Extracto
fenilbutil isoselenocyanate (ISC-4) es un inhibidor de Akt con eficacia preclínica demostrado contra el melanoma y el cáncer de colon. En este estudio, hemos tratado de mejorar la utilidad clínica de ISC-4 mediante la identificación de una combinación sinérgica con las terapias aprobadas por la FDA contra el cáncer, la enfermedad de un entorno relevante y apropiado para las pruebas, y los biomarcadores de respuesta. Hemos probado la actividad de ISC-4 y 19 agentes anticancerosos aprobados por la FDA, solos o en combinación, contra las líneas celulares de cáncer de colon humano SW480 y RKO. Se identificó una interacción sinérgica con cetuximab y validado en un panel de líneas celulares de cáncer de colon adicionales, así como la cinética de la sinergia. ISC-4 en combinación con cetuximab reduce sinérgicamente la viabilidad de las células de cáncer de colon humano con el de tipo salvaje, pero no mutante
KRAS
genes. Un análisis adicional reveló que la terapia de combinación redujo cooperativamente la progresión del ciclo celular, aumento de la apoptosis dependiente de caspasa, y disminución de la fosfo-Akt en células tumorales sensibles. El sinergismo entre ISC-4 y cetuximab se retuvo de forma independiente de la resistencia adquirida a 5-FU en células de cáncer de colon humano. La combinación demuestra efectos antitumorales sinérgicos
in vivo
sin toxicidad y en la cara de la resistencia a 5-FU. Estos resultados sugieren que la combinación de ISC-4 y cetuximab debe explorarse en pacientes con cáncer de colon 5-FU resistentes a la acogida de tipo salvaje
KRAS
Visto:. Allen JE, Gallant JN, Dicker DT, Amin S, Irby RB, Sharma AK, et al. (2013) Los Akt inhibidor de ISC-4 sinergia con cetuximab en cáncer de colon 5-FU-resistente. PLoS ONE 8 (3): e59380. doi: 10.1371 /journal.pone.0059380
Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: 13 Febrero 2013; Publicado: 12 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Allen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas a WSE-D. y los fondos del Instituto de Penn State Hershey Cáncer, NIH Instituto Nacional del Cáncer de subvención R03-CA143999 a A.K.S., y la beca de la Fundación de Investigación del Cáncer de pulmón de A.K.S. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores reconocen el interés en competencia que el Dr. El-Diery es miembro del consejo editorial para PLOS y, conforme a lo solicitado, confirme que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
isoselenocyanates fenilalquilo (SICS), los análogos de selenio isostéricas de la clase isotiocianato de origen natural de los compuestos [1], [2], se han desarrollado recientemente en nuestros laboratorios y se ha demostrado que inhiben la actividad de Akt [3], [4], [5], [6]. Entre el ISC investigado, ISC-4 ha mostrado la mejor actividad antitumoral en modelos preclínicos, tanto
in vitro
y
in vivo
, con la seguridad prometedora [4]. ISC-4 ha demostrado una eficacia modesta preclínica contra muchos tipos de tumores
in vitro
, y los efectos antitumorales se han reportado en el contexto del melanoma cuando ISC-4 se utiliza un mono-agente de
in vivo
[4], [5], [6]. ISC-4 también ha mostrado efectos antitumorales significativos, a través de la inhibición de Akt, en xenoinjertos de cáncer de colon cuando se utiliza como agente de mono-y cuando se utiliza en combinación con 5-fluorouracilo (5-FU) -aunque la utilidad clínica de la combinación era poco clara [5].
la PI3K /Akt es sobre-activado o alterado en la mayoría de los cánceres colorrectales, que es el tercer cáncer más frecuentemente diagnosticado y mortal en los Estados Unidos [7]. La quimioterapia estándar de atención para la enfermedad avanzada incluye el FOLFOX o regímenes FOLFIRI, que se compone de 5-FU, leucovorina, oxaliplatino e irinotecán, además de otras opciones de tratamiento que incluyen el bevacizumab anticuerpo monoclonal anti-VEGF y el anti anticuerpo monoclonal cetuximab -EGFR. Si bien estas opciones de combinación de tratamiento han mejorado la supervivencia de los pacientes, se necesitan opciones de tratamiento dirigido no tóxicos adicionales en el entorno de la terapia-refractario del cáncer de colon avanzado.
A pesar de la actividad de mono-agente preclínica de ISC-4 es , la terapia de combinación significativa no se ha explorado a fondo. Por lo tanto, se realizaron búsquedas de combinaciones sinérgicas con ISC-4 utilizando un panel de medicamentos aprobados por la FDA. A continuación, se presenta la identificación de ISC-4 y cetuximab como terapia de combinación prometedora que tiene actividad antitumoral sinérgico
in vitro
y
in vivo
contra los cánceres de colon humano que albergan una de tipo salvaje
KRAS
gen.
Materiales y Métodos
cultivo celular, ensayos de viabilidad celular y reactivos
Las líneas celulares se obtuvieron a partir de ATCC y se cultivaron en ATCC- Soporte recomendado en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 y 37 ° C. Las líneas celulares utilizadas en este estudio no se autentican. Para los ensayos de viabilidad celular, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos de paredes negras en una concentración de 1 × 10
5 células por ml en medio fresco y en un volumen de 100 l por pocillo. Las células se dejaron adherir durante la noche y se trataron al día siguiente como se indica. Al final del estudio, CellTiter-Glo (Promega) los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la lectura bioluminiscente se registró en un sistema de imágenes IVIS (Xenogen). Para la sincronización de células, las células se incubaron con 200 ng /mL nocodazol durante 16 horas antes del tratamiento. La cloroquina se obtuvo de Sigma. zVAD-fmk se obtuvo de Promega y se utiliza a una concentración de trabajo de 25 mM. ISC-4 se sintetizó como se ha descrito anteriormente [6].
La citometría de flujo
Para el análisis de contenido de ADN sub-G1, las células se trataron con tripsina en los puntos de tiempo indicados y se fijaron en etanol al 80% a las 4 ° C durante un mínimo de 30 minutos. Las células fijadas fueron teñidas con yoduro de propidio en presencia de RNasa y se analizaron en un citómetro de flujo Epics Elite (Beckman Coulter). Para la expresión Ki-67, las células fueron etanol fijo, como se describe anteriormente, y a inmunotinción con un anticuerpo anti-Ki-67 (Sigma) a 1:500 durante 30 minutos. Las células se incubaron posteriormente con Alexafluor anticuerpo 488-conjugado en 1:500 en PBS durante 30 minutos y se resuspendieron en PBS para el análisis.
análisis de transferencia de Western
Las células se trataron en el crecimiento de fase log, cosechadas por raspado de células, se centrifugaron, y se lisaron en hielo durante 2 horas con tampón de lisis celular. Se recogió el sobrenadante después de la centrifugación, y se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Las muestras se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras en NuPAGE 4-12% geles de Bis-Tris (Invitrogen), se transfirió a PVDF, y se bloquearon en leche desnatada al 10% en TBST durante 1 hora. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios obtenidos a partir de la célula de señalización en la leche no grasa 1:1000 en 2% en TBST durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron en TBST, se incubaron con el anticuerpo apropiado conjugado con HRP secundaria (Thermo-Scientific) durante 1 hora, se lavaron en TBST, y se visualizaron utilizando ECL-Plus (Amersham) y película X-Ray (Thermo-Scientific).
En vivo
estudios
atímicos ratones desnudos hembra (Charles River Laboratories) se inocularon con 1 × 10
6 5-FU de RKO resistentes o células HT-29 en cada flanco trasero en forma de suspensión 200 l de 1:01 Matrigel (BD): PBS. El tratamiento se inició una vez que los tumores alcanzaron un volumen medio de ~1650 mm
3, intraperitoneal o inyecciones intravenosas se administraron en un volumen total de 200 l en DMSO. Para el análisis de tejido, el tejido se cosechó a partir de ratones sacrificados y se fijó en paraformaldehído al 4% en PBS durante 48 horas. El tejido se incluido en parafina y se seccionaron por el Fondo para Histología Core en Penn State Hershey Medical Center. H & amp; E tinción (Daiko) y la tinción de TUNEL (Millipore) se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para los ensayos de química en suero, 1 ml de sangre se recogió a partir de ratones anestesiados por punción cardiaca terminal del ventrículo izquierdo. Para la química del suero, 500 l se colocó en un tubo de microcentrífuga y se dejó coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por centrifugación. El suero se retira, se centrifuga de nuevo para eliminar cualquier residuo adicional, y presentado para su análisis por el Laboratorio de Diagnóstico de Medicina Comparada en la Universidad Estatal de Pensilvania Hershey Medical Center. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Penn State Hershey Medical Center.
Estadísticas
Las comparaciones por pares fueron evaluados por el Student de dos -tailed t-test en Microsoft Excel. índices combinados se calcularon con el software Calcusyn (BioSoft) utilizando el método de Chou-Talalay [8].
Resultados
Definición del ISC-4
in vitro
actividad en el perfil
Hemos probado el mono-agente de
in vitro
actividad de ISC-4 en un panel de líneas celulares de cáncer humano para caracterizar su espectro de actividad. Entre las líneas celulares ensayadas, las líneas celulares de linfoma Daudi humanas y Granta fueron las más sensibles, y el cáncer de próstata líneas celulares PC3 y DU145 humana fueron los menos sensible en términos de CE
50 valores (fig. 1A). Con la excepción de HT-29, líneas celulares de cáncer de colon humano fueron moderadamente sensibles al tratamiento ISC-4. Las líneas celulares HCT116 isogénicas indican que la actividad de ISC-4 es probable que p53 y Bax-independiente. Con el fin de caracterizar mejor los efectos terapéuticos de ISC-4 y, potencialmente, mejorar su actividad combinatoria, nos hemos centrado en el estudio de ISC-4 en el cáncer de colon debido a la actividad de agente de mono-moderada [5].
( A) ensayos de viabilidad celular y calculado CE
50 valores para las líneas celulares indicadas tratados con ISC-4 o DMSO (72 h, n = 3). Efecto del tratamiento ISC-4 en los perfiles del ciclo celular de HCT116 síncrona y asíncrona (B) y las líneas (C)-HT 29 celulares. células asíncronas se indican con A en la figura. (D) Contenido de sub-G1 de líneas celulares de cáncer de colon indicados siguiente ISC-4 tratamiento (0, 1, 2, 4, 8 ó 16 mM).
Análisis
Ciclo celular de ISC-4 tratados con HCT116 sincronizada y HT-29 líneas celulares de cáncer de colon humano revelaron un modesto aumento en el contenido de sub-G1 y una disminución en la tasa de progresión del ciclo celular (Fig. 1B-C). inducida por ISC-4 contenido de sub-G1 es dosis-dependiente y por lo general se hace evidente en & gt; 8 M (Fig. 1D). Por lo tanto, ISC-4 tiene actividad como agente único modesta contra las células de cáncer de colon humano, causando la muerte celular y una disminución en la proliferación.
Identificación de una combinación sinérgica con ISC-4
Se realizaron búsquedas de combinaciones sinérgicas de ISC-4 con terapias aprobadas por la FDA para mejorar la eficacia de ISC-4 contra el cáncer de colon. Se seleccionaron las líneas celulares de cáncer de colon humano SW480 y RKO para el perfil inicial sobre la base de sus alteraciones genéticas oncogénicos heterogéneos. SW480 tiene mutante
p53
, mutante
KRAS
, y de tipo salvaje
BRAF
mientras que la RKO tiene de tipo salvaje
p53
, de tipo salvaje
KRAS
y mutante
BRAF
genes [9]. Entre el panel de ensayo de quimioterapias y agentes dirigidos, se observó actividad combinatoria en al menos una línea celular cuando ISC-4 se combinó con sorafenib, gefitinib, gemcitabina, cisplatino, bortezomib, imatinib, o cetuximab (Figura 2; Tablas S1, S2) . Sin embargo, la combinación de ISC-4 y cetuximab era la única terapia combinatoria sinérgico observado en las condiciones ensayadas. Por otra parte, esta sinergia se observó solamente en la línea celular RKO, que alberga tipo salvaje
KRAS
, y no en la línea celular SW480 que alberga
KRAS
G12V
. Esta observación está de acuerdo con el requisito de tipo salvaje
KRAS Opiniones de la eficacia clínica de cetuximab en el cáncer de colon [10], [11].
Ensayos de viabilidad celular en SW480 y de colon RKO líneas celulares de cáncer tratados con ISC-4 (1, 2, o 4 M) y se indican las terapias en putativo CE
12,5, EC
25, y CE
50 solo y en combinación (n = 3). Las dosis se proporcionan en la Tabla S1.
ISC-4 y cetuximab inhibe sinérgicamente KRAS no mutado proliferación de células tumorales
Se evaluó la actividad sinérgica de ISC-4 y cetuximab en varios humana líneas celulares de cáncer de colon. En línea con nuestra observación anterior, la actividad sinérgica sólo se observó en 29 HT-y líneas de células RKO, que tienen de tipo salvaje
KRAS
genes, y no en HCT116, otras líneas celulares de cáncer de colon DLD-1, y con el mutante
KRAS
genes (figura 3A;. Tabla S3; los datos no presentados). Curiosamente, la interacción sinérgica entre ISC-4 y cetuximab parece ser con respecto a la concentración ISC-4 pero independiente de la concentración cetuximab dependiente de la dosis. Para evaluar esta actividad combinatoria en un entorno clínicamente relevante, hemos probado la eficacia sinérgica de ISC-4 y cetuximab en los clones RKO con la resistencia evolucionado a 5-FU. Debido a que el 5-FU es una terapia estándar de atención para el tratamiento del cáncer de colon, las terapias que ofrecen beneficios en el cáncer de colon 5-FU resistentes son necesarios en la clínica. La actividad sinérgica de ISC-4 y cetuximab se mantuvo a pesar de adquirido 5-FU-resistencia en las células de cáncer de colon ensayados (Fig. 3B-C). En conjunto, estos datos identifican el cáncer de colon 5-FU-resistente con el tipo salvaje
KRAS
genes como un entorno clínico adecuado que puede beneficiarse de ISC-4 y la terapia combinatoria cetuximab.
(A) ensayos de viabilidad celular de líneas celulares de cáncer de colon humano tratados con ISC-4 y cetuximab en dosis indicadas durante 72 horas (n = 3). (B) ensayo de viabilidad celular de tipo salvaje y células RKO 5-FU-resistentes tratados con 5-FU tal como se indica durante 24 horas (n = 3). (C) células RKO 5-FU-resistentes tratados con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /ml) durante 24 horas (n = 3).
Se determinó la cinética de la eficacia sinérgico observado y se encontró dicha actividad a las 8 horas post-tratamiento, con una mayor sinergia a las 12 horas (Fig. 4A). Esta observación sugiere que la actividad sinérgica de ISC-4 y cetuximab es tal vez en lugar de citotóxico citostático. Los cambios en la morfología celular, así como el marcaje fluorescente de ADN, de las células de cáncer tratados revelaron que el tratamiento ISC-4 y la combinación de cetuximab causa aparente fragmentación del ADN (figura 4B;.. Fig S1A). Un análisis más detallado reveló que la combinación de ISC-4 y cetuximab cooperativa y aumentan significativamente el contenido de sub-G1 en comparación con los mono-agentes, pero el contenido de sub-G1 combinatoria no era suficiente para explicar plenamente la sinergia (Fig. 4C) observado. contenido de sub-G1 inducida por ISC-4 fue significativamente inhibida por la co-incubación con el inhibidor pan-caspasa zVAD-fmk, lo que sugiere que la combinación induce la apoptosis dependiente de caspasa. En el apoyo de esta observación, la combinación de ISC-4 y cetuximab sinérgicamente inducida por la activación de caspasa-3 (Fig. 4D).
(A) ensayos de viabilidad celular de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M ) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación para el período de tiempo indicado (n = 3). (B) tinción DAPI de células RKO tratadas como en (A) durante 12 horas. Las flechas blancas indican las células con ADN fragmentado. (C) el contenido de sub-G1 de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación durante 12 horas (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con todos los grupos de tratamiento por parte de dos colas
t de Student
. (D) ensayo de caspasa-Glo de células RKO tratadas con ISC-4 (2 uM) en combinación con cetuximab (0, 0,25, 0,5, o 1 mg /ml) a las 24 horas post-tratamiento. El panel inferior muestra la cuantificación de ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /ml) (n = 3).
Western blot reveló que el ISC-4 en combinación con cetuximab reduce de forma cooperativa fosfo niveles -Akt, pero no fosfo-ERK, a un nivel muy modesta a las 24 horas después del tratamiento (Fig. 5a). Sin embargo, un tiempo de análisis reveló que la combinación ablación cooperativamente niveles phosho-Akt desde las 4 horas post-tratamiento (Fig. 5B). líneas celulares humanas de cáncer de colon que mostraron una respuesta sinérgica para ISC-4 y cetuximab también respondieron con una disminución significativa en fosfo-Akt (Fig. 5C). Sin embargo, líneas celulares de cáncer de colon humano que albergan KRAS mutantes que no responden de forma sinérgica para la terapia de combinación también no mostraron ningún cambio en los niveles de fosfo-Akt en respuesta al tratamiento. Por lo tanto, los niveles de fosfo-Akt parecen correlacionarse con la respuesta antitumoral a ISC-4 y cetuximab. No se observó ningún efecto sobre Ki-67 expresión o escisión LC3B, un marcador de la autofagia, con la combinación (Fig. S1B-D). Estas observaciones indican que peinar ISC-4 con cetuximab conduce a una disminución de cooperación en fosfo-Akt y la viabilidad celular y que estén acompañados por un aumento de la apoptosis.
(A) Western blot de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación durante 24 horas. Densitometría de los niveles de fosfo-Akt se muestran por encima de la mancha como normalizaron a Ran como en relación con el tratamiento de control. (B) Análisis de transferencia Western de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación por períodos de tiempo indicados. Ran se muestra como control de carga. (C) Análisis de transferencia Western de líneas celulares de cáncer de colon humano que se indican después del tratamiento con la combinación (Rx) de ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /ml) durante 8 horas. *
P
. & Lt; 0,05 comparado con el control
ISC-4 y cetuximab ejercer efectos antitumorales sinérgicos sin toxicidad
in vivo
con el fin de imitar su entorno clínico probable y utilidad, hemos probado la eficacia antitumoral de ISC-4 en combinación con cetuximab en xenoinjertos subcutáneos 5-FU resistentes a RKO avanzadas. En esta configuración, se encontró que la terapia de combinación tiene un efecto sinérgico sobre inicial la progresión tumoral y causado estasis tumoral para la primera semana de tratamiento (Fig. 6A). análisis de tejido reveló que los xenoinjertos que recibieron la terapia de combinación tuvieron mayores niveles de necrosis por histología y la apoptosis mediante tinción TUNEL de xenoinjertos que reciben cualquier agente solo (Fig 6B;.. Fig S2A). El régimen de dosificación terapéutica empleada en estos estudios fue bien tolerado y no alteró el peso corporal del ratón o el cambio en la histología hepática (Fig. S2 B-C).
(A) tamaños tumorales relativos de RKO 5-FU resistentes xenoinjertos en 4 días después del tratamiento con una dosis única de ISC-4 (3 mg /kg, ip), cetuximab (10 mg /kg, iv), o la combinación (N≥5). tumores individuales se normalizaron a su tamaño de línea de base medido en el día 0. * P & lt; 0,05 en comparación con todos los grupos tratados con cola dos de Student
t
prueba. (B) con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y tinción de la tinción de TUNEL de tumores de xenoinjertos cosecharon 24 horas después del tratamiento. (C) ratones hembra desnudos atímicos que albergan estableció HT-29 xenoinjertos de tumores se trataron con ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), la combinación, o cetuximab y 5-FU (25 mg /kg, iv) una vez por semana a partir del día 0 (n≥8). Las barras de error indican SEM de repeticiones. *
P Hotel & lt; 0,05 comparado con el control
A continuación exploramos la combinación de ISC-4 y cetuximab en HT-29 xenoinjertos en ratones en comparación con monoagents y la combinación de. cetuximab y 5-FU. Se encontró que el ISC-4 y cetuximab redujeron fuertemente la progresión del tumor, a diferencia de los monoagents, cuando se administra en dosis intravenosas semanales que tenían mucho espacio aparente en volumen del tumor y las mediciones del peso del tumor (Figura 6C;. Fig. S2D). Además, la combinación exhibe actividad antitumoral superior en comparación con la combinación de 5-FU y cetuximab en estas condiciones experimentales. Esta combinación fue bien tolerada de nuevo (Fig. S2E) y además, el análisis de la química del suero no reveló cambios significativos en los electrolitos, la función del hígado, u otros marcadores moleculares relacionados con renal o toxicidad cardiaca con la dosificación crónica (Tabla S4). En conjunto, estos datos de eficacia y seguridad indican que la actividad combinatoria de cetuximab e ISC-4 debe ser evaluado en ensayos clínicos futuros con cáncer de colon 5-FU-refractario albergar de tipo salvaje
KRAS
genes.
Discusión
ISC-4 es un inhibidor de Akt prometedor que ha demostrado actividad anti-tumoral en varios estudios preclínicos [3], [4], [5]. La sinergia observada entre ISC-4 y cetuximab como una terapia de combinación permite ISC-4 para ejercer citotoxicidad a las dosis micromolares bajas frente a células de cáncer de colon humano, que puede ser una dosis más alcanzable
in vivo
. La combinación parece inducir mayores niveles de apoptosis tanto
in vitro
y
in vivo
, aunque otros mecanismos antitumorales pueden contribuir a la sinergia. Esta observación coincide con la anterior conclusión de que perifosine, un inhibidor de PI3K /Akt, sinergia con agentes que inhiben EGFR, como cetuximab [12]. Los estudios futuros deben comparar ISC-4 con perifosine solo y en combinación con cetuximab para determinar su potencia relativa y potencial como nuevos tratamientos para el cáncer humano.
Los estudios futuros deben examinar los mecanismos subyacentes de la sinergia entre los dos agentes. Especial atención se debe prestar al efecto combinatorio de fosfo-Akt, que sirve como marcador de respuesta terapéutica a la combinación y se puede emplear en futuros ensayos clínicos. Curiosamente, se observó la sinergia entre estos dos agentes en las células HT29 y RKO, que poseen genes mutantes BRAF y PIK3CA que debería tener un impacto positivo sobre la actividad de Akt. Combinatoria
in vitro se observó actividad en
de ISC-4 con varios otros agentes y quimioterapias específicas aprobadas, aunque no sinérgico, y merece una mayor investigación. La actividad de ISC-4 contra el linfoma debe ser explorado aún más dada la relativamente potente
in vitro
actividad para un solo agente ISC-4 que hemos observado frente a líneas celulares de linfoma. La actividad de p53-independiente de ISC-4 y la conservación de la sinergia con cetuximab en la enfermedad 5-FU-refractaria un buen augurio para la utilidad clínica de ISC-4. Varios quimioterapias, incluyendo 5-FU, tienen efectos citotóxicos dependiente de p53 en las células tumorales, y, por lo tanto, la enfermedad resistente a la quimioterapia comúnmente surge durante la progresión de la enfermedad debido a la inactivación frecuente del gen supresor tumoral p53 [13].
Además de la estasis tumoral inducida por ISC-4 y cetuximab terapia de combinación en los tumores de 5-FU-resistentes, hay que señalar que el régimen de dosificación terapéutica fue muy bien tolerado. Este es un buen augurio para su uso en pacientes con enfermedad avanzada, muchos de los cuales son incapaces de tolerar los tratamientos agresivos. La actividad terapéutica en el cáncer de colon avanzado 5-FU-resistente es prometedor y puede beneficiarse de la adición de otras terapias utilizadas comúnmente en el contexto de la gestión del cáncer de colon, tales como oxaliplatino. Cetuximab se ha demostrado que restaurar la sensibilidad oxaliplatino en células de cáncer de colon refractarios y puede representar una oportunidad terapéutica prometedora [14]. Los datos clínicos apoyan también la combinación de cetuximab con irinotecán en la enfermedad refractaria a irinotecán [15].
Dada la eficacia demostrada y seguridad de esta combinación, la investigación clínica de ISC-4 en combinación con cetuximab se justifica en pacientes con de tipo salvaje
KRAS
genes, como se requiere para el tratamiento con cetuximab estándar [11]. La evidencia reciente sugiere que una biopsia debe tomarse inmediatamente antes de la iniciación del tratamiento para asegurar KRAS es de tipo salvaje como los pacientes con cáncer de colon pueden evolucionar mutaciones KRAS durante el tratamiento con cetuximab que causa la resistencia [16]. Además la aplicación de fosfo-Akt como un biomarcador de la respuesta puede ser útil en el ensayo futuro a través de biopsias o análisis de las células tumorales circulantes [17], [18] tumorales. Este estudio preclínico sostiene que la combinación puede ofrecer un beneficio terapéutico seguro frente a la resistencia a 5-FU para los pacientes con cáncer de colon que necesitan más opciones de tratamiento.
Apoyo a la Información
Figura S1.
ISC-4 y la terapia de combinación de cetuximab no disminuye Ki-67 expresión o inducir la autofagia. (A) La microscopía de contraste de fases de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 g /ml) solos o en combinación durante 12 horas. (B) (B) La citometría de flujo y (C) Análisis de Western bot de Ki-67 expresión en células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación según se determina mediante. (D) Análisis de transferencia Western de células RKO tratadas con ISC-4 (2 M) y cetuximab (1 mg /mL) solo o en combinación durante 24 horas. La cloroquina (C; 10 M) se incluye como un control positivo para la autofagia. beta actina se muestra como control de carga
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s001 gratis (TIF)
figura S2.
ISC-4 y la combinación de cetuximab terapia es segura y ejerce una actividad antitumoral cooperativa. (A) La cuantificación de la tinción de TUNEL en xenoinjertos de tumores se describe en la Figura 6B (n = 10). (B) Cambio en el peso corporal de los ratones que recibieron ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), o la combinación (N≥5) dos veces a la semana durante 2 semanas. cambios de peso corporal se expresan en relación con el peso corporal de cada ratón individual antes del tratamiento en el día 0 (n≥3). (C) H & amp; E tinción de tejido del hígado recogidas de ratones a las 24 horas después del tratamiento con ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), o la combinación. (D) el volumen del tumor terminal y el peso del tumor de xenoinjerto HT-29 se describe en la figura 6C. cohortes de tratamiento incluyen ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), la combinación, o cetuximab y 5-FU (25 mg /kg, iv) una vez por semana (n≥8) . peso corporal (E) del ratón en el punto final, que era de tres días después de la última dosis (n≥8). Las barras de error indican SEM de repeticiones
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
Las dosis seleccionadas para agentes antitumorales aprobados en combinación con ISC-4. CE
12.5, CE
25, y EC
50 valores se estimó a partir de la literatura y las dosis fueron empleados en los experimentos descritos en la Fig. 2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0059380.s003 gratis (XLSX) sobre Table S2.
Resumen de los efectos combinatorios de TIC10 con agentes antitumorales aprobados. la actividad combinatoria se compararon con las actividades monoagent mediante ensayos de viabilidad celular y se determinó que no cooperativo (-) (?), cooperativas (+), sinérgico (*), o ambigua. Las combinaciones mostraron actividad cooperativa en por lo menos una línea celular están resaltados en amarillo mientras que la selección verde indica sinergia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s004 gratis (XLSX) sobre Table S3.
índices de combinación para el cetuximab ISC-4 y en KRAS no mutado líneas celulares de cáncer de colon humano. la actividad combinatoria en RKO y HT-29 líneas celulares cuantificado en la figura 3A se evaluó por el método de Chou-Talalay
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s005 gratis (XLSX) sobre Table S4.
perfiles químicos de suero de los ratones que recibieron la terapia de ISC-4 y la combinación de cetuximab. Atímicos, ratones hembra nude 8 semanas de edad recibió ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), o la combinación (N≥5) dos veces a la semana durante 2 semanas. Se recogió el suero 2 días después de la última dosis
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s006 gratis (XLSX)
Reconocimientos
W.S. El-Deiry es Profesor de Investigación Sociedad Americana del Cáncer.