Extracto
Antecedentes
MUC1 es una glicoproteína transmembrana de tipo I aberrantemente sobreexpresado en varias células cancerosas, incluyendo el cáncer de páncreas. El extremo citosólica de MUC1 (MUC1-c) es ampliamente implicado en una serie de vías de señalización. MUC1-c se informa para inhibir la apoptosis en una serie de células cancerosas, pero el mecanismo de inhibición no está claro.
Método
La expresión de MUC1-c se estudió en la línea celular de cáncer pancreático MIAPaCa -2 a nivel de ARN mediante el uso de QRTPCR y a nivel de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western. la expresión de MUC1-c se inhibió cualquiera de siRNA o por un péptido inhibidor específico, GO-201. Se estudió Efecto de la inhibición MUC1-c en la viabilidad y la proliferación y lisosomal permeabilización. Asociación de MUC1-c con HSP70 se detectó mediante co-inmunoprecipitación de MUC1-c y HSP70. La localización de MUC1-c en los orgánulos celulares se controló mediante inmunofluorescencia y con inmunotransferencia por el anticuerpo MUC1-c después del fraccionamiento subcelular.
Resultados
La inhibición de la MUC1-c por un inhibidor (GO 201) o siRNA resultó en la viabilidad reducida y reducida proliferación de células de cáncer pancreático. Además, IR-201, el inhibidor de péptido de MUC1-c, fue eficaz en la reducción de la carga tumoral en el modelo de ratón de cáncer de páncreas. MUC1-c también se encuentra asociado con HSP70 en el citosol, aunque una cantidad significativa de MUC1 también se observó que estar presente en los lisosomas. La inhibición de la expresión o actividad MUC1 mostró una actividad de la catepsina B mejorada en el citosol, lo que indica permeabilización lisosomal. Por tanto, este estudio indica que MUC1-c interactuó con HSP70 en el citosol de células de cáncer pancreático y localiza en los lisosomas en estas células. Además, nuestros resultados mostraron que MUC1-c protege a las células de cáncer de páncreas de la muerte celular mediante la estabilización de los lisosomas y la prevención de la liberación de la catepsina B en el citosol
Visto:. Banerjee S, Mujumdar N, Dudeja V, Mackenzie T, Krosch los conocimientos tradicionales, Sangwan V, et al. (2012) MUC1c media la supervivencia celular en el cáncer de páncreas mediante la prevención de permeabilización lisosomal. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10.1371 /journal.pone.0043020
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de abril de 2012; Aceptado: July 16, 2012; Publicado: 13 Agosto 2012
Copyright: © Banerjee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue financiado por los Institutos nacionales de Salud R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 y Catherine y Robert Goodale fundación para AKS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos. La mayoría de los cánceres de páncreas son adenocarcinoma ductal. La tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con enfermedad localizada después de la resección quirúrgica es del 20% y para aquellos con enfermedad metastásica, la tasa de supervivencia es extremadamente bajo. A pesar de importantes recursos se han comprometido a mejorar la supervivencia de pacientes con cáncer de páncreas en las últimas décadas, no ha habido una mejora significativa en estos números [1]. La tasa de supervivencia pobre se atribuye a la detección tardía de cáncer de páncreas y la resistencia extrema de las células tumorales a las estrategias quimioterapéuticos. Por esta razón, la elucidación del mecanismo de la resistencia de las células de cáncer de páncreas es un foco de investigación de primera, ya que puede conducir al desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas.
Las mucinas son glicoproteínas transmembrana, presente en la superficie de diversos epitelial de la mucosa y las células hematopoyéticas, y se reportan que se sobreexpresa en varios adenocarcinomas [2]. MUC1 es una de las mucinas que se asocia con un mal pronóstico, la transformación maligna de las células tumorales, y resistencia a los agentes anti-cáncer genotóxicos [3], [4]. MUC1 también está asociada con la invasión [5] - [7], [8], que controlan varias vías de señalización celular [9] y la progresión del tumor [10]. La falta de MUC1 se ha correlacionado con la disminución de la proliferación, invasión, y las tasas mitóticas tanto
in vivo
y
in vitro Hoteles en cáncer de páncreas [11].
MUC1 se sintetiza como un único péptido que se somete a escisión en dos subunidades, posteriormente formar un heterodímero no covalente estable que consiste en un dominio extracelular y una cola citoplasmática [12], [13]. El dominio extracelular de MUC1 se compone de repeticiones en tándem de número variable (VNTR) modificados por extensos O-glicanos, y actúa como una barrera física contra el medio extracelular. La cola citoplasmática de MUC1 (MUC1-c) consiste en un dominio extracelular ácido 58 amino, un dominio transmembrana de 28 aminoácidos y un dominio citoplasmático 72 amino ácido. Este dominio citoplásmico, (designado MUC1-c) interactúa con β-catenina, el principal efector de la vía de señalización Wnt canónica [14], [15], y induce el crecimiento independiente de anclaje y la tumorigenicidad [16], [17]. Interacción con β-catenina promueve localización de MUC1 al núcleo, donde MUC1-c interactúa con diversos factores de transcripción y activa un número de crecimiento y supervivencia vías [18] - [24], reprimiendo de ese modo varias vías de la muerte celular [25] - [ ,,,0],29].
La sobreexpresión de MUC1, tal como se encuentra en los tumores humanos, se asocia con la localización de MUC1-c de la mitocondria [3]. La importancia funcional de mitocondrial localización MUC1-c está soportado por la demostración de que MUC1 atenúa ADN liberación daño inducido de factores apoptogénicos mitocondriales y la respuesta apoptótica [3]. Desde MUC1 no tiene la firma de localización mitocondrial clásico, la orientación mitocondrial de MUC1-C está mediada por su interacción con chaperones citosólicos tales como HSP70 y HSP90 [30]. A medida que la nueva síntesis y -cleaved MUC1-c se encuentra en el citosol con un dominio de transmembrana hidrofóbica expuesta [31], [30], estas chaperonas son capaces de unirse a ella y entregarlo a la mitocondria [32]. Asociación de MUC1-c con proteínas de choque térmico después de la activación con heregulina y su posterior orientación a la membrana externa mitocondrial ha informado [33]. Como un componente de la membrana externa mitocondrial, MUC1-c atenúa la pérdida del potencial transmembrana en respuesta a estrés genotóxico [34], [3], y confiere resistencia a la muerte en la respuesta celular al daño del ADN, las especies reactivas de oxígeno, hipoxia, o activación del receptor de muerte superfamilia [34].
Aunque las vías aguas abajo de la muerte celular como consecuencia de la inhibición de MUC1 se han estudiado en un número de cánceres, el mecanismo de inicio de la despolarización mitocondrial (después de la inhibición MUC1 ) que conduce a la activación de las vías de apoptosis no está claro en el cáncer de páncreas. despolarización de la membrana mitocondrial puede ser el resultado de un número de eventos. El daño del ADN nuclear o retículo endoplásmico tanto inducir la muerte celular apoptótica que depende de la despolarización mitocondrial y la activación de caspasa [35]. la despolarización y la iniciación de las vías de muerte celular similar también se pueden activar desde los lisosomas. daño lisosomal en respuesta a agentes genotóxicos se informa de iniciar la muerte celular mediante la liberación de las enzimas hidrolíticas de este orgánulo en el citoplasma [36], [37]. Los lisosomas contienen muchos tipos diferentes de enzimas hidrolíticas que incluyen proteasas, lipasas, nucleasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas que normalmente ejercen su actividad enzimática máxima a pH bajo. proteasas lisosomales que han sido implicados en la muerte celular son las catepsinas que permanecen activas a un pH neutro, tales como la catepsina B, catepsina D y catepsina L. Estas proteasas activan efectores apoptóticos tales como las mitocondrias y /o caspasas, iniciando así la apoptosis [38] ., [39]
Uno de los tipos de proteínas que promueven la supervivencia de las células del páncreas es la familia de proteínas de choque térmico, en particular HSP70 [37], [40] - [42]. Se ha informado de que la regulación a la baja de los resultados de HSP70 en la muerte de células de cáncer de páncreas mediante la inducción de permeabilización lisosomal, [37] pero el mecanismo exacto de protección no se ha estudiado.
En el presente estudio, mostramos que los asociados con HSP70 el extremo C-terminal de la proteína MUC1 (MUC1-c) y lo transporta a los lisosomas, evitando de este modo la permeabilización lisosomal y la promoción de la supervivencia celular en estas células tumorales. Además, muestran que el péptido inhibidor de la MUC1 (GO-201) inhibe la actividad de MUC1-c y los resultados en la proliferación celular y la viabilidad reducida de las células tumorales tanto
in vivo
y
in vitro.
Resultados
cáncer de páncreas células muestran un aumento de la expresión de MUC1 en comparación con el normal de páncreas
la expresión de MUC1 se estudió en varias líneas celulares de cáncer de páncreas, tanto a nivel de ARN y proteínas . Se encontró que la expresión de MUC1 mRNA a ser significativamente mayor en todas las líneas celulares de cáncer pancreático que en las células ductales pancreáticas humanas no tumorigénicas (HPDEC) (Fig. 1A). elevada expresión similares de proteína MUC1-c se observó en todas las líneas celulares tumorales en comparación con los HPDECs no tumorigénicas. Se encontró una correlación existe entre la agresividad de la línea celular y la expresión de MUC1 en el cáncer de páncreas (fig. 1B). De la expresión de MUC1 se observó en las líneas celulares más invasivos y metastásicos S2-013 y S2-VP10 o AsPC1 (derivado de ascitis) que en líneas celulares obtenidas de tumores primarios (MiaPaCa-2, BxPC3 y Hs776T).
los niveles de expresión de ARNm de MUC1 en varias líneas celulares de cáncer pancreático en relación con HPDEC no tumorigénicos (a). Los datos se expresan como la media +/- SEM de 3 experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05 (
t
prueba) en comparación con los controles. los niveles de expresión de proteínas de MUC1-c en diferentes línea celular de cáncer de páncreas y no tumorigénicos HPDEC (B).
La inhibición de la MUC1 conduce a reducir la proliferación y la muerte celular
Para estudiar si MUC1 era una proteína esencial el control de la supervivencia celular en el cáncer de páncreas, su expresión se inhibe usando siRNA contra MUC1 en MIAPaCa-2 (Fig. 2A-C) y AsPC1 células (Fig. 2G-I). En paralelo que también se utiliza GO-201, un fragmento de péptido que inhibe la actividad de MUC1-c, lo que conduce a la desregulación de la actividad de señalización corriente abajo y desencadenar la muerte celular en líneas celulares de cáncer pancreático MIAPaCa-2 (Fig. 2D-F) y AsPC1 ( Fig. 2J-L). Tanto la inhibición de la expresión de MUC1 por siRNA (Fig. 2 A, G), así como la inhibición de la actividad de MUC1-c por GO-201 llevado a la proliferación reducida y aumento de la muerte celular en las células de cáncer de páncreas. Se observaron MIAPaCa-2 células para responder más a la inhibición de MUC1 ya sea de siRNA o por IR-201 (Fig. 2A-F) en comparación con las células AsPC1 (Fig. 2G-L). Como era de esperar, GO-201, el péptido inhibidor de MUC1-C, no alteró el nivel de expresión de la proteína (Fig. 2D, J). La muerte celular se ve que es mediada por caspasa (Figura S1).
MUC1 expresión fue inhibido por siRNA en MIAPaCa-2 (A) carriles de control 1-3 muestran MIAPaCa-2, MIAPaCa-2 no transfectadas con siRNA específico y MUC1 siRNA, respectivamente. Tanto la proliferación (B) y la viabilidad (C) se redujeron con disminución de la expresión de MUC1 en MIAPaCa-2 células. En el tratamiento con inhibidor de la actividad de MUC1-C GO-201, que inhibe la actividad de señalización de esta proteína, no se observaron cambios en los niveles de expresión de MUC1 en MIAPaCa-2 células (D). El carril 1 era no tratados células MIAPaCa-2 y el carril 2 era MIAPaCa-2 tratado con GO-201. Proliferación (E) y la viabilidad (F) se observaron a ser disminuido. Del mismo modo, en otra línea celular, AsPC-1, la transfección con siRNA mostraron disminución de los niveles de proteína (G) donde carril 1 es el control AsPC-1, Lane 2: siRNA no específica transfectadas AsPC-1 y Lane 3 se transfecta-siRNA MUC1 AsPC1 . Tanto la proliferación (H) y la viabilidad (I) se redujeron. En el tratamiento con el inhibidor de la GO-201, no hubo cambios en los niveles de proteína (J): Carril 1 fue células AsPC-1 no tratados y el carril 2 era AsPC-1 tratado con GO-201. Proliferación (K) y la viabilidad (L) se observaron a reducirse. Los datos se expresan como la media +/- SEM de 3 experimentos independientes. *
P
. & Lt; 0,05 (
t
prueba) en comparación con los controles
MUC1 Asociados con HSP70 en el citosol y se localiza en los lisosomas
proteína de choque térmico 70 (HSP70) es altamente sobreexpresado en el cáncer de páncreas y su regulación a la baja por los inhibidores y siRNA se ha visto para inducir la muerte de células de cáncer de páncreas [37]. Sin embargo, el papel exacto que desempeña HSP70 en la supervivencia de células de cáncer pancreático es desconocida. Al mismo tiempo, MUC1 se sabe que se sobreexpresa en el cáncer de páncreas y desempeñar un papel en la supervivencia celular en una serie de líneas celulares de cáncer, pero el mecanismo exacto ha sido difícil de alcanzar [11], [43], [44]. Desde HSP70 es una chaperona, que tiene la capacidad de unirse a y secuestrar el citosólica MUC1-c de ese modo la orientación a diferentes orgánulos celulares, donde MUC1-c podría regular las diversas vías anti-apoptóticos para proteger las células de cáncer de páncreas de la muerte celular apoptótica. Se ha demostrado previamente que se une a MUC1 HSP70 y HSP90 y se dirige a la membrana externa mitocondrial [33]. Para ver si MUC1-c está asociado con HSP70 en células de cáncer pancreático, la prueba de co-precipitación de MUC1 y HSP70 en células de cáncer pancreático. MUC1-c y HSP70 se encontraron a co-inmunoprecipitación, onfirming que HSP70 y MUC1 de hecho interactúan en las células de cáncer de páncreas (Fig. 3A).
La inmunoprecipitación con MUC1 y HSP70 mostró las dos proteínas que se asocian (A) . Los carriles 1, 2 y 3 muestran el total de los niveles de proteína, HSP70 y MUC1 en el flujo a través y las dos proteínas inmunoprecipitadas por el anticuerpo HSP70 respectivamente. Las calles 4 y 5 muestran caudal contínuo y inmunoprecipitados de anticuerpo MUC1. MUC1-c se encontró que estaba localizado a los lisosomas en MIAPaCa-2 células, aunque cantidades casi iguales de MUC1-c fueron también citosólica (B). Lamp2, una proteína lisosómica residente, y la actina, una proteína citosólica predominantemente, se utilizaron como marcadores de fraccionamiento. El carril 1 es la fracción citosólica. Carril 2 es una fracción lisosomal crudo, que se enriquece aún más en el carril 3. HSP70, aunque asociado con MUC1, fue visto que estar presente predominantemente en el citosol. Inmunofluorescencia confirmado co-localización de MUC1-c y Lamp2 en los lisosomas (C).
MUC1 es ampliamente presente en la superficie celular de las células pancreáticas. Sin embargo, el ácido final 72 amino C-terminal de la proteína se somete a auto-escisión y se localiza en diferentes orgánulos celulares en respuesta a un mecanismo de señalización diferencial. Para ver si MUC1-c fue de hecho transportado por HSP70 a diversos compartimentos celulares, se realizó inmunofluorescencia con marcadores específicos de orgánulos junto con fraccionamiento subcelular seguido de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-MUC1 para buscar su localización. La integridad de las diferentes fracciones y la pureza de las preparaciones organellar fueron confirmados mediante el uso de diferentes marcadores (Lamp2 para lisosomas y actina para citosol). Aunque HSP70 se observó a co-precipitar con MUC1-c (Fig. 3A), se observó a ser localizado en el citosol y no en los lisosomas, mientras que se encontró MUC1-c a ser localizados tanto en citosol y lisosomas (Fig. 3B). La localización de MUC1 en los lisosomas se confirmó además por los co-tinción de las células de cáncer de páncreas con el Lámpara2 marcador lisosomal (Fig. 3C). La inmunofluorescencia mostró que MUC1 y Lámpara2 co-localizar con la correlación de Pearson de 0,75 (Fig. 3C). Esto indicó que MUC1-c asociado con HSP70 en el citosol y localizada en los lisosomas. Algunos MUC1-c también se observó para localizar en la mitocondria, lo que confirma el estudio anterior por Ren et al que MUC1-c se dirige a las mitocondrias por HSP70 [3] (Figura S2).
Inhibición de MUC1- c o HSP70 resultados en lisosomal permeabilización muerte celular
lisosomal permeabilización a menudo se piensa que preceder a la muerte celular en respuesta a un estímulo mediante la liberación de una serie de enzimas hidrolíticas en el citosol, lo que reduce el pH de la citosol y causando acidosis [45]. La liberación de enzimas lisosomales tales como catepsina B y catepsina D, a su vez induce la despolarización mitocondrial que resulta en la liberación de citocromo C y la activación de las vías de apoptosis [45]. Dado que una fracción significativa de MUC1 se localiza en los lisosomas, buscamos un efecto en la permeabilización lisosomal mediante la medición de la pérdida de la catepsina B-Lamp2 co-localización en los lisosomas siguiente inhibición de la MUC1. Además, confirmó este fenómeno mediante la medición de la actividad citosólica de la catepsina B en las células después de la inhibición de MUC1 por siRNA. Nuestros estudios de inmunofluorescencia mostraron una pérdida distinta en co-localización de CathepsinB y Lamp2 co-tinción en las células silenciadas-MUC1 (Fig. 4A). Nuestros estudios bioquímicos mostraron que la inhibición de la expresión de MUC1 mostró un aumento en la actividad de la catepsina B citosólico que indica que la integridad de la membrana lisosomal se vio comprometida (Fig. 4B). Se observó una magnitud casi igual de la actividad de la catepsina B citosólicas HSP70 cuando se inhibió mediante siRNA (Figura S3). Esto era similar a un estudio anterior [37] en nuestro laboratorio de informes que downregulation de HSP70 en el cáncer de páncreas resultó en la muerte celular por permeabilización lisosomal. Esto indica que la inhibición de HSP70, ya sea o MUC1 resultó en la permeabilización lisosomal. Para determinar si este permeabilización estaba directamente relacionado con la muerte celular, se utilizó un inhibidor de células permeable catepsina B (CA-074-Me) y midió la viabilidad de las células en presencia de un inhibidor de MUC1 (Fig. 5C). Mientras que la viabilidad de las células se redujo a casi 40% de las células no tratadas en presencia de GO-201, las células tratadas con CA-074Me junto con GO-201 se observaron para recuperar y mostraron una viabilidad de casi el 98% de las células no tratadas ( Fig. 4C). Se observó que las células tratadas con únicamente GO-201 demostraron una reducción de crecimiento y la proliferación después de 3 días de tratamiento, mientras que los que fueron tratados con el inhibidor de la catepsina B mostró una proliferación y el crecimiento similares a las de los controles. restauración similares de viabilidad de MIAPaCa-2 células también se observó cuando la expresión de MUC1 fue inhibida por siRNA (Figura S4). Esto demostró que el efecto de GO-201 sobre la liberación de la catepsina B se podría revertir por el uso de un inhibidor de la catepsina B (Fig. 4D). Esto también fue confirmado bioquímicamente, en el que MUC1 siRNA y GO201 ambos mostraron una mayor actividad de la catepsina B citosólica pero el tratamiento con CA-074Me mostraron una reversión de esta actividad. Esto indica que la inhibición de MUC1 de hecho condujo a lisosomales permeabilización, que a su vez desencadena la aparición de vías de muerte celular en estas células.
La inhibición de la MUC1 de siRNA resultó en la permeabilización lisosomal como se manifiesta por la liberación de la catepsina B en el citosol ( UN). No se observó pérdida de la colocalización de la catepsina B y Lámpara2 en las células MUC1-silenciada en comparación con el control no silenciar. ensayo bioquímico para la actividad de la catepsina B en el citosol mostró una mayor actividad tanto en las células y las células silenciadas tratados con IR-201 (B) MUC1. El proceso de la muerte celular inducida por GO-201 fue detenido el uso de un inhibidor de la catepsina B CA-O74Me (C). Los datos se expresan como la media +/- SEM de 3 experimentos independientes. *
P
. & Lt; 0,05 (
t
prueba) en comparación con los controles
modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas con células AsPC-1 mostró enorme de páncreas tumor en los ratones no tratados (a), mientras que GO-201 tenía muy poco no hay tumor en su páncreas. se observó una reducción de peso del tumor (C) y el volumen (D) después del tratamiento con GO-201. * Representa p & lt; 0,05 en comparación con los controles. secciones de tejido representativas de los ratones con tumor de páncreas (modelo ortotópico con células AsPC1) en el grupo de control se tiñeron con Ki-67 mostraron extensa tinción indica células que proliferan activamente tumorales (E), en comparación con menos tinción en GO-201 diapositivas que muestra la pérdida en la proliferación (F). El número total de células teñidas con Ki-67 se contó en al menos 10 campos en ambas muestras y el número medio de células en proliferación en ambos conjuntos se representaron gráficamente (G) *
P
& lt; 0,05 (
t
prueba) en comparación con los controles.
la inhibición de la expresión de MUC1 en un
in vivo
modelo de ratón de cáncer de páncreas reduce la progresión tumoral
GO -201, un inhibidor de péptido informado de inhibir la actividad de MUC1-c, se ha probado para la regresión del tumor en una serie de modelos de cáncer como el cáncer de próstata, cáncer de mama y CML [46] - [48]. Sin embargo, su eficacia no ha sido probado en modelos de cáncer de páncreas. Se utilizó un modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas con la línea celular agresiva AsPC1 para probar la eficacia de GO-201. Veinte ratones nu /nu atímicos recibieron inyecciones intra-pancreáticas de 2 × 10
5 células. El tratamiento con intraperitoneal GO-201 (30 mg /kg de peso corporal) se inició en 10 ratones aleatorios, a partir del día 4 después de la inyección de células tumorales. Los 10 ratones restantes fueron inyectados con solución salina. El experimento se terminó el día 30 después de la inyección de las células. Los ratones fueron sacrificados y se evaluó la carga del tumor en ambos grupos. En el día 30, todos los animales tenían tumores de solución salina (n = 10) (Fig. 5A), mientras que en el grupo tratado de n = 10 ratones, sólo 3 de 10 tenían tumores (Fig. 5B). El peso del tumor en el grupo no tratado osciló desde 0,6 hasta 1,6 g, mientras que los grupos tratados tenían tumores que pesan 0,1 g-0,3 g (Fig. 5C). El volumen medio de los tumores de los ratones en el grupo de solución salina fue de 0,9 cm
3 mientras que los tratados con IR-201 tenían un volumen tumoral medio de 0,1 cm
3 (Fig. 5D). El grupo de solución salina también mostró extensa diseminación metastásica de los tumores a un número de órganos (Tabla 1). Los tejidos de los tumores se tiñeron con Ki-67 para comparar las tasas de proliferación en los dos grupos. El grupo no tratado tiñe intensamente con Ki-67, que muestra las células en proliferación activa (Fig. 5E). En comparación, las células tratadas GO-201 tiñeron muy débilmente con Ki-67 (Fig. 5F). Esto sugirió que la inhibición funcional de MUC1-c por GO-201 resultó en una reducción significativa de la carga tumoral en ratones.
Discusión
Heat-shock (HSP) 70 proteínas funcionan como ATP chaperonas dependientes que regulan el plegamiento de las proteínas sintetizadas nueva emisión, el montaje de varios complejos de proteínas y el transporte de proteínas a través de las membranas celulares [49]. HSP70 se sobreexpresa frecuentemente en tumores malignos, y esta sobreexpresión se asocia con un resultado terapéutico pobre en un número de cánceres humanos, incluyendo cáncer de mama y cáncer de páncreas [50], [37], [40], [41]. HSP70 tiene un efecto citoprotector y marcado inhibe la señalización de apoptosis mediante la inhibición de permeabilización mitocondrial, mediante la reducción de la activación de caspasa o mediante la neutralización de la apoptosis induciendo factores [51]. HSP70 también se localiza en las membranas lisosomales [52], [53] y puede proteger las membranas lisosomales contra LMP inducidas por diferentes estímulos tales como etopósido, TNF-α y el estrés oxidativo [54]. Hemos demostrado anteriormente que HSP70 se sobreexpresa en células de cáncer pancreático y que su regulación a la baja por cualquiera de siRNA
in vitro
o mediante el uso de un inhibidor de
in vivo
induce la activación de caspasas y la muerte celular por apoptosis [ ,,,0],37], [42], [55]. Esto sugiere que HSP70 es importante para la supervivencia de células de cáncer pancreático. Se han propuesto muchos mecanismos probables para la función de pro-supervivencia de HSP70.
In vitro
estudios han sugerido que HSP70 puede interferir directamente con la maquinaria de apoptosis de señalización corriente abajo de las mitocondrias mediante la prevención de la formación y la caspasa apoptosome activación [56]. Estudios recientes utilizando modelos de muerte celular han señalado que la inhibición mediada por HSP70 de la apoptosis dependiente de caspasa se produce aguas arriba de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP) y la liberación del citocromo c [57], [58]. Los estudios previos de nuestro grupo también sugieren que la inhibición de la expresión de HSP70 por diferentes inhibidores o HSP70 siRNA conduce a la activación de caspasas y apoptosis, lo que sugiere que HSP70 inhibe la apoptosis dependiente de caspasa en células de cáncer pancreático, influyendo en las reservas de calcio citosólicas y causando la permeabilización lisosomal. Sin embargo, el mecanismo molecular de este fenómeno ha sido difícil de alcanzar [37].
MUC1-c ha demostrado ser una oncoproteína responsable de la transformación y la tumorigenicidad en un número de células cancerosas. MUC1-c también juega un papel en la señalización celular intensiva tras una serie de eventos de fosforilación. Varios informes también muestran una acumulación de MUC1-c en el citosol de las células cancerosas. Se ha demostrado previamente que los asociados MUC1-C con proteínas de choque térmico y se dirige a la membrana mitocondrial externa [33], [59]. Por lo tanto existe una estrecha asociación de HSP70 y MUC1 en células tumorales.
En un intento de comprender el mecanismo molecular de la supervivencia celular y la función de HSP70 y MUC1 en células de cáncer de páncreas, nos fijamos en la asociación de HSP70 y MUC1. Dado que la función predominante de HSP70 en cualquier celda es su actividad chaperona, la hipótesis de que HSP70 actúa como un portador de MUC1-c a diferentes compartimientos celulares, tales como los lisosomas y mitocondrias, lo que resulta en la protección de estos compartimentos y la prevención de la muerte celular. Nuestro estudio demostró que HSP70 se asocia con MUC1 y que co-precipita con MUC1-c (Fig. 3A). También mostró que aunque MUC1-C se localizó predominantemente en el citoplasma, una cantidad significativa también estaba presente en los lisosomas y mitocondrias (Fig 3 B, C;. Figura S2). La inhibición de la expresión de MUC1-c de siRNA o una inhibición de la actividad mediante el péptido inhibidor GO-201 dio como resultado la proliferación y viabilidad de las células de cáncer de páncreas disminución (Fig. 2) y la actividad de la caspasa inducida en estas células, lo que indica una activación de las vías de apoptosis (Figura S1). Esta inhibición también causó permeabilización lisosomal de células de cáncer pancreático que conducen a la liberación de la catepsina B y una alta actividad de la catepsina B citosólico (Fig. 4B, C). expresión de catepsina B en células transfectadas con siRNA no específica muestran distinta tinción en compartimentos lisosomales (Figura 4 A). Este patrón de tinción distintivo se ve que es difusa vez que las células se transfectan con Muc1 siRNA. Esto se debe a la liberación de la proteína catepsina B en el compartimiento citosólico como se ensayó bioquímicamente (Figura 4B). permeabilización lisosomal similar se observó también cuando la expresión HSP70 fue inhibida por siRNA (Figura S3). El efecto de la inhibición de la expresión o actividad MUC1 fue visto a revertirse cuando las células fueron incubadas-CO con la catepsina B inhibidor CA-074Me. Esto indicó que la liberación de la catepsina B de los lisosomas de las células del cáncer pancreático dado lugar a la activación de las vías de la muerte celular. Los informes previos de nuestro grupo muestran que la inhibición de HSP70 por un inhibidor, ya sea triptólido o quercetina, también dio lugar a la permeabilización lisosomal similar y la muerte celular por apoptosis [37]. En el mismo estudio también se observó que un inhibidor de catepsina B era capaz de revertir los efectos de la inhibición de HSP70 en las células de cáncer pancreático, lo que indica que la permeabilización lisosomal es uno de los pasos anteriores de la muerte apoptótica en estas células.
Clásicamente, la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) ha sido cree que participan en mecanismos de muerte celular, a pesar de los eventos secuenciales exactas de LMP a la muerte celular no se han trazado. Dependiendo del estímulo letal, la extensión de LMP, la cantidad y el tipo de catepsinas se libera en el citoplasma, así como la abundancia de los inhibidores de catepsina, LMP puede accionar una variedad de morfologías de muerte asociada a apoptosis que van desde clásica a necrosis. Por lo tanto, LMP asociado con catepsina translocación pueden activar directamente las calpaínas y caspasas, pero LMP también puede desencadenar la vía clásica MOMP-caspasa, así como MOMP- y la apoptosis independiente de caspasas. ¿Qué vías letales son estimulados por LMP depende del tipo de célula, el estado de inmortalización y el fondo genético de las células.
En el estudio actual, se propone un modelo de supervivencia de las células en las que la HSP70 actúa como portador de MUC1-c mediante la asociación con él físicamente y su transporte a los lisosomas (y mitocondrias) en células de cáncer pancreático. La presencia de MUC1-c en los lisosomas impide LMP y mantiene los lisosomas intacto. Sin embargo, cuando HSP70 o MUC1 se inhibe ya sea por siRNA o por un inhibidor de péptido de MUC1 (que impide la actividad de MUC1 y por lo tanto su asociación con cualquier otra molécula), se pierde la protección de los lisosomas, y hay una extensa LMP, que conduce a una liberación de la catepsina B y la activación de la muerte celular. Si la inducción de la LMP y la liberación de la catepsina B activa las vías de apoptosis adicionales que implican la mitocondria tiene que investigarse más a fondo.
Desde una perspectiva clínica, un enfoque más específico en la explotación de la supervivencia celular mediada por MUC1-c es el desarrollo terapéutico agentes que interactúan directamente con MUC1-c y bloquean su función. MUC1-C forman oligómeros a través del motivo de aminoácidos CQC en su dominio citoplásmico, y la actividad es necesaria para MUC1-C transporte nuclear [60], [61]. El inhibidor de péptido GO-201, que contiene el motivo CQC, se ha diseñado y probado en un número de células cancerosas para bloquear oligomerización de MUC1 y así inhibir su actividad de señalización y la función [18], [46] - [48]. En el presente estudio, hemos utilizado GO-201 en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas para probar su eficacia en el tumor de páncreas. La línea celular de cáncer de páncreas agresiva AsPC1 se utilizó para generar los tumores de páncreas ortotópico. GO-201 (30 mg /kg) se inyectó por vía intraperitoneal cada día durante 26 días y el experimentado fue terminado en día 30. La inhibición de la función MUC1 por GO-201 fue visto para prevenir el crecimiento tumoral y la progresión en el grupo de tratamiento de manera significativa en comparación con el grupo no tratado. En estudios previos GO-201 ha demostrado ser un inhibidor específico MUC1 que no tiene ningún efecto sobre cualquier proteína distinta de MUC1 [47]. Nuestros estudios anteriores habían demostrado que mediante el uso de inhibidores de HSP70, tumores pancreáticos podrían realizar una regresión de
in vivo
[60]. En la continuación de las investigaciones, este estudio también mostró que la inhibición de MUC1
in vivo
podría disminuir la carga tumoral en ratones, lo que confirma que la asociación MUC1-HSP70 es un factor esencial para la supervivencia de las células del cáncer pancreático. Además, la inhibición de esta asociación, ya sea mediante la inhibición de la expresión de HSP70 o actividad MUC1 podría ser de valor terapéutico significativo en el cáncer de páncreas.
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