Extracto
células de cáncer cervical presentan una mayor necesidad de ubiquitina que dependen de la degradación de la proteína asociada a una elevada tasa de recambio metabólico . La ubiquitina, que es una proteína pequeña, altamente conservada expresada en todas las células eucariotas, puede ser unido covalentemente a ciertas proteínas diana para marcarlos para la degradación por el sistema de ubiquitina-proteasoma. Estudios anteriores ponen de manifiesto el papel esencial de la ubiquitina B (UBB) y UbB dependiente proteasomal degradación de proteínas en inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi) selectividad tumoral inducida. La hipótesis de que UbB juega un papel crítico en la función de las células madre del cáncer de cuello uterino. Que mide los niveles endógenos UBB en mammospheres
in vitro fotos: por PCR en tiempo real y Western Blot. La función de UbB en células de cáncer de tallo como se evaluó después de desmontables de expresión UbB en prolongados células HeLa seleccionados-A tricostatina (HeLa /TSA) midiendo
in vitro
la proliferación celular, la apoptosis celular, invasión, y la quimioterapia resistencia, así como mediante la medición in vivo
crecimiento
In en un modelo ortotópico de cáncer de cuello uterino. También se evaluó la frecuencia de células madre del cáncer, tumorsphere formación, y
in vivo
crecimiento de xenoinjertos de cáncer cervical humano después de UbB silenciamiento. Se encontró que HeLa /TSA fueron resistentes a la quimioterapia, altamente expresado el gen UbB y los marcadores de células madre Sox2, Oct4 y Nanog. Estas células también muestran habilidades diferenciación inducida, incluyendo capacidades de migración /invasión /malignidad mejoradas
in vitro
y
in vivo
. Además, una elevada expresión de UbB se muestra en las muestras tumorales de pacientes de quimioterapia. El silenciamiento de UbB inhibida tumorsphere formación, redujo la expresión de marcadores de células madre y la disminución del crecimiento de xenoinjerto cervical. Nuestros resultados demuestran que UbB fue significativamente mayor en las células HeLa seleccionados-A tricostatina prolongados y jugó un papel clave en el mantenimiento de las células madre, como el cáncer de cuello uterino.
Visto: Tian Y, W Ding, Wang Y, Ji T, Sun S, Mo Q, et al. (2013) La ubiquitina B en Cáncer de cuello uterino: críticos para el mantenimiento de cáncer de vástago como los personajes celulares. PLoS ONE 8 (12): e84457. doi: 10.1371 /journal.pone.0084457
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2013; Aceptado 22 de noviembre de 2013; Publicado: 18 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 81372806, 81101962, 81101965, 81202060). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el segundo cáncer más común entre las mujeres menores de 65 años de edad y la causa más frecuente de muerte por cáncer ginecológico en todo el mundo. El riesgo de una mujer de desarrollar cáncer de cuello uterino por 65 años de los rangos de edad de 0,69% en los países desarrollados a 1,38% en los países en desarrollo. En 2010, aproximadamente 75, 000 nuevos casos de cáncer de cuello uterino se diagnosticaron en China [1,2]. En la actualidad, aproximadamente el 35% de las mujeres diagnosticadas con cáncer de cuello uterino tiene la enfermedad recurrente, con un 90% de éstas se encuentran dentro de los 3 años después del tratamiento inicial [3]. Debido a múltiples fármacos resistencia y también la resistencia a la radioterapia, los métodos convencionales no serán eficaces para los casos recurrentes. La mejora de las terapias dirigidas y estrategias de quimio /radio-sensibilización son esenciales para reducir la mortalidad de esta devastadora enfermedad maligna.
La identificación de las células madre, como el cáncer en los tumores sólidos abre nuevos enfoques para la quimioterapia; es necesario una mejor comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis subyacentes y las propiedades resistentes al tratamiento de las células madre, como el cáncer. En los últimos años, la acumulación de evidencia sugiere que el potencial para iniciar un tumor, incluyendo carcinoma cervical, es una característica bastante única de un pequeño subconjunto de células madre, llamado "células cancerosas madre" (CSC) o "tumor iniciadoras Células". Los CSC tiene la capacidad exclusiva de auto-renovación, ampliando el grupo de células madre cancerosas y permitiendo que el tumor se diferencian en que el cáncer heterogénea no tumorigénicos [4]. La hipótesis de los CAC tiene implicaciones clínicas emocionantes en cáncer de cuello uterino: podría explicar el fracaso y la terapia de recaída de la enfermedad como resultado de la resistencia de las células madre cancerosas a los estímulos de muerte. De hecho, mediante la retención de las características biológicas de las células madre de tejido, tales como la quiescencia, auto-renovación y resistencia a múltiples fármacos, células madre cancerosas constituyen una población de células tumorales refractaria intrínseca que es resistente a terapias desarrolladas para erradicar rápidamente las células en división. Por lo tanto, la identificación y caracterización de células madre cancerosas son fundamentales para el pronóstico y el tratamiento del carcinoma de cuello uterino [5].
En un estudio previo, se realizó SMART para identificar los genes clave responsables de la acción selectiva del tumor de tricostatina A ( TSA), uno de los HDACIs más ampliamente estudiado. Se identificaron ubiquitina B (UBB), que puede enlazar de forma covalente a determinadas proteínas diana marcado ellos para la degradación por el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS), como mediador de la apoptosis de células de cáncer inducido por TSA. La pérdida de la función de genes UbB confiere la mayor resistencia al tratamiento TSA [6].
Nuestro primer hallazgo de este estudio fue que las células que sobrevivieron a la detección de TSA tienen algunas propiedades de las células madre cancerosas. Para confirmar las características de estas células de cáncer de vástago-como, aislamos células de formación de esferas (SFC) por selección de líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Caracterización de estas SFCs se define por características CSC-similares, incluyendo la tumorigenicidad mayor que las células HeLa parentales; elevada expresión de Sox2, Oct4 y Nanog; y la resistencia a múltiples fármacos. La expresión de este búfer en estas células madre-como fue examinado en la investigación adicional. Se encontró que el mantenimiento de las características madre, como el cáncer correlacionada con la expresión UbB y silenciamiento de la expresión UbB podría revertir las características de las células madre del cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Veintidós pacientes que diagnosticaron carcinoma de células escamosas de cuello uterino y se sometieron a cirugía primaria directa o después de la quimioterapia basada en cisplatino regulares recibidas fueron elegidos para participar en este estudio y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido postoperatorias fueron recogidos por el Departamento de Patología Clínica, Hospital de Tongji, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (HUST). La información sobre el diagnóstico histopatológico fue revisado por al menos dos especialistas en patología ginecológica. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Tongji, Tongji Medical College, HUST.
xenoinjerto de tumor estudio
Estos experimentos se realizaron con 6 a 8 semanas de edad, de sexo femenino no obesos severa (/SCID NOD) ratones diabéticos /combinado de inmuno-deficiencia adquirida de HFK (Beijing) y alojados en el Centro Experimental Animal, Tongji Medical College, HUST. Los ratones fueron seleccionados al azar para cada grupo; un total de seis ratones por grupo se utilizaron y alojado en tres por jaula. se tripsinizaron las células HeLa y HeLa /TSA, se contaron, y se resuspendieron en 100 l de PBS de Dulbecco y luego inyectados por vía subcutánea. Las tasas de crecimiento de los xenoinjertos se midieron cada tres días, y el volumen se calculó mediante el uso de la fórmula: L x W
2 × 0,5. Las fotografías fueron tomadas de xenoinjertos después ratones se les administró una sobredosis letal de anestesia con pentobarbital sódico. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de HUST, y el estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con el LLEGA (Investigación Animal: Presentación de
En Vivo
experimentos) directrices [7] {Kilkenny 2012#29}.
cultivo de células y transfección
Las células HeLa se obtuvieron de la ATCC y se mantuvieron en nuestro laboratorio. células HeLa /TSA se establecieron mediante el tratamiento de células HeLa con 1 M tricostatina A (TSA, Sigma) durante 24 horas y luego el mantenimiento de las células en 200 nM TSA para otro 7 a 10 días. Se dejó que las células supervivientes para recuperar durante otros 4-7 días. Luego, se recogieron y se dejaron proliferar.
El siRNAs (Invitrogen) fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Un shRNA lentivirus se utilizó para infectar a las células siguiendo el protocolo del fabricante.
exposición UV de las células
Para la irradiación UV, las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 /ml y crecido hasta que se consiguió de fijación y se formó una monocapa uniforme. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS precalentado y se expusieron a UV, mientras que en PBS. luz UV se genera a partir de una lámpara UVB 15-W (UVP), que emite la mayor parte de la energía dentro de la gama UVB de 280 a 370 nm, con un pico de emisión a 310 nm. La intensidad de los rayos UVB se estandarizó por un medidor de UVB y fijó en 200 J /m
2. Después de la irradiación, se añadió medio fresco.
Transwell ensayo de migración
células HeLa y HeLa /TSA se sembraron en una cámara transwell durante 48 horas. Las células que migraron a través de la membrana fueron fijadas y teñidas con 0,1% de cristal violeta y luego se examinan bajo un microscopio de luz.
Identificación de células SP
HeLa y HeLa /TSA células se trataron con tripsina y se incubaron con 5 mg /ml de Hoechst 33342 colorantes (Roche) a 37 ° C durante 90 min; la reacción se terminó por incubación en agua helada durante 10 min. Las muestras de células teñidas se analizaron mediante un citómetro de flujo FACSCalibur (BD) utilizando una excitación UV 355 nm; la emisión de fluorescencia se recogió usando un filtro de paso de banda de 450 nm para Hoechst azul y un filtro de paso de banda 670-nm para Hoechst rojo. adquisición y análisis de datos se realizaron con el software CellQuest Pro (BD).
La formación de colonias, la formación mammosphere y la limitación de ensayos de dilución
HeLa y HeLa /células TSA se contaron y se sembraron a la misma densidad en una placa de 6 pocillos durante 7 días. Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos. Entonces, las células se lavaron con agua destilada durante 5 minutos dos veces y se incubaron con una solución de tinción de cristal violeta 0,1% durante 10 minutos. Finalmente, las células se lavaron con agua destilada durante 5 minutos dos veces o hasta que el exceso de tinte se eliminó completamente.
formación mammosphere y la limitación de ensayos de dilución se realizaron como se describe anteriormente por Calcagno [8] AM. En general, hemos realizado estos experimentos en células HeLa y HeLa /TSA para evaluar mammosphere formación en pocillos de cultivo de fijación ultra-bajas (Costar) en medio DMEM /F12 libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF, 10 ng /ml, Peprotech); recombinante del factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF, 10 ng /ml, Peprotech); insulina (50 mg /ml, Sigma); B27 (100 unidades /ml, Invitrogen), penicilina (100 unidades /ml, Invitrogen) y estreptomicina (100 mg /ml, Invitrogen). Se identificaron mammospheres como se describe [9] cada 3 días de acuerdo con las tasas de proliferación de colonias. El ensayo de dilución límite se realizó en placas de varios números de células (de 500 células de una sola célula) por pocillo en tres placas de 96 pocillos ultra-bajas de fijación. Los esferoides se contaron a los 14 días o más, dependiendo de las tasas de crecimiento de los esferoides. Los experimentos se realizaron por triplicado, y se presentan los promedios calculados.
aislamiento de ARN, la transcripción inversa y RT-PCR cuantitativa análisis
El ARN total se aisló usando el kit Qiagen RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantificación del ARN se determinó usando un espectrofotómetro NanoDrop micro-volumen (Thermo Fisher), y la integridad del mRNA se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa. reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) fue entonces realizó usando 2 g de ARN total. RT-PCR cuantitativa se realizó en un CFX96 Touch
TM Real-Time Sistema de Detección de PCR (Bio-Rad) utilizando el siguiente programa del termociclador para todos los genes: 5 min de pre-incubación a 95 ° C seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 15 s a 60 ° C, y 30 s a 72 ° C. Los cebadores de todos los genes diana y el gen de referencia se enumeran en la Tabla S1. La recogida de datos, incluyendo el factor de cambio en la expresión génica, se determinó a partir de la misma cantidad de ARN total.
Western Blot análisis
proteínas celulares totales se extrajeron y se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (350 mA durante 1 h), y se sondearon con anticuerpos contra UbB, UBC, UBA52, UbA80, pSTAT3, vimentina, pAKT y β-actina (Proteintech Group), MDR-1 y Oct4 (Santa Cruz), Sox2 y Nanog (Millipore). Las proteínas se visualizaron utilizando peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce) y se fotografió en XRS ChemiDoc ™ + Sistema con imagen de software Lab ™ (Bio-Rad).
inmunofluorescencia de mammospheres
mammospheres se recogieron después de aproximadamente 14 días, dependiendo de las tasas de crecimiento y tamaño, y luego se lavan dos veces con PBS y se centrifuga a 300 g. Los mammospheres se resuspendieron con el compuesto de la temperatura óptima de corte (O.C.T., Sakura) y se colocaron en nitrógeno líquido. esferoides congelados fueron luego cortados en secciones de 5 micras de grosor. Inmunofluorescencia de estas secciones congeladas se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante anticuerpo primario. imágenes de fluorescencia se realizó con un microscopio de escaneo láser confocal.
Citometría de flujo
células HeLa y HeLa /TSA se trataron durante 48 horas con TSA 1μM, DDP 30 mM (Sigma, P4393), o 75 nm paclitaxol o se irradiaron con UVB. Entonces, se tripsinizaron las células y se incubaron con anexina V-FITC y PI de acuerdo con el protocolo del fabricante. El porcentaje de la apoptosis se determinó utilizando BD citómetro de flujo FACSCalibur y software CellQuest Pro (BD).
Métodos Estadísticos
La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student para datos independientes usando software GraphPad Prism (versión 5.01) , a excepción de la comparación de la expresión UbB en muestras de tejido de cáncer cervical clínicos, que se analizó mediante la prueba de ANOVA de dos vías. Importancia para todas las pruebas se fijó en
p Hotel & lt; 0,05
Resultados
células HeLa /TSA-seleccionados HDACi prolongados eran resistentes a la quimioterapia
La incubación. de las células HeLa con TSA (500 nM) a diferentes puntos de tiempo (6, 12, 18 y 24 horas) indujo un aumento dependiente del tiempo en los niveles de proteína de ARNm UbB y ubiquitina (Figura 1A), mientras que las expresiones de los otros tres ubiquitina codificación de los genes (UBA52, UbA80 y UBC) no se vieron afectados. De manera similar, la incubación con diferentes concentraciones (200, 400, 600 y 800 nM) de TSA durante 24 horas también resultó en un aumento de la expresión génica UbB, mientras que no se observó cambio de las expresiones de los otros tres genes de ubiquitina-codificación. administración TSA, dentro de un cierto rango de concentración, durante 24 horas condujo a una estimulación específica dependiente de la concentración de UbB mRNA y expresión de la proteína (Figura 1B).
A, las células HeLa se trataron con 500 nM TSA para el indicado tiempos y se sometieron a análisis el nivel de mRNA de este búfer, UBC, UBA52 y UbA80 por PCR en tiempo real y el nivel de proteína correspondiente por el Western Blot. B, células HeLa se incubaron con TSA durante 24 horas a una dosis de 200 a 800 nm y se sometieron a análisis el nivel de mRNA de UbB, UBC, UBA52 y UbA80 por PCR en tiempo real y el nivel de proteína correspondiente por el Western Blot. C, el panel superior: platos representativos de la formación de colonias de ensayo en el día 7, 10 y 14. Panel inferior: número de colonias formadas en HeLa y HeLa /TSA en los días 7, 10 y 14. Las columnas representan la media de tres experimentos separados ; barras de error, SD; *,
p Hotel & lt; 0,05. células D, HeLa /TSA fueron tratados con TSA (1 M), DDP (30 mM), y PTX (75 nM) durante 48 h o UV, las células de la apoptosis se cuantificaron por Anexina V /tinción con PI y citometría de flujo análisis. se muestran los ejemplos representativos de la citometría de flujo resultados. E, células fueron tratadas como se describe en D, se informó de los porcentajes medios de las células de la apoptosis en los gráficos. Valores, porcentajes medios; barras de error, SD; *,
p Hotel & lt; 0.05 (n = 3 repeticiones).
Hasta que la mayoría de las células HeLa fue sometido a la apoptosis después del tratamiento con TSA (1 M durante 24 h y se mantiene con 200 nM de 7 a 10 días), las células supervivientes (HeLa /TSA) se sembraron para formar clones. Después de otros 10 a 14 días de crecimiento, la tinción de cristal violeta mostraron que las células HeLa /TSA tenían una capacidad proliferativa significativa en comparación con las células de control correspondientes. El número de colonias HeLa /TSA fue de aproximadamente 16 veces más que la del control en el día decimocuarto (
p
& lt; 0,01) (Figura 1C).
Para examinar aún más la sensibilidad de las células HeLa /TSA a TSA, se trataron células HeLa /células TSA TSA y con otros agentes de quimioterapia común. Como se muestra en los resultados de FACS, las células HeLa /TSA demostraron una resistencia notable no sólo para TSA (media 9,48% vs. 25,53%,
p
= 0,014), pero también cisplatino (DDP) (media de 13,25% vs. 53.76%,
p Hotel & lt; 0,01), paclitaxol (PTX) (media 8,69% frente al 35,36%,
p Hotel & lt; 0,01), e incluso la luz ultravioleta (UV) (media 15,38 % vs. 44,8%,
p
& lt; 0,01) (Figura 1D, E). Estos resultados sugieren que las células HeLa /TSA pueden contener un subconjunto enriquecida de células resistentes a los agentes quimioterapéuticos comunes, incluso UV.
HeLa /células TSA exhibió una sobre regulación de la expresión UbB y el aumento de la formación mammosphere
para investigar más la resistencia de las células HeLa /TSA a la quimioterapia ya la luz UV se relaciona con la expresión de este búfer, la expresión de ARNm en células HeLa /células se evaluó la TSA. Se observó un aumento significativo de UbB en células HeLa /TSA, mientras que ningún cambio aparente de los otros tres genes de ubiquitina (Figura 2A). Del mismo modo, también encontró un aumento significativo en el nivel de proteína de este búfer, no los otros tres genes de ubiquitina-codificación. Por otra parte, también encontramos la regulación de pSTAT3, vimentina y MDR-1, junto con la baja regulación de pAKT en células HeLa /TSA, en comparación con las células HeLa parentales (Figura 2B). Estos datos indican que las células HeLa /TSA eran quimio-resistente y que pueden estar relacionados con la alta expresión de este búfer. Por otra parte, la mayoría de las células HeLa /TSA estaban en un estado indiferenciado y la transición epitelio-mesenquimal que experimenta (EMT). Los resultados aquí presentados son consistentes con nuestros resultados anteriores, lo que indica que UbB es un mediador esencial de la matanza selectiva de tumor inducida por la TSA [6].
A, se analizaron las células HeLa /TSA para UbB, UBC, UBA52 mRNA y los niveles UbA80. Las columnas representan la media de tres experimentos separados; barras de error, SD; *,
p Hotel & lt; 0,05. B, se analizaron las células HeLa /TSA para los niveles de proteína de las proteínas Ub, pSTAT3, vimentina, pAKT y Mdr-1, β-actina se utilizó como control de carga. C, el análisis cuantitativo de la índice de proliferación se determina mediante el ensayo de CCK-8 durante los tiempos indicados. Los resultados mostrados son promediados a través de tres experimentos separados; barras de error, Dakota del Sur. D, ejemplos representativos de ensayo tranwell fueron fotografiados en 200 × aumentos. E, la apariencia de un Themorphologic mammosphere representante durante los tiempos indicados se photograghed a 200 × aumentos. F, los ensayos de formación de esferoides se realizaron mediante la limitación de la dilución con 256 células a una célula por pocillo de una placa de 96 pocillos adherente Ultra-Low. Este experimento se realizó para triples veces con seis pocillos por dilución también. El número de colonias se contó el día 14. G, células mammosphere de HeLa y HeLa /TSA fueron re-cultivaron en una placa adherente ordinario durante 24 h, y después se trató con TSA, DDP, y PTX durante 48 horas o UV para 5 min. Las células de la apoptosis se cuantificaron utilizando anexina V /PI tinción y el análisis de citometría de flujo. Los valores son (barras de error) medias y SD de 3 experimentos separados, *,
p Hotel & lt; 0,05. Se analizaron las células mammosphere H, HeLa /TSA para los niveles UbB, UBC, UBA52 mRNA y UbA80. GAPDH se usó como un control de referencia.
Además, examinó las características biológicas de las células HeLa /TSA y observamos que la proliferación de células HeLa /TSA fue significativamente mayor que en las células control HeLa, especialmente en largo cultura -term (Figura 2C). Además, la tasa de migración en células HeLa /TSA aumentó significativamente en la migración transwell ensayo (Figura 2D). Estos resultados sugieren que HeLa /células TSA exhibió un alto potencial maligno.
informes anteriores estudios han indicado que una selección continua prolongada de las células para la resistencia a los medicamentos enriquece las poblaciones de células con características de células madre, como el cáncer [8]. Los datos presentados anteriormente demostraron que HeLa /células TSA mostró un alto potencial maligno, que puede haber surgido bajo la presión selectiva de la quimioterapia. Hemos realizado experimentos para probar si las células HeLa /TSA fueron enriquecidas con células madre, como el cáncer. células HeLa /TSA se cultivaron en un estado no adherente para formar mammospheres. Hemos encontrado que las células HeLa /TSA tenían un potencial de formación de mammosphere significativamente mayor. Los mammospheres HeLa /TSA eran más grandes y crecieron más rápidamente que las mammospheres HeLa, que eran pequeños grupos de células que se adhirieron al plato y eran difíciles de marcar en el ensayo de dilución limitante (Figura 2E). Aunque las células HeLa tenían una tendencia a formar mammospheres, no fueron capaces de ser marcado después de la siembra menos de ocho células, mientras que sólo una célula HeLa /TSA tenía una probabilidad de 66,7% para formar un mammosphere (Figura 2F). Para determinar si esferoides fueron idénticas a las células cultivadas de forma adherente, que Trypsinized esferoides y les volvieron a cultivar en un estado adherente; estos re-adherente células HeLa /TSA todavía eran resistentes a TSA, DDP, PTX y UV, en contraste con los resultados para la re-adherente células HeLa, que no eran resistentes (Figura 2G). Por otra parte, la expresión de genes en UbB mammospheres HeLa /TSA seguía siendo significativamente mayor que en el control de células HeLa (Figura 2H) mammosphere.
Los datos anteriores indican que las células HeLa /TSA exhibieron una regulación de este búfer, pSTAT3 , vimentina, mientras que pAKT se había reducido regulado. Por otra parte, estas células eran indiferenciado y en un estado de quiescencia y exhibieron una mayor capacidad de formación de mammosphere-en una situación no adherente. Estas características de relieve que las células HeLa /TSA pueden contener células madre, como el cáncer, y este fenómeno podría estar relacionado con la sobre regulación de este búfer.
células HeLa /TSA tienen propiedades similares a madre de cáncer
a fin de examinar si las células HeLa /TSA fueron enriquecidas con células madre, como el cáncer, se realizó PCR en tiempo real para detectar la expresión de genes de biomarcadores de células madre. Se encontró que Sox2, Oct4, Nanog y fueron significativamente hasta reguladas en las células HeLa /TSA en comparación con HeLa mammospheres (Figura 3A). Western Blot confirmó que mammospheres HeLa /TSA expresan altamente los biomarcadores de células madre. Además, también encontramos MDR-1 y UbB se expresaron alta en HeLa /TSA células (Figura 3B). Del mismo modo, los resultados del ensayo de inmunofluorescencia mostraron que casi todas las células HeLa /TSA poseían las características principales de las células madre similares, a saber, la expresión de esos biomarcadores de células madre (Figura 3C).
A, HeLa /mammosphere TSA las células se analizaron para los niveles de Sox2, Oct4 y Nanog de ARNm. Las columnas representan la media de tres experimentos separados; barras de error, Dakota del Sur. B, El análisis cuantitativo de Sox2, Oct4, Nanog, MDR-1 y proteínas UbB niveles por Western Blot. mammosphere células C, HeLa /TSA se analizaron mediante inmunofluorescencia para Sox2, Oct4 y Nanog. Las fotografías representativas fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia (ampliación original, × 200). Los núcleos se presentan tal como se detecta utilizando
DAPI
(4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) tinción. D, El análisis de la fracción de células de lado a población en cultivos de células HeLa /TSA HeLa y. Panel izquierdo: HeLa; Panel derecho: HeLa /TSA. E, El análisis de la expresión de CD44 y CD24 de las células HeLa y HeLa /TSA. Panel izquierdo: HeLa; Panel derecho:. HeLa /TSA
Se ha informado de que el transportador de eflujo mediado por ABC empleado por el colorante Hoechst 33342 para aislar poblaciones secundarios de colorantes, con exclusión (PE) se enriquece en células madre de cáncer con propiedades -como en una variedad de tumores [10]. Usando diferencial Hoechst 33342 tinción para identificar los SP en células adherentes, se observó un aumento significativo de células SP-positivas en células HeLa /TSA en comparación con células HeLa parentales (media 8,3% frente a 0,8%,
p
& lt; 0,01, prueba t de Student pareado) (Figura 3D). Estudios anteriores mostraron que células madre cancerosas de mama de células mammosphere marcadores de superficie de CD44
+ CD24
exhibidos - [9,11]. Como HeLa /TSA exhibió una alta tasa de formación de esferoides, se analizó la expresión de CD44 y CD24 en células HeLa /TSA. Los resultados mostraron que 52,4% de HeLa /TSA era CD44
+ CD24
-., Que era similar a la anterior reportado en células madre cancerosas de mama (Figura 3E)
Estos datos mostraron que la selección del fármaco prolongada de HeLa /células TSA inducen una alta expresión de biomarcadores de células madre y un enriquecimiento de CD44
+ CD24
- células. Por lo tanto, las células HeLa /TSA pueden ser enriquecidas de las células que tienen propiedades madre-como el cáncer.
UbB siRNA podrían regular a la baja SP y esferoide formación
resistencia de las células madre de cáncer a los fármacos quimioterapéuticos se ha descrito previamente en una variedad de tipos de tumores, incluyendo el cáncer de ovario [10]. Para confirmar que el fenotipo maligno y la relación de células de alta SP de las células HeLa /TSA estaban relacionados con la alta expresión del gen UbB, hemos utilizado siRNA desmontables UbB en las células. Después de la transfección de células HeLa con 3 diferentes siRNAs que se dirigen a los CDS del gen UbB, hemos optado por utilizar UbBsi2 porque mostró una caída del 77% del gen UbB acuerdo con PCR en tiempo real y los resultados de Western Blot (Figura 4A, B) . Para transfectar de manera efectiva siRNAs en esferoides, introdujimos UbBsi2 en un vector de lentivirus (LV-UbBsi). Después de la precipitación del gen UbB tanto en HeLa y HeLa /esferoides TSA utilizando LV-UbBsi (Figura 4C), en tiempo real los resultados de PCR mostraron que aunque la expresión génica UbB de HeLa /esferoides TSA-LV-UbBsi era aún significativamente mayor que la de esferoides HeLa-LV-UbBsi (
p
& lt; 0,01) (Figura 4D), la diferencia entre estos grupos fue sólo 1,74 veces, que era mucho menor que la diferencia de 9,25 veces entre la HeLa no silenciado /esferoides TSA y el control HeLa (Figura 2H). Mientras tanto, la expresión de Sox2, Oct4 y Nanog en HeLa /células TSA se redujo significativamente después de la infección LV-UbBsi (Figura 4E, F), y el SP
+ proporción de células HeLa /TSA-LV-UbBsi se redujo significativamente desde 2,58% a 1,25% (
p
& lt; 0,01) (Figura 4G). Después de volver a cultivar las esferoides UbB-silenciosas en suspensión, se observó que el número de esferoides formados en células HeLa /TSA-LV-UbBsi se redujo de una media de 49 a 32 (
p
= 0,04) ( Figura 4H). Estos datos muestran que el silenciamiento UbB reduce visiblemente las propiedades madre-como tumores de células HeLa /TSA que sugieren que las propiedades de cáncer madre, de células HeLa /TSA puede estar relacionado con la alta expresión de este búfer.
A, HeLa las células fueron transfectadas con 10 nM UbB de metas de siRNA, RNAi o control de sigilo, durante 72 horas. Se procedió en tiempo real PCR análisis de la expresión relativa de ARNm UbB. GAPDH se usó como un control de referencia. B, El análisis cuantitativo del nivel de proteína UbB por Western Blot. Las células se trataron como se describe en A. Beta-actina se utilizó como control de referencia. células mammosphere C, HeLa y HeLa /TSA fueron infectadas con LV-UbBsi, que fue clonado con UbBsi2, durante 72 horas y se sometió a análisis por transferencia de Western para el nivel de proteína UbB. Se analizaron las células infectadas mammosphere-LV-UbBsi D, para los niveles UBB, UBC, UBA52 mRNA y UbA80. GAPDH se usó como un control de referencia. Las columnas representan la media de tres experimentos separados; barras de error, Dakota del Sur. E, se analizaron las células HeLa mammosphere /TSA infectadas por LV-UbBsi para los niveles de Sox2, Oct4 y Nanog ARNm. GAPDH se usó como un control de referencia. Las columnas representan la media de tres experimentos separados; barras de error, Dakota del Sur. Se analizaron las células HeLa mammosphere /TSA infectadas por LV-UbBsi F. de los niveles de proteína Sox2, Oct4 y Nanog. Beta-actina se utilizó como control de referencia. G, El análisis de la fracción de células de lado a población en HeLa infectadas-UbBsi LV y cultivos de células HeLa /TSA. H, Los ensayos de formación de esferoides se realizaron en células infectadas por LV-UbBsi.
podrían formar células HeLa Menos /TSA xenoinjertos
in vivo
A fin de validar el potencial de tallo como de las células HeLa /TSA, se realizó un
in vivo
experimentos por inyección subcutánea de 100 a 5000 células en los ratones NOD /SCID. No hemos podido detectar ninguna diferencia en la tumorigenicidad entre las células HeLa /TSA y HeLa cuando se inyecta más de 1.000 células (Figura 5A, B). Sin embargo, cuando se implantaron a menos de 500 células, las células HeLa /TSA exhibieron un estado potencialmente más tumorigénico (Figura 5 C, D). Además de las diferencias en el crecimiento medio del tumor, las células HeLa /TSA iniciaron los tumores más frecuentes (6/6 inyecciones) que los padres HeLa (3/6 inyecciones) células (
p
= 0,04) en respuesta a una inyección de 500 células (Tabla 1). Además, las células HeLa /TSA iniciaron tumores en 6/6 inyecciones, mientras que las células HeLa no iniciaron tumores (0/6 inyecciones) cuando se implantaron 100 células. La mayor capacidad para el crecimiento tumoral
in vivo
era consistente con el crecimiento maligno en cultivo de células adherentes. Después de desmontables de UbB por LV-UbBsi, aunque HeLa /TSA-LV-UbBsi podría formar xenoinjertos a la misma frecuencia en comparación con HeLa /TSA-LV-con cuando se inyecta con 500 células infectadas (Figura 5E), el tamaño y peso de las xenoinjertos se redujeron significativamente (Figura 5F, G, H). Estos resultados confirmaron que HeLa /células TSA exhibió un alto potencial tumorigénico que podría reducirse al silenciar este búfer. Se inyectaron
p>
p = 0,001
, de dos vías ANOVA; 6 ratones /grupo. H, Los pesos de los tumores de xenoinjertos describen en G. Las líneas horizontales representan el peso medio; barra de error, Dakota del Sur;
p Hotel & lt; 0,001, de dos vías ANOVA; 6 ratones /grupo.
Línea celular Nº
de células inyectadas
No. de tumores /No. harvest
HeLa50006/66750.485110005/66280.41545004/66680.46571000/6☆0☆HeLa/TSA50006/68520.595110006/65730.39545006/68100.53571006/65700.3960Table