3 (4 × 10
3 células /pocillo) células en 200 l de medio se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 12 horas para la adhesión, el medio fue reemplazado por medio condicionado de macrófagos con /sin smsDX (10 nM). Después de 24-72 horas, las células cultivadas se trataron con 20 l de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japón) y se incubaron a 37 ° C durante otras 4 horas de acuerdo con las instrucciones de la fabricación. Se determinó la absorbancia a 450 nm.
Clonar ensayo de formación de
LNCaP, DU145 y PC-3 células a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo fueron sembradas en 6- y placas. Después de la incubación durante la noche en medio condicionado con /sin smsDX (10 nM) se añadió al medio, y las células se incubaron en 5% de CO
2 y 37 ° C durante dos a tres semanas. Cuando clones visibles formadas en las placas, las células se lavaron los clones con PBS y se fijaron con metanol previamente enfriado, y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 20 minutos. Las colonias que contienen más de 50 células fueron contadas con un microscopio. La tasa de formación clon = (el número clon /el número de la inoculación de células) × 100%.
in vitro
cero ensayo
células de CaP fueron sembradas en 24 pocillos platos. Después de la incubación durante 24 horas, cada pocillo se rascó de forma manual con una punta de pipeta 200 l, se lavó con PBS tres veces y se incubaron con medio condicionado con /sin 10 nM smsDX. Las imágenes fueron tomadas de nuevo después de 24 horas. La distancia entre los dos bordes de la celda se analizaron utilizando el software ImageJ.
se realizaron Transwell ensayo de invasión
ensayo de invasión Transwell como se describe anteriormente [54]. En pocas palabras, un total de 5 × 10
se añadieron 4 células suspendidas en 100 medio libre de suero l a las cámaras superiores del sistema transwell (24 pozos, de 8 mm de tamaño de poro; Corning Costar, Lowell, MA, EE.UU.) recubierto con 2 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences). TAM medio acondicionado con /sin 10 nM smsDX A continuación se añadió a la cámara inferior. Después de 24 horas, las células no invadidas en la cámara superior se retiraron cuidadosamente con un hisopo de algodón mientras que las células correspondientes a la superficie inferior se fijaron con metanol previamente enfriada y se tiñeron con eosina al 1%. Al menos diez campos de cada cámara se seleccionaron al azar y las células se contaron bajo el microscopio.
Para el ensayo de migración, las células se sembraron en las cámaras superiores sin Matrigel recubierto. El resto del ensayo se realizó como el ensayo de invasión Transwell. Después de 24 horas, las células en la superficie inferior también se contaron en al menos diez campos al azar, entonces el número de células se analizaron estadísticamente.
inmunofluorescencia ensayo
células de CaP se sembraron en vidrio recubiertos de fibronectina cubreobjetos. Después de 24 h de incubación, las células se enjuagaron con PBS, se fijaron en metanol previamente enfriada, y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100. Las células fijadas se preincubaron en suero de cabra normal al 1,5% y se incubaron adicionalmente durante una noche con un anticuerpo primario contra P65 (dilución 1: 100) a 4 ° C. Después de la incubación con el anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra conjugado con fluoresceína a 37 ° C, los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos con PermaFluor acuoso. Se observó fluorescencia utilizando un microscopio Zeiss Axioplan Universal.
Western blotting
Las células se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa 1%. Para aislar componente citoplasmático de una nuclear, células de CaP se trataron con un kit de extracción de la proteína nuclear (Beyotime Biotechnology, Wuhan, China) y se centrifugaron a 3400 r.p.m. durante 10 min a 4 ° C. Los componentes citoplasmáticos y nucleares se sometieron entonces a transferencia Western. Igual cantidad de proteínas de cada muestra se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF usando un aparato de transferencia húmeda (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente y se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Las membranas se expusieron posteriormente a los anticuerpos con peroxidasa de rábano marcada con secundarios (1: 2.000) durante 1 h a temperatura ambiente, y se detectó la reactividad utilizando un mejorado sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham, Pittsburg, PA). Los niveles de proteína fueron analizados utilizando el software ImageJ.
Tumor modelo de xenoinjerto
libres de patógenos 4-5 semanas de edad BALB /c ratones desnudos (con un peso de 19 ± 2 g, grado SPF, SCXK2011 certificado -0012) fueron adquiridos por el Departamento de Ciencia Animal de Laboratorio de la Universidad de Pekín (Beijing, china). Se recogieron un total de 5 × 10
6 de las células PC-3, mezclado con Matrigel y se inyecta por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos. Los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (5 por grupo). Los ratones se les dio de MCM con o sin smsDX a una dosis de 1 mg /kg /d a través de inyección intraperitoneal durante 4 semanas con seguimiento semanal de el tamaño del tumor y el peso corporal, mientras que los ratones de control se les dio el mismo volumen de solución salina normal. Todos los ratones fueron sacrificados mediante el uso de pentobarbital sódico 8 semanas después de la inoculación de las células cancerosas y se recogieron los tumores.
El análisis estadístico
Los datos se presentan en su mayoría como la media ± desviación estándar. paquete de software SPSS (versión 13.0; SPSS, Chicago, IL) fue utilizado para todos los análisis estadísticos. Se analizaron las diferencias significativas entre los valores de tratamiento y de control usando t-test o análisis unidireccional-Student de dos colas de varianza siempre que sea apropiado. Las diferencias se consideraron ser estadística significativa cuando p & lt; 0,05. Cada variable fue probado dos veces y el experimento se repitió tres veces.
Reconocimientos
American Journal Experts editar este manuscrito.