Extracto
La familia Nedd4 de ubiquitina ligasas E3 incluye nueve miembros. Cada uno es una proteína modular, que contiene un dominio C2 N-terminal para la localización celular, de dos a cuatro dominios centrales WW para el reconocimiento del sustrato, y un dominio catalítico hect C-terminal, que es responsable de catalizar la reacción ubiquitylation. Los miembros de esta familia se sabe que afectan las vías centrales para la patogénesis del cáncer colorrectal, incluyendo el WNT, TGF, EGFR, y las vías de p53. Recientemente,
se informó Nedd4
ARNm que se sobreexpresa en el cáncer colorrectal, pero la etapa del tumor no fue considerado en el análisis. La expresión de los otros miembros de la familia no se ha estudiado en el cáncer colorrectal. En este documento, se determinaron los patrones de expresión de los nueve miembros de la familia Nedd4 en 256 pacientes que se presentaron con enfermedad premaligna que van desde adenoma a la etapa IV del cáncer colorrectal.
Nedd4
ARNm se incrementó significativamente en todas las etapas del cáncer colorrectal. Por el contrario,
NEDD4L
ARNm, el homólogo más cercano a
Nedd4
, fue el miembro de la familia más altamente regulados a la baja, y fue significativamente downregulated en todas las fases del tumor. También encontramos la proteína NEDD4L se redujo significativamente por el Western Blot en muestras de cáncer colorrectal en comparación con la mucosa normal adyacente. Además, NEDD4L, pero no NEDD4L catalíticamente inactivo, inhibió WNT canónica de señalización en o por debajo del nivel de β-catenina
in vitro
. Estos hallazgos sugieren que NEDD4L puede jugar un papel supresor tumoral en el cáncer colorrectal, posiblemente a través de la inhibición de la señalización de Wnt canónica
Visto:. Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L es downregulated en el cáncer colorrectal y desactivaciones canónica de señalización Wnt. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10.1371 /journal.pone.0081514
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2013; Aceptado: 23 de octubre de 2013; Publicado: 28 Noviembre 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Jarred Tanksley fue apoyada por NCIP5095103, RO1CA46413, y GM007347. Chen Xi fue apoyada por RO1CA158472. Robert J. Coffey fue apoyada por NCIP5095103 y RO1CA46413. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en los Estados Unidos por la incidencia, y en segundo lugar solamente al cáncer de pulmón en la mortalidad, causando aproximadamente 50.000 muertes cada año [1]. El proceso de la tumorigénesis en esporádicos CRC típicamente comienza con una mutación inactivante en el
poliposis adenomatosa coli (APC)
gen que da lugar a la activación aberrante de la vía de señalización Wnt canónica [2]. En los casos restantes, a menudo existe una mutación en
CTNNB1
, que codifica β-catenina [3]. El resultado de cada una de estas mutaciones es la disminución o pérdida de la capacidad de una célula para apuntar correctamente citoplásmica β-catenina a la multi-proteína E3 ligasa de ubiquitina, proteína de repetir que contienen beta-transducina (β-TRCP), que poli-ubiquitylates β -catenina, y apunta a la proteasoma para la degradación de [4]. En cambio, β-catenina se acumula en el núcleo, y se asocia con el factor /ABL transcripción TCF para conducir un programa transcripcional que finalmente resulta en la neoplasia. En este escenario, es la incapacidad de la célula para controlar los niveles de β-catenina a través de la degradación mediada por ubiqitin que promueve la tumorigénesis. Sin embargo, se cree que el proceso de ubiquitinación como un todo que se upregulated en el cáncer, lo que ha llevado al uso de inhibidores del proteasoma en el tratamiento de CRC [5].
Ubiquitylation es un proceso secuencial, en tres etapas que implica una E1, E2, E3 y ubiquitina ligasa que da como resultado la unión covalente de ubiquitina (s), una proteína de 76 aminoácidos, a un residuo de Lys (s) de una proteína sustrato o diana. Es fundamental para la homeostasis celular, principalmente por la orientación proteínas a la proteasoma o lisosoma para la degradación a través de la unión de cadenas de ubiquitina (poli-ubiquitylation). Sin embargo, ubiquitylation También se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el tráfico, la localización y actividad de las proteínas, especialmente cuando no es la adición de sólo una fracción ubiquityl, denominado mono-ubiquitylation [6]. especificidad objetivo es proporcionado principalmente por ligasas E3, que catalizan la última etapa de unión ubiquitina. En el genoma humano, hay más de 600 E3 ligasas, frente a aproximadamente 30 E2 y E1 dos. A E3 dado puede tener muchos objetivos, y puede activar o inhibir múltiples rutas de señalización celular [7]. Hay dos familias principales de E3s:. El nuevo gen (anillo) de la familia realmente interesante, que comprenden 95% de todos los E3s, y el homólogo a la familia E6-AP carboxilo (hect), que comprende el 5% restante [8]
La familia de Nedd4 de tipo hect E3 incluye nueve miembros [9]. Cada miembro es una proteína modular, con un dominio C2 N-terminal, de dos a cuatro dominios WW centrales, y a, dominio hect catalítico C-terminal. Los dominios WW son responsables de la selección de objetivos, e interactúan con un motivo de cuatro aminoácidos (PY motivo, PPxY) en la proteína diana, mientras que las ayudas de dominio C2 en la localización celular apropiada. El dominio hect es responsable del reclutamiento de E2, que sirve como un portador para la ubiquitina y directamente conjuga ubiquitina a la diana residuo Lys, un proceso que requiere un residuo de Cys del sitio activo. El miembro fundador de esta familia, Nedd4, recientemente se ha demostrado que se upregulated en el CCR y para promover la proliferación de células CRC
in vitro
, aunque el mecanismo sigue siendo poco clara [10]. Más allá de ese estudio, no se sabe nada acerca de los patrones de expresión de la familia Nedd4 en el CCR. Es de destacar que muchos de los miembros de la familia Nedd4 Se ha descubierto que las proteínas objetivo que son jugadores integrales en las vías que se consideran más importante en la génesis y progresión de la CRC.
En este estudio, hemos tratado de determinar la expresión del ARNm los niveles de cada uno de los nueve miembros de la familia Nedd4 en los tumores de una gran cohorte de individuos con neoplasia colorrectal. Hemos encontrado que
Nedd4
es el miembro más altamente regulada al alza de la familia. Sorprendentemente,
NEDD4L
, que comparte la mayor homología de secuencia con
Nedd4
, era el miembro más altamente regulados a la baja de la familia en el CCR. Se confirmó la regulación a la baja de NEDD4L a nivel de proteínas en muestras de CRC humanos. Recientemente, se demostró NEDD4L para degradar DVL2, inhibiendo así la señalización de Wnt, como se determina por la actividad de TOPFLASH reducida [11]. También se encontró que inhibe la actividad NEDD4L TOPflash en o por debajo del nivel de β-catenina. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que NEDD4L tiene el potencial de actuar como un supresor tumoral en el CCR.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todas las muestras utilizadas en humanos nuestro manuscrito se recogieron y analizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional de la Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, y Moffitt Cancer Center, Tampa, FL. Las muestras utilizadas en esta publicación se han descrito anteriormente [12], [13]. Se analizaron los datos resultantes de forma anónima.
muestra de tejido humano análisis de microarrays
Un total de 250 muestras de tejidos humanos CRC se recogieron en VUMC (N = 55) y MCC (N = 195). De estas muestras de CRC, 33 eran Etapa I (13,2%), 76 Etapa II (30,4%), 82 Etapa II (32,8%), y 59 de la etapa IV (23,6%). el tejido normal adyacente se recogió en MCC de diez de estos pacientes. De éstos, dos fueron recogidos desde la etapa I, cinco de la Etapa II, y tres de pacientes en estadio III. Otros seis adenomas adicionales se recogieron en MCC. Las muestras utilizadas en esta publicación se han descrito anteriormente [12], [13]. Se obtuvo ARN a partir de estos tejidos y se hibrida a la Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip gama de expresión. Se analizaron las siguientes sondas:
Nedd4 gratis (213012_at),
NEDD4L gratis (237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),
WWP1 gratis (212637_s_at, 212638_s_at),
WWP2 gratis (1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),
PICOR gratis (209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),
Smurf1 gratis (1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),
Smurf2 gratis (205596_s_at, 227489_at, 232020_at),
NEDL1 gratis (210331_at, 215584_at), y
NEDL2 gratis (232080_at, 243080_at). De las cuatro sondas específicas para
NEDD4L
, nos centramos nuestra atención en 212445_s_at ya que codifica una porción de la proteína traducida. Tres de las cuatro sondas NEDD4L se downregulated significativamente de una manera similar, mientras que uno (237498_at) se mantuvo sin cambios con la progresión.
Los pacientes en el grupo de VUMC tenían una mediana de seguimiento de 50,2 meses, con un seguimiento mínimo de 0,4 meses y un máximo de 111,3 meses. Los del grupo de MCC tenían una mediana de seguimiento de 44,7 meses, con un mínimo de 0,92 y un máximo de 142,8 meses. Todas estas muestras se recogieron y analizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por las juntas de revisión institucional, tanto en VUMC y MCC.
Análisis de transferencia Western
Se recogieron los tejidos normales y CRC muestras de mucosa colónica adyacentes a partir de 20 personas en la resección quirúrgica en VUMC y broche de congelados en nitrógeno líquido. Las muestras fueron luego lisadas en 8 M urea, se sonicaron y se centrifugaron a 14.000 rpm. Se retiró el sobrenadante, y la proteína cuantificó midiendo la absorbancia a 280 nm. Las muestras fueron entonces en un gel de poliacrilamida al 7,5% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se transfirieron con anticuerpos anti-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) y anti-α-tubulina (1:2000) (TUBA) (Calbiochem, San Diego, CA), y se detectaron usando HRP apropiado y conjugado con anticuerpos secundarios y el método de quimioluminiscencia. Las intensidades de las manchas se cuantificaron utilizando el software ImageJ, y se analizaron.
TOPflash ensayo
Las transfecciones se realizaron utilizando Metafectene (Biontex, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células HEK293 (2 × 10
5) se sembraron en una placa de 12 pocillos, dejó que se unieran, y se transfectaron al día siguiente con 0,1 g de cada plásmido. Se usaron los siguientes plásmidos: TOPflash plásmido reportero, el plásmido reportero FOPFLASH, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene plásmido 27000), y NEDD4L (C & gt; A) (Addgene plásmido 27001) [14]. Construcciones que contienen de tipo salvaje (wt) β-catenina y la β-catenina mutante (ΔN89) fueron un regalo de Ethan Lee de la Universidad de Vanderbilt. El día después de la transfección, se retiró el medio, y medio libre de suero que contenía 20 ng /ml de Wnt3a y 100 ml R-espondina /ng (Vanderbilt anticuerpo y la proteína de recursos compartidos) se añadió. El día siguiente, las células se lisaron y se procesaron de acuerdo con el kit de ensayo de luciferasa (Promega, Fitchburg, WI). TOPflash actividad se normalizó a la actividad FOPFLASH, y doblar la desactivación se determinó mediante la normalización de la actividad TOPflash y FOPFLASH en células no estimuladas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos tres veces.
NEDD4L knock-down
plásmidos lentiviral que contiene shRNA (Open Biosystems, Huntsville, AL) contra humana
NEDD4L
se transfectaron en células HEK293 utilizando Metafectene. , Se añadió el día siguiente al medio fresco. Al día siguiente el medio se filtró (0,45 micras filtros). Para infectar células RKO DLD-1 y 2,0 × 10
5 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, y se infectaron con el lentivirus. Después de dos días, se observó la expresión de GFP, y se seleccionaron las células infectadas con puromicina (5 mg /ml) y se clasifica para la expresión de GFP. Eficiencia de knock-down se determinó mediante Western Blot NEDD4L.
El análisis estadístico
Para comparar el nivel de expresión de cada sonda entre normal, adenoma, y las muestras de tejido de cáncer, la prueba de suma de rangos de Wilcoxon se utilizó [12], [13]. Para determinar los niveles de proteína relativos, los niveles de proteína NEDD4L se normalizaron a los niveles de la tuba, transformada-log, y se compararon mediante una prueba t pareada. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se llevó a cabo en el conjunto de datos de microarrays con el fin de determinar la supervivencia específica de la enfermedad. la supervivencia específica de la enfermedad se define como una muerte relacionada con el cáncer documentado [12]. Los niveles de significación en el experimento de ensayo indicador TOPflash se determinaron mediante la prueba t de Student.
Resultados
Los niveles de expresión de los miembros de la familia en Nedd4 CRC
Los nueve miembros de la Nedd4 familia de ubiquitina ligasas E3 son proteínas modulares (Figura 1). En su conjunto, se conoce la familia Nedd4 estar involucrado en la regulación de una serie de proteínas y las vías que son esenciales para el desarrollo de CRC. La Tabla 1 es una compilación de sustratos conocidos, las vías afectadas, y los niveles de expresión de señalización en varios tipos de cáncer de todos los miembros de la familia Nedd4. Existe una alta homología de secuencia entre los miembros de la familia, lo que explica los objetivos compartidos de muchos de los miembros de la familia. Sin embargo, también son ejemplos de diferentes miembros de la familia que tienen efectos opuestos sobre la misma vía de señalización. Por ejemplo, Nedd4 hace que la regulación a la baja de Smad1 y CBL, que inhibe la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) y activa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de señalización, respectivamente [15], [16]. Por otro lado, los impactos NEDD4L factor de crecimiento transformante-β (TGF) de señalización, pero no la señalización de BMP, a través de la degradación de SMAD 2 y 3 y el receptor de tipo I TGF, y abroga EGFR señalización a través de la degradación mediada por ubiquitina de CDC42 activado quinasa 1 (ACK1) [14], [17], [18]. Además, Nedd4 se ha demostrado que regular a la baja el supresor de tumores PTEN [19]. Sin embargo, se demostró Nedd4 para promover la proliferación de células CRC
in vitro
, independiente de un efecto sobre los niveles de PTEN [10].
Los nueve miembros de la familia Nedd4 son proteínas modulares. En su extremo N-terminal, cada uno tiene un dominio C2, que desempeña un papel en la localización celular apropiada. La porción central de cada proteína contiene de dos a cuatro dominios WW, que son responsables de reconocimiento de diana. dominios WW son 20 a 23 amino ácidos motivos, basados en Trp que reconocen motivos PY (PPxY, LPXY), así como algunos fosfo-Ser- o motivos basados en fosfo-Thr. En el extremo C-terminal es el dominio hect, que conjuga directamente un resto ubiquityl a la proteína diana. Los miembros de la familia se agrupan por su nombre y homología. Comezón es más estrechamente homólogas a WWP1 y 2 que a otros miembros de la familia.
Con el fin de determinar un posible papel de la familia Nedd4 en la iniciación o progresión de la CRC, sometimos 250 CRC muestras de pacientes tumorales de diferentes etapas, seis muestras de adenoma, y 10 muestras normales adyacentes a análisis de microarrays, observando cómo la expresión de cada miembro de la familia ha cambiado con la progresión (Figura 2A). Curiosamente, la pareja de cerca homóloga de
Nedd4
y
NEDD4L
estaban en oposición regulado (Figura 2B, C).
Nedd4 gratis (213012_at) han tendido al alza en la etapa de adenoma, pero fue significativamente elevado en la etapa 1 y CRC se mantuvo elevado significativamente durante la progresión tumoral. Por el contrario,
NEDD4L gratis (212445_s_at) disminuyó la expresión, tendencia a la baja en los adenomas, y disminuyó significativamente en todas las etapas del CRC (Figura 2C).
(A) La expresión de los nueve familia Nedd4 miembros se examinó en el CCR mediante microarrays de perfiles. Aquí se muestra el factor de cambio promedio de todas las sondas para cada gen individual en Nl (N = 10), Ad (N = 6), Ca1 (N = 33), Ca2 (N = 76), Ca3 (N = 82) y Ca4 (N = 59). (B)
Nedd4 gratis (213012_at) es el miembro más altamente upregulated de la familia Nedd4 en el CCR. (C)
NEDD4L gratis (212445_s_at) es el miembro más altamente regulados a la baja de la familia Nedd4 en el CCR. Nl = normal, Ad = adenoma, y Ca1-4 = CRC, en estadio I-IV. * P & lt;. 0,05
NEDD4L proteína se reduce en el CCR
A medida que los niveles de transcripción de un gen en particular no siempre se correlaciona con los niveles de proteína, se determinó a continuación si la disminución de
NEDD4L
niveles de ARNm dieron como resultado una disminución de la proteína NEDD4L. Para ello, se realizó un análisis de Western blot sobre la CRC humana y muestras de tejidos normales adyacentes de 20 pacientes utilizando tejido recogido en Vanderbilt University Medical Center (Figura 3A, B). Se observó una disminución significativa en los niveles de proteína NEDD4L (~42%) en CRC humano en comparación con el tejido normal, que concuerda con el análisis de microarrays.
niveles (A) NEDD4L se determinaron por Western Blot de CRC (Ca ) y normal) mucosa adyacente (Nl de veinte individuos. Los niveles se normalizaron a la tuba y Nl se comparó con Ca. NEDD4L se downregulated significativamente (~42%) en CRC (* p & lt; 0,05). Los datos se representan en formato de caja y bigotes parcela. Las líneas que conectan los puntos de datos muestran los niveles relativos en NEDD4L un par coincidente Nl-Ca dado. denota rojos disminución de los niveles de Ca NEDD4L, mientras que el negro indica un aumento. (B) Los lisados genera a partir de Nl-Ca igualada pares fueron borrados por NEDD4L y tuba. Aquí se presentan cuatro pares representativos.
A continuación trató de determinar si los niveles de expresión NEDD4L relacionan con la supervivencia específica de la enfermedad en nuestra cohorte de pacientes. Se comparó la supervivencia de los pacientes en el cuartil más alto de expresión NEDD4L con la de aquellos en el cuartil más bajo (Figura 4). Se encontró que los pacientes con la expresión más alta NEDD4L exhibieron un período de supervivencia específica de la enfermedad que los pacientes con los niveles de expresión más larga. Esta diferencia, sin embargo, no alcanzó significación estadística (p = 0,079).
la supervivencia específica de la enfermedad en pacientes con CCR la expresión más elevada y más baja NEDD4L se comparó con el análisis de Kaplan-Meier. Aquellos pacientes con muestras tumorales en el cuartil más alto de expresión NEDD4L mostraron una tendencia hacia una supervivencia específica de la enfermedad ya lo largo de un período de 60 meses. p = 0,079.
NEDD4L suprime canónica de señalización WNT
La disminución significativa en la expresión NEDD4L en CRC sugiere la posibilidad de que NEDD4L juega un papel supresor de tumor en el CCR. Dada la importancia de la señalización canónica a la iniciación y progresión del CRC WNT, se investigó si NEDD4L puede suprimir la señalización de Wnt canónica realizando el ensayo indicador TOPflash, que mide la actividad WNT canónica mediante la fusión de los elementos de respuesta TCF /LEF a un reportero de la luciferasa de luciérnaga. NEDD4L inhibió la actividad de TOPFLASH cuando la señalización de Wnt canónica se activó por la adición de Wnt3a y el coactivador, R-espondina (Figura 5A). La inhibición parece ser dependiente de la capacidad de NEDD4L a ubiquitylate proteínas diana, como la forma catalíticamente inactiva de NEDD4L, en la que el sitio activo Cys se mutó a un Ala [NEDD4L (C & gt; A)] no mostró inhibición de la actividad TOPflash ( Figura 5A) [20]. Estos resultados apoyan el hallazgo reciente de que NEDD4L inhibe la señalización de Wnt por ubiquitylating y la orientación DVL2 a la proteasoma para la degradación [11]. Sin embargo, también se encontró que NEDD4L inhibe la señalización de Wnt canónica cuando se utilizó (ΔN89) β-catenina en peso o mutante como un activador (Figura 5B), lo que sugiere NEDD4L suprime la señalización aguas abajo de DVL en presencia de APC mutante o CTNNB1 WNT.
(a) NEDD4L inhibe la actividad TOPflash en células HEK293 en comparación con el vector vacío (CTL) o catalíticamente inactiva NEDD4L [NEDD4L (C & gt; a)]. Wnt3a (20 ng /ml) y R-espondina (100 ng /ml) se utilizaron para activar la señalización de Wnt canónica. (B) Cuando dos construcciones de β-catenina diferentes, β-catenina (WT) y β-catenina (ΔN89), se utilizan para activar canónica de señalización una reducción significativa en la actividad de TOPFLASH se observó en la presencia de NEDD4L sobreexpresión, en comparación con WNT vector vacío o NEDD4L (C & gt; A). Todos los resultados se normalizan a la actividad FOPFLASH. * P & lt;.
0,05
Para ampliar este trabajo, se examinaron los efectos del crecimiento de derribar NEDD4L endógeno en dos líneas celulares de CRC humanos, DLD-1 y RKO. LDN-1 células contienen una mutación truncar en
APC
, mientras que las células RKO tienen ni una mutación en
APC
ni
CTNNB1
, pero que tienen una mutación de inactivación en
NKD1
, un regulador negativo de la señalización de WNT inducible [21]. Knock-down se verificó por transferencia de Western (~ 80%) (datos no mostrados). Se midió el crecimiento en el plástico, y en agar blando y el colágeno. No se observaron diferencias significativas en el crecimiento en células con NEDD4L knock-down comparación con los controles revueltos (datos no mostrados). Además, NEDD4L knock-down no tuvo efecto sobre el tamaño tumoral en xenoinjertos de ratones desnudos (datos no mostrados).
Discusión
El presente estudio se realizó para empezar a entender si hay un papel para miembros de la familia de Nedd4 E3 ubiquitina ligasas de CRC. Nueve miembros comprenden esta familia, y cada uno ha demostrado su impacto en al menos una de las vías celulares centrales para la iniciación y progresión de la CRC. Varios miembros se han demostrado para ser dysregulated en un número de diferentes tipos de cáncer. Sin embargo, una evaluación sistemática de los niveles de expresión de todos los miembros de la familia humana en el CCR no ha sido previamente realizado. En particular,
Nedd4
la expresión de ARNm fue recientemente demostrado ser upregulated en el CCR, pero este análisis no tuvo en cuenta la etapa de la CRC, o se encuentran los adenomas [10]. Nos pareció que el primer paso para empezar a entender esta familia de E3 en el CCR fue examinar los niveles de expresión de cada miembro de la familia en los CRC a partir de una gran cohorte de pacientes. Hemos elegido para llevar a cabo nuestro análisis en todas las etapas, incluyendo adenomas, ya que hay comúnmente alteraciones en vías similares en puntos similares durante la progresión del CCR [2]. Algunas de estas vías tienen diferentes funciones en las diferentes etapas. Por ejemplo, la vía TGF es un supresor tumoral temprano en CRC, pero promueve la progresión y metástasis más tarde [22].
En este documento, se evaluó la forma en la expresión de cada miembro de la familia Nedd4 cambios con la progresión de adenoma a la etapa IV CRC. El miembro de la familia más altamente upregulated fue
Nedd4
, de acuerdo con los hallazgos mencionados anteriormente [10]. Vamos a demostrar que la regulación al alza se produce a principios de CRC (etapa I), y la regulación positiva se mantiene durante la progresión. El miembro de la familia más altamente regulados a la baja en nuestro conjunto de datos fue
NEDD4L
. Encontramos este sorprendente dado que NEDD4L comparte la mayor homología de secuencia con Nedd4, y se ha demostrado que tienen un solapamiento significativo con Nedd4 en la selección de objetivos [7]. Recientemente, se han mostrado los niveles de proteína NEDD4L ser regulados a la baja en el cáncer gástrico, y aquellos pacientes con la menor expresión mediante análisis inmunohistoquímico tenido un peor pronóstico [23]. NEDD4L También se ha encontrado que tanto upregulated y downregulated en cáncer de próstata, el aumento en las células de cáncer de vesícula biliar invasoras, y downregulated en gliomas malignos más agresivos [24] - [27]. Estos resultados dispares no son inesperados, dado el número de objetivos y vías de señalización celular sobre los cuales se ha encontrado NEDD4L para actuar.
Un informe reciente mostró que NEDD4L inhibe tanto las vías de señalización Wnt canónica y no canónica por ubiquitylating DVL2 y la orientación a la proteasoma para su destrucción [11]. Aquí, se encontró que NEDD4L también puede inhibir la señalización de Wnt canónica a nivel de, o aguas abajo de, β-catenina. Esto está en contraste con el papel antes mencionado, en el que los investigadores mostraron que NEDD4L no podía inhibir TOPflash cuando la señalización se activó por un mutante β-catenina (S37A). En su estudio, se utilizó isoforma 2 de NEDD4L (NM_001144964.1), mientras que se utilizó una isoforma NEDD4L diferente (KIAA00439). Estos dos ADNc difieren en su N-terminal; el constructo utilizado en nuestro estudio tiene un 141 residuos de aminoácidos adicionales en la inmediata N-terminal, que se modifica el dominio C2, y 20 menos residuos en un segmento que preceden a la segunda dominio WW. Esto podría contribuir a la localización diferencial o sustrato de orientación. Además, se ensayaron diferentes construcciones de β-catenina; se utilizó en peso y mutante β-catenina (ΔN89), y, en el informe anterior, se utilizó β-catenina (S37A).
Hemos encontrado que la anulación de la expresión endógena de
NEDD4L
en dos líneas de CRC no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento. Esto podría ser debido al hecho de que estas líneas celulares ya han desarrollado un mecanismo para superar los efectos inhibidores de crecimiento de NEDD4L, o que las células ya han logrado una reducción endógena en la expresión NEDD4L a un nivel por debajo de la necesaria para la inhibición del crecimiento. Los estudios futuros se ocupará de esta mediante la sobreexpresión de peso NEDD4L en una serie de líneas de CRC. En última instancia, puede ser necesaria la creación de un modelo de ratón en el que se golpea NEDD4L de salida temprana en el proceso de tumorigénesis.
En conclusión, hemos examinado la expresión del ARNm de la familia Nedd4 de ubiquitina ligasas E3 en un gran cohorte de individuos con neoplasia colorrectal. El miembro más altamente upregulated es
Nedd4
, que se ha demostrado previamente para aumentar la proliferación de las células humanas CRC
in vitro
[10]. El miembro más altamente regulados a la baja es
NEDD4L
. De acuerdo con los resultados anteriores, NEDD4L sobreexpresión en células HEK293 inhibe la señalización Wnt canónica [11]. Aquí, también muestran que NEDD4L inhibe la señalización de Wnt en o aguas abajo de β-catenina, que es importante en el contexto de la mutación de activación más común en la señalización de WNT canónica que se encuentran en CRC. Por lo tanto, proponemos que NEDD4L puede actuar como un supresor de tumores en el CCR mediante la inhibición de la señalización de Wnt canónica.
Reconocimientos
Los autores desean reconocer Bruce Aronow, Dan Ayers, Tim Yeatman, y Josh Smith por su ayuda en el análisis de datos, y Jim Higginbotham por su ayuda con la clasificación de flujo. Los autores también agradecen a Emily Poulin por su asistencia editorial.