Extracto
En los últimos años, largos ARNs no codificantes (lncRNAs) han demostrado que desempeñan un papel clave en la tumorigénesis. Sin embargo, las contribuciones de lncRNAs a cáncer cervical (CC) siguen siendo en gran parte desconocido. En este estudio, expresado diferencialmente lncRNAs y mRNAs en el cáncer cervical y los tejidos peritumorales emparejados se detectaron por análisis de transcriptoma de microarrays. Hemos encontrado 708 conjuntos de sonda de lncRNAs aumentaron y disminuyeron 836 conjuntos de sonda en los tejidos CC, mientras que 1288 conjuntos de sonda diferencial de mRNA aumentaron y 901 conjuntos de sonda de ARNm disminuyó. Los resultados fueron validados por reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR). Entonces, nos encontramos con una específica expresados diferencialmente lncRNA puede unirse físicamente al potenciador de zeste homolog2 (EZH2) mediante el uso de ARN inmunoprecipitación. Hemos denominado como lncRNA EZH2 vinculante en el cáncer de cuello uterino [lncRNA-EBIC]. Se usaron ensayos de curación de heridas y ensayos de invasión de Matrigel para determinar la función de esta lncRNA silenciando él. Se observó que la migración y la invasión de células de cáncer cervical
in vitro
fueron inhibidas a la supresión de la lncRNA-EBIC de siRNA. También se encontró que era necesaria la asociación entre lncRNA-EBIC y EZH2 para la represión de la E-cadherina, que era un molecular clave en la metástasis del cáncer de cuello uterino.
Conclusión
Estos resultados demostraron que lncRNA-EBIC era un lncRNA oncogénico, lo que podría promover la invasión de células tumorales en CC mediante la unión a EZH2 y la inhibición de la expresión de e-cadherina
Visto:. Nx Sun Ye C, Zhao Q, Q Zhang, Xu C , Wang Sb, et al. (2014) Largo Noncoding ARN-EBIC promueve la invasión de células tumorales mediante la unión a EZH2 y la represión de E-cadherina en cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 9 (7): e100340. doi: 10.1371 /journal.pone.0100340
Editor: Vinod Scaria, Instituto CSIR de Genómica y Biología Integrativa, India
Recibido: 30 Enero, 2014; Aceptado: 26-may de 2014; Publicado: 9 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencia Natural de China (Nº 81272213), http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm, y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai (13ZR1414300), http: //www. stcsm.gov.cn. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical (CC) es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado y la tercera causa principal de muerte por cáncer en las mujeres [1]. Aproximadamente 49.000 nuevos casos de CC fueron diagnosticados y 275.000 mujeres fueron asesinadas en 2011, lo que produjo la mayor parte de los países en desarrollo [2], [3]. Además de la patogénesis de la persistencia, el virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH), la contribución de otros factores para el desarrollo y la progresión de esta enfermedad maligna necesitan ser aclaradas.
Más recientemente, nuevas evidencias han demostrado que mecanismos epigenéticos pueden ser la clave para iniciar la tumorigénesis. La interrupción de control epigenético de metilación del ADN, la regulación de ARN, y la modificación de histonas, etc, dando como resultado la variación hereditaria de genes sin un cambio en su secuencia de codificación, es un fenómeno generalizado en malignidad [4], [5]. A pesar de que las investigaciones de los pequeños RNAs no codificantes han dominado el campo de la regulación de ARN en los últimos años [6], [7], una amplia gama de funciones celulares también se ha asociado con algunas clases de reciente descripción de los ARN no codificantes. Una de estas clases, los ARN no codificantes largas (lncRNAs), es transcripción de más de 200 nucleótidos con ningún potencial de codificación de proteína. Numerosos informes han demostrado que su misregulation tiene un papel funcional en varios tipos de cánceres [8]. Por ejemplo, lncRNA-HEIH juega un papel clave en la regulación del ciclo celular de células de carcinoma hepatocelular, y la expresión de alto lncRNA-HEIH se correlaciona con un aumento del riesgo de recurrencia y la reducción de la tasa de supervivencia postoperatoria general [9]. Como lncRNAs están emergiendo como componentes críticos del transcriptoma cáncer, es razonable prever que lncRNAs contribuyen al desarrollo y progresión del cáncer de cuello uterino. Sin embargo, los estudios sobre el papel de lncRNAs en CC son muy preliminares. Hasta ahora sólo una investigación ha detectado un aumento de los niveles de expresión lncRNA aberrante en la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) muestras que representan los grados histopatológicos leve, moderada y grave, respectivamente, lo que sugiere que lncRNAs puede desempeñar un papel importante en el desarrollo y la progresión de las lesiones precancerosas o carcinomas [10]. Sin embargo, las contribuciones fisiopatológicos generales de lncRNAs en CC siguen siendo en gran parte desconocido.
Un estudio reciente ha informado de que una quinta parte de todos los lncRNAs humanos identificados hasta la fecha se asocia físicamente con Polycomb complejo represivo 2 (PRC2, compuesto de histona H3 lisina 27 metilasa EZH2, SUZ12 y EED), lo que sugiere que pueden tener un papel general en las proteínas del grupo polycomb-reclutamiento de sus genes diana y que conduce a la represión transcripcional [11]. EZH2 (potenciador de Zeste Homólogo 2) es un componente crítico de PRC2, que está implicada en varios mecanismos de regulación importantes, tales como la diferenciación de células madre, la proliferación celular, el ciclo celular, y la oncogénesis [12], [13]. Hay cada vez más evidencias de que EZH2 se expresa a menudo sobre-en muchos tipos de cánceres humanos y podrían promover la proliferación celular, la invasión y la angiogénesis del tumor [14] - [16]. Por otra parte, varios lncRNAs, como lncRNA-HEIH, H19 y HOTAIR, han demostrado que se unen físicamente al EZH2 y jugar un papel importante en la modulación del epigenoma del cáncer [9], [17], [18]. Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que algunos lncRNAs también pueden desempeñar un papel activo en los comportamientos biológicos malignos de CC mediante la intermediación y cooperar con EZH2.
Así que será interesante determinar las funciones biológicas de lncRNAs en CC y si funcionan para reclutar proteínas PcG a sus genes diana. En este estudio, a través del análisis del transcriptoma de microarrays, encontramos una serie de lncRNAs arriba o hacia abajo-regulada en CC en comparación con los tejidos peritumoral pareadas. Se identificaron, además, una nueva lncRNA que fue hasta reguladas en CC y podría unirse físicamente al EZH2 y participar en la regulación de la migración y la invasión de líneas celulares de CC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Especialidad de Investigación Biomédica de la Segunda Universidad médica Militar. escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes para el uso de sus muestras de tejido en este proyecto de investigación.
Características de los pacientes y muestras de tejido
Veintiocho pares de CC congelaron rápidamente y tejidos peritumoral apareados eran obtenido del hospital Changzheng de Shanghai con el consentimiento informado y la aprobación por el comité de ética institucional. muestras de tejidos clínicos se verifican tal y como tumor o no tumor por examen histopatológico y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. características de los pacientes se detallan en la Tabla S1.
Microarray y análisis computacional
En resumen, cinco tejidos CC y cinco tejidos peritumoral emparejados (Tabla S1) se utilizaron para sintetizar ADN de doble hebra complementaria ( ADNc) mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. CDNA de doble cadena se hibridó con los arrays de cola de Grant Transcriptome Humano (Affymetrix, EE.UU.), según el protocolo del fabricante, y la expresión Affymetrix consola de software (versión 1.3.1) se utilizó para el análisis de microarrays. Los datos en bruto (archivos CEL) se normalizaron a nivel de transcripción usando el método multi-media robusta (RMA flujo de trabajo). Se calculó el resumen mediana de la expresión del transcrito. datos a nivel de genes representados genes que se encuentran en el Rfamdb, fRNAdb, Ensembl, Noncodedb, y bases de datos RefSeq. Utilizando el mismo método, los datos a nivel exón representados transcripciones de larga duración. Se utilizó la prueba t de varianza modelo aleatorio (RVM) para identificar los genes expresados diferencialmente entre el CC y grupos peritumoral, sin aumentar la tasa de falsos positivos [19]. Se seleccionaron los genes expresados diferencialmente de acuerdo con la RVM y la tasa de falso descubrimiento (FDR) analiza, con un p-valor umbral predefinido de & lt; 0,05 [20]. La agrupación jerárquica (Cluster3.0) y el análisis de TreeView (Universidad de Stanford, EE.UU.) se realizaron sobre la base de los resultados de los genes expresados diferencialmente. Los microarrays de datos descritas en este artículo se han presentado al Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) y son accesibles a través de número de acceso (GEO) Serie GSE55940 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE55940).
filtrado de datos y la creación de una red de genes co-expresión
un diseño de la consulta de Microsoft Office Access 2013 se utilizó para solapar diferencialmente genes expresados con la base de datos de genes del cáncer cervicouterino (CCDB) por el símbolo de genes. análisis de redes co-expresión se llevó a cabo entre los genes de superposición y diferenciales lncRNAs para identificar las interacciones de genes [21]. redes de co-expresión se construyen de acuerdo a la intensidad de la señal normalizada de genes expresados específicos. En primer lugar, se construyó la matriz de adyacencia red como se describe anteriormente [22]. En segundo lugar, se calculó la correlación de Pearson para cada par de genes y elegimos los pares de correlación prominentes para construir la red. Para hacer una representación visual, sólo se seleccionaron los genes con la interacción fuerte (0,865 o mayor). En el análisis de la red, un título es el parámetro más importante de la centralidad de un gen dentro de una red que determina la importancia relativa. centralidad de grado se define como el número de enlaces de un nodo tiene a otro. Para explorar el grado de diferencia de ciertos genes del cubo y vecinos entre el cáncer y grupos peritumoral,